Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 8
Глава I. Физико-химические свойства природных целлюл030с0держащих субстратов 8
1.1. Строение клеточных стенок растений 8
1.2. Физико-химические факторы субстрата, влияющие на его утилизацию микроорганизмами , 15
1.3. Способы предварительной обработки природных целлюлозосодержащих субстратов 25
Глава II. Микробиологическая деградация природных целлюлозосодержащих субстратов 34
2.1. Целлюлозоразлагающие микроорганизмы . 34
2.2. Механизм ферментативного гидролиза целлюлозы , 37
2.3. Регуляция биосинтеза целлюлаз 41
II. Экспериментальная часть 44
Глава 3. Материалы и методы ... 44
3.1. Объект исследования 44
3.2. Методы определения ферментативных активностей 46
3.3. Дезинтеграция клеток 48
3.4. Определение адсорбции целлюлаз на поверхности соломы 48
3.5. Определение биомассы гриба 49
3.6. Аналитические методы 49
3.7. Электронномикроскопические исследования 50
3.8. Цитохимические исследования 52
Глава 4 . Ультраструктурные перестройки поверхности гриба a, terrene при росте на разных субстратах 54
4.1. Цитохимическое изучение природы экзоцеллюлярного слоя 57
4.2. Ультраструктурные перестройки клеточной стенки A.terreus I7P в зависимости от природы утилизируемого субстрата 59
4.3. Ультраструктурные перестройки клеточной стенки A. terreus I7P в зависимости от фаз роста при его выращивании на глюкозе и соломе 62
4.4. Электронномикроскопическое выявление локализации целлюлаз на поверхности мицелия a, terreus 66
Глава 5 . Изучение рож и вжяния контактного взаимодействия между клетками и субстратом 82
5.1. Разработка модели для изучения контактного взаимодействия 82
5.2. Сравнительная оценка процессов деградации субстрата, продукции целлюлаз и накопления биомассы продуцента при росте в условиях контакта и без контакта клеток с субстратом 85
5.3. Влияние расстояния между клетками и субстратом при бесконтактном выращивании на процессы деградации субстрата, продукцию целлюлаз и накопление биомассы 91
Глава 6 . Влияние дисперсності частиц соломы на целлюлолитическую активность и рост гриба a.terrene 95
6.1. Гранулометрический анализ соломы, измельченной в аппарате УДА-Л 95
6.2. Влияние дисперсности частиц соломы на внеклеточную целлюлолитическую активность Гриба A.terreus 102
6.3. Накопление биОМаССЫ Гриба A.terreus при выращивании его на соломе различной дисперсности частиц 107
6.4. Утилизация соломы Грибом A.terreus
6.5. Исследование структурных изменений соломы до и после выращивания a.terreus .. 122
Заключение 125
Выводы 131
Литература 133'
- Строение клеточных стенок растений
- Способы предварительной обработки природных целлюлозосодержащих субстратов
- Механизм ферментативного гидролиза целлюлозы
- Ультраструктурные перестройки клеточной стенки A. terreus I7P в зависимости от фаз роста при его выращивании на глюкозе и соломе
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время ведутся интенсивные поиски новых доступных субстратов для получения микробного белка. Весьма перспективным для этой цели является использование растительного сырья, в состав которого входит высокомолекулярный полимер глюкозы - целлюлоза, а также ге-мицеллюлозы, лигнин, пектиновые вещества. Ценность растительного сырья, как субстрата для получения микробного белка, заключается в его возобновляемости и относительной дешевизне; в качестве субстрата для получения биомассы можно использовать отходы деревообрабатывающей целлюлозно-бумажной, легкой и пищевой промышленности, сельского хозяйства. Однако целлюлоза, содержащаяся в растительных материалах, является трудноусвояемым для микроорганизмов соединением. Высокая устойчивость целлюлозы в растительном сырье обусловлена наличием в нем механического барьера для действия ферментов -лигнина и высокоупорядоченной кристаллической структурой самой целлюлозы. Для повышения доступности целлюлозы к микробному воздействию применяют различные способы предварительной обработки целлюлозосодержащих (ЦС) субстратов, в том числе и механические, способствующие разрушению кристаллической структуры целлюлозы и уменьшению размеров частиц. И хотя механическая обработка и измельчение ЦС субстрата являются обычными подготовительными процедурами, вопрос о влиянии этих воздействий на микробиологическую доступность субстрата и на характер взаимодействия микроорганизмов с его частицами до последнего времени оставался практически неизученным.
Цель работы: выяснить, как влияет уменьшение размеров частиц природного ЦС субстрата - соломы на ее утилизацию грибом Aspergillus terreus I7P, накопление биомассы гриба и продукцию ферментов целлюлолитического комплекса.
Основные задачи. I. Изучить особенности взаимодействия клеток гриба a.terreus I7P с частицами нерастворимого ЦС субстрата.
Выяснить, как влияет наличие контакта между клетками и ЦС субстратом на продукцию целлюлаз и рост гриба.
Выявить локализацию целлюлаз гриба a.terreus I7P.
Количественно определить влияние дисперсности частиц ЦС субстрата на накопление микробной биомассы гриба a.terreus I7P, деградацию субстрата и продукцию целлюлаз.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование ультраструктурных и физиологических особенностей гриба, растущего на нерастворимом ЦС субстрате, в зависимости от дисперсности его частиц. Показано, что клетки гриба a,terreus I7P при выращивании на нерастворимом субстрате в логарифмической фазе роста формируют внеклеточный полисахаридный слой, способный сорбировать (ишлобилизовать) ферменты целлюлолитического комплекса.
Установлено, что мелкодисперсные частицы нерастворимого субстрата сорбируются на поверхности гриба и при этом рост гриба и деградация субстрата осуществляются при непосредственном контакте гриба с субстратом. Используя разработанную нами модель для выращивания клеток в условиях контактного и бесконтактного взаимодействия с субстратом, было показано, что наиболее благоприятным условием для роста
гриба является его выращивание на мелкодисперсном ЦС субстрате, способном адсорбироваться на поверхности гриба.
Установлено, что с уменьшением размеров частиц субстрата увеличиваются целлюлазная и ксиланазная активности, экскретируемые клетками гриба, что связано с повышенным накоплением биомассы на более доступном мелкодисперсном субстрате.
Практическая ценность работы. Предложен эффективный способ механической обработки твердого ЦС субстрата для получения частиц высокой дисперсности. Результаты, полученные при изучении влияния размеров частиц субстрата на продукцию целлюлаз и накопление биомассы гриба, могут быть использованы для оптимизации и интенсификации микробиологических процессов получения микробного белка и ферментов целлюлолити-ческого комплекса. Показано, что прорастание гриба в частицы субстрата неблагоприятно влияет на рост гриба. Более эффективным для роста является случай, когда контакт субстрата с грибом осуществляется путем адсорбции его частиц на поверхности грибной клетки. Разработанную нами модель для выращивания гриба на нерастворимых ЦС субстратах (в контакте и без контакта с субстратом) можно рекомендовать для практического использования при изучении процессов взаимодействия микроорганизмов с твердыми субстратами иной природы.
Строение клеточных стенок растений
Целлюлоза является наиболее распространенным в природе углеводом. Она входит в состав клеточных стенок растений, придает ригидность клеточным тканям. Стенка растительной клетки представляет собой двухфазную систему, состоящую из кристаллической скелетной фазы и аморфной фазы, содержащей так называемые инкрустирующие вещества (Престон, 1965). Различают первичную и вторичную клеточную стенку (рис. I). Содержание целлюлозы в первичной оболочке незначительно и варьирует от 2.5 до IZ% (Фрей-Вис-слинг, 1965).
Вторичная клеточная стенка состоит главным образом из целлюлозы, может иметь трехслойное строение: s ,s2,s_ (рис. I). Молекулы целлюлозы в слое s2 располагаются параллельно оси, образуя концентрические зоны, количество которых коррелирует С ПрОДОЛЖИТеЛЬНОСТЬЮ рОСТа фибрИЛЛЫ ( Cowling, Kirk, 1976; cowling, 1975), поэтому толщина s2 слоя варьирует. Предполагается, что именно этот слой является наиболее доступным ДЛЯ ДеЙСТВИЯ ЦЄЛЛЮЛаЗ (Knapp, Howell, 1980). Химически целлюлоза представляет собой высокомолекулярный полимер глюкозы. Степень полимеризации цепи колеблется в широких пределах: от 500 у фильтровальной бумаги до 10 000
Глюкозные единицы находятся в конформации кресла, все 0Н-группы лежат в экваториальной плоскости и способны образовывать водородные связи с соседними цепями. Эта особенность вместе с жесткостью конформации, обусловленной в-конфигурацией, определяет способность целлюлозы к формированию прочных ВОЛОКОН (Fan et at., 1980 а).
Целлюлозные молекулы связываются водородной связью между собой и образуют элементарную фибриллу или протофибриллу. Показано, что водородная связь возникает между третьей гидро-ксильной группой одной молекулы и атомом кислорода кольца соседней молекулы (.sihtoia, Neimo, 1975). В результате образуется упорядоченная кристаллическая структура. Каждая элементарная фибрилла содержит до 100 целлюлозных молекул. Она состоит из чередующихся кристаллических и аморфных участков. Соотношение этих участков колеблется в разных материалах. В таблице I приведены данные о степени кристалличности некоторых целлюлозосодержащих субстратов,
Протофибриллы имеют размер 40 х 30 х 100 А и являются наименьшей структурной единицей микрофибриллы (Fan et at., 1980 а). Внешняя часть микрофибрилл имеет паракристалличес-кое строение (cowling, 1975; Fan et at,, 1980 а; Престон, 1965). Существование паракристаллической области связано с уменьшением плотности упаковки полисахаридных цепей, обуслов - II ленной присутствием здесь наряду с глюкозой остатков и дру о гих Сахаров (Ranby, 1969). Количество целлюлозных молекул
Множество микрофибрилл объединяются и образуют макрофибриллы. Целлюлозные протофибриллы погружены в матрикс, состоящий из инкрустирующих веществ. Благодаря этому между элементарными фибриллами в микрофибриллах, а также между микрофибриллами в макрофибриллах имеются промежутки. Таким образом, фибриллярная система целлюлозы разделена системой капилляров различного размера (Эсау, 1969). Капилляры имеют диаметры порядка нескольких ангстрем и достигают максимальных значений при набухании (cowling, Brown, 1969). Те же авторы изучили распределение капилляров по диаметру в набухшей древесине, хлопке и в древесной пульпе. Средние и мак - 12 о симальные значения в трех случаях соответственно были: 5 Адиаметров в последнем случае можно объяснить удалением лигнина и гемицеллюлоэы из клеточных стенок при получении пульпы ( Fan et ai., 1980 ь). От размеров микрокапилляров клеточной стенки растений в значительной степени зависит величина поверхности, доступной для действия целлюлаз.
В состав матрикса, в который погружены протофибриллы, входят гемицеллюлоза и лигнин. В древесине гемицеллюлозы представляют собой разветвленные гетерополимеры глюкозы, ксилозы, галактозы, маннозы, арабинозы, а также уроновых кислот глюкозы и галактозы, связанных 1-3, 1-6, 1-4 глкжо-зидными связями (cowling, 1975; Мецлер, 1980). Степень полимеризации гемицеллюлоз редко превышает 200.
Межклеточное вещество состоит главным образом из пектина. Пектиновые вещества близкородственны гемицеллюлозам, оптически анизотропны. Это - аморфные коллоидные вещества, пластичные и в высшей степени гидрофильные. Они относятся к полиуронидам, т.е. полимерам, состоящим в основном из уроновых кислот, и встречаются в трех формах: протопектин, пектин и пектоновая кислота. Из пектиновых веществ состоит не только срединная пластинка, они находятся также в связанном с целлюлозой состоянии и в других слоях оболочки.
Важнейшим компонентом инкрустирующего вещества является лигнин. Это - один из наиболее распространенных растительных продуктов, количественно уступающий лишь целлюлозе. Лигнин характеризуется жесткостью, пропитывает клеточную оболочку ПОСЛе Завершения Первоначальных фаз раЗВИТИЯ ( Linden et at., 1980), входит в состав всех трех слоев клеточной оболочки -срединной пластинки, первичной и вторичной клеточной стенки ( cowling, 1961). Это вещество является упорядоченным полимером, состоящим из повторяющихся единиц фенилпропаноидных спиртов (Головлева, Ганбаров, 1982), имеет молекулярный вес примерно 10 000. Показано, что гололигнин древесины представляет из себя смесь высокомолекулярного лигнина и низкомолекулярного ГеМИЛИГНИНа (Forss, Fremer, 1975). Лигнин и гемилиг-нин отличаются по реактивности. Гемилигнин сульфонирован, для его выделения нет необходимости в предварительном гидролизе, в то время как для выделения лигнина необходим гидролиз и фрагментация макромолекул (porss, Fremer, 1975).
Лигнин и аморфные участки целлюлозы представляют собой взаимопроникающую систему высокомолекулярных полимеров, причем ковалентные связи образуются только между лигнином и ге-мицеллюлозой (Fan et at., 1980 а, ъ). Природа связи лигнина с целлюлозой пока еще точно не установлена, и в настоящее время принято считать, что эта связь главным образом имеет физическую природу (Fan et al., 1980 а).
Среди других веществ, входящих в состав клеточных стенок растений, можно отметить липидные компоненты: кутин, суберин, воска (Эсау, 1969), а также кремнезем, также придающий ригидность растительным тканям. Содержание последнего в соломе может доходить до 15% ( Нап,1978).
Способы предварительной обработки природных целлюлозосодержащих субстратов
Природные целлюлозосодержащие субстраты обладают высокой резистентностью к ферментативной и микробиологической деградации. Резистентность обусловлена как высокоупорядочен-ной структурой целлюлозы в элементарных фибриллах, так и тесной связью с лигнином, играющим роль физического барьера и ингибитора целлюлаз ( Miiiett et al., 1975). Реактивность лиг-ноцеллюлозных материалов можно увеличить различными способами обработки. Конечной целью любой обработки является увеличение площади доступной поверхности. Этого можно достигнуть: а) уменьшением размеров частиц субстрата; б) делигнификацией; в) изменением кристалличности; г) набуханием целлюлозных волокон; д) модификацией лигнин-целлюлозной СВЯЗИ (Stone et at., 1969). Способы предварительной обработки лигноцеллюлозных материалов можно разделить на две группы: физические и химические.
Различают механические и немеханические способы физической обработки (Fan et al., 1981). К механическим относятся различные способы измельчения: на шаровой и вибромельнице, мельницах ударного типа, коллоидное измельчение, экструзионное измельчение, криомельницы. К немеханическим относятся: облучение, пиролиз, обработка паром. В первом случае происходит деполимеризация субстрата, разрыв лигноуглеводной связи, во втором случае наряду с деполимеризацией происходит окисление и обезвоживание субстрата, в третьем - набухание.
Основной эффект физической обработки заключается в понижении индекса кристалличности, приводящем к увеличению поверхности, доступной для действия ферментов. При химической обработке происходит структурная модификация и делигнификация субстрата. Традиционным способом химической обработки является обработка щелочью. Основной эффект при действии гидроокиси натрия заключается в делигнификации и набухании субстрата (тоу-ama, Ogawa, 1972). Показано, что при обработке пшеничной соломы 1%-ным NaOH при комнатной температуре в течение 2 часов солома теряет 8.6% лигнина (Fan et al., 1981). Делигнификация проходит более эффективно, если ту же обработку проводить в условиях автоклавирования. При автоклавировании в щелочной среде при температуре 129С и давлении 2.57 атм за тот же промежуток времени потеря лигнина составляла 43.5% (Fan et al., 1981). Исследование структуры соломы методом сканирующей электронной микроскопии показало, что при такой обработке происходит набухание субстрата, разрушение малых проводящих пучков (Fan et al., 1981). Предполагается, что при обработке гидро -27 окисью натрия происходит разрыв сложноэфирных лигноуглевод-ных связей, а с уменьшением поперечных связей возрастает субмикроскопическая капиллярность и степень набухания (Эриньш, Каткевич, 1982).
При набухании целлюлозы значительно увеличивается поверхность, доступная для действия целлюлаз, за счет увеличения расстояния между протофибриллами и изменения кристаллической структуры целлюлозы (Millett et al., 1976). Происходит структурный переход от целлюлозы I к целлюлозе II. В целлюлозе II расстояние между соседними цепочками больше, что позволяет ферментам ПрОНИКать внутрь крИСТаЛЛИЧеСКОЙ решеТКИ (Tarkow, Feist, 1969; Sihtola, Neimo, 1975). Исследовалась глубина гидролиза, а также усвояемость субстрата после щелочной обработки. Мандельс с соавторами наблюдали значительное увеличение ферментативного гидролиза цеЛЛЮЛОЗЫ ГазеТНОЙ бумаги ПОСЛе Обработки 2%-НОЙ NaOH (мап deis et al., 1974). При делигнификации соломы щелочью (2%-ной NaOH ) ЄЄ Осахаривание увеличивалось ОТ 18.6% ДО 70% (Guptaet с 1981). Более эффективно на этот процесс действует обработка при высокой температуре в условиях автоклавирования. Каткевич Ю.Ю. с соавторами показали, что солома, автоклавирован-ная при 120 в течение 30 мин в присутствии 1% ыаон при ферментативном гидролизе образует; в растворе 81% репродуцирующих Сахаров в случае пшеничной соломы и 66% в случае соломы ячменя (Каткевич и др., 1980). Анализ химического состава соломы показал, что после обработки содержание лигнина уменьшилось от 17.4% до 2.3%. При выращивании микроорганизмов на субстрате, обработан -28 ном щелочью, увеличивается усвояемость субстрата. Например, при выращивании бактерий рода celiuiomonas на рисовой соломе, обработанной в течение 15 мин 4%-ной гидроокисью натрия при 100, утилизация углеводов возрастала с 29% до 73% (Han, caiiihan,I974). В другой работе обработку проводили 0.3% - 1% ыаон при комнатной температуре в течение часа; при Выращивании Tvichodevma viride ВМЄСТЄ С Candida utilis лучший рост наблюдали после обработки 0.3% NaOH с последующей отмывкой субстрата водой ( Nesse et al.3 1977). При выращивании Chaetomium celluloliticum на субстрате, обработанном ыаон при 120 в течение 30 мин. гриб утилизировал 44% субстрата, причем белок в смеси гриба и остатка субстрата составлял 11% (Chahal et al., 1981). УВЄЛИЧЄНИЄ Концентрации NaOH до 10% без автоклавирования приводил к увеличению белка в конечном продукте до 17.5%.
Механизм ферментативного гидролиза целлюлозы
Гидролиз кристаллической целлюлозы осуществляется комплексом ферментов гидролитического действия. Внеклеточные целлюлазы одних микроорганизмов способны гидролизовать кристаллическую целлюлозу, других - только ее производные, одни микроорганизмы способны расти на всех видах целлюлозы, другие утилизируют лишь растворимые производные (Reese, 1975). На основании этих различий Риз с соавторами выдвинули Сj - С гипотезу, согласно которой ферментативный гидролиз кристаллической целлюлозы представляется двухстадийным процессом (Reese et al., 1950). На первой стадии под действием Су происходит "активирование" целлюлозы, заключающееся в амор-физации целлюлозных волокон. Индекс I означает, что эта компонента первой начинает атаку. Затем под действием С. пред-ставленной несколькими ферментами, происходит гидролиз целлюлозной цепочки. Таким образом, разрушение целлюлозы проходит по следующей схеме: С С кристаллическая I аморфная х растворимый целлюлоза целлюлоза продукт БЫЛО ПОКазанО, ЧТО Ст фактор ЯВЛЯетСЯ беЛКОМ (Mandels, Reese, 1964).
Предполагалось, что Ст, связываясь с целлюлозной молекулой, вызывает релаксацию внутримолекулярных водородных СВЯЗеЙ И разрушает Кристаллическую Структуру (Mandels, Reese, 1964). Исследования структуры целлюлозы до и после действия Сj фактора, проведенные методами рентгеноструктурного анализа и инфракрасной спектроскопии, не выявили никаких изменений (wood, 1975). Из различных источников были выделены и очищены все компоненты целлюлолитического комплекса (wood, 1969, 1975; Wood, McCray, 1975; Li et al., 1965; Selby, 1969; Ogawa To yama(i965, 1968; Тиунова и др., 1972 и др.).
Исследование Ст компоненты из различных источников показало, что Ст является гидролитическим ферментом концевого действия - цел-ЛОбиОГИДролазоЙ (Selby, Maitland, 1967; Wood, McCray, 1972; wood, 1968, 1969; selby, 1969 и др.). При фракционировании получались три функционально различающиеся группы: эндоглюканазы, гидролизующие растворимую целлюлозу (С ), целлобио Л. гидролазы (Cj) и в-глюкозидазы, гидролизующие короткие оли-госахариды. Каждая из компонент была неактивной по отношению к кристаллической целлюлозе, однако при совместном действии они проявляли синергизм, эффективно гидролизовали хлопок.
Высказывалось множество предположений, объясняющих синергизм между компонентами целлюлолитического комплекса. Был замечен перекрестный синергизм между Ст из одного источника и С из другого (selby, 1969). Исходя из этого, л. синергизм объяснялся кооперативным действием Ст и С . С беспорядочно гидролизует целлюлозную цепочку, однако из-за ригидности структуры связь восстанавливается; в присутствии целлобиогидролаз этот процесс предотвращается, так как концы удаляются друг от друга при удалении целлобиозных единиц ( Eriksson,1969; Berghem, Pettersson, 1975; Halliwell, 1975).
Это предположение экспериментально не подтвердилось, поскольку выяснилось, что не все эндоглюканазы могут кооперировать с Сj ( Goksyr, 1975). - 39 Другие авторы предполагают, что первым атаку начинают эндоглюканазы, связывающиеся путем белок-белкового взаимодействия вместе с целлобиогидролазами с образованием на поверхности целлюлозы комплекса ( wood, мссгау, 1975; Wood, 1978, 1980). Однако эксперименты показали, что на адсорбцию целлобиогидролаз не влияет адсорбция эндоглюканаз.
Японские исследователи фракционировали целлюлазный комплекс "Meiceiase р" и показали, что все фракции обладают как Ст, так и С активностью, однако часть из них действовала неупорядоченным образом, другая часть обладала большей способностью К упорядоченному КОНЦевОМу деЙСТВИЮ (Nisisawa et at., 1979; Nisizawa, 1973). Гидролиз упорядоченной целлюлозы происходит при совместном действии нескольких эндоглюканаз, различающихся по упорядоченности действия на ЫаКМЦ.
Ультраструктурные перестройки клеточной стенки A. terreus I7P в зависимости от фаз роста при его выращивании на глюкозе и соломе
Как было показано выше, в логарифмической фазе роста клетки, выращенные в среде с соломой, характеризуются нали - 63 . Поверхность гриба A.terreus I7P при выращивании на соломе (а - просвечивающая э/м, б - позитивный контраст, в - сканирующая э/м, г - ультратонкий срез) и в среде с 1.5% кукурузным экстрактом (ультратонкий срез). - 64 чием экзоцеллюлярного слоя, в отличие от клеток, выращенных в среде с глюкозой. В связи с этим важно было выяснить, связано ли появление экзоцеллюлярного слоя исключительно с природой утилизируемого субстрата и не влияет ли на этот процесс физиологическое состояние культуры. С этой целью мы провели ультраструктурные исследования поверхности клеток A.tevreus 17Р, выращенных на глюкозе и соломе и находящихся в различных фазах роста. Для культуры, выращенной на соломе, пробы брали через 5 часов роста, что соответствовало фазе ускорения роста и через 70 часов выращивания - фазе отмирания. Клетки, выращенные на глюкозе, брали после 24 часов роста (стационарная фаза роста). Как показали полученные результаты, при выращивании в среде, содержащей нерастворимый субстрат, появление внеклеточного слоя отмечается уже в фазе ускорения роста популяции (рис. 8 б). В фазе отмирания клетки частично лишаются экзоцеллюлярного слоя: на рисунке 8в показан участок мицелия, частично лишенного внеклеточного слоя, легко отстающего от клеточной стенки. Возможно, это является результатом автолитических процессов, происходящих в культуре в фазе отмирания. При выращивании на глюкозе внеклеточный слой возникает в стационарной фазе роста. На рис. 8а показан ультратонкий срез мицелия после 24 часов роста культуры на глюкозе. По сравнению с предыдущим случаем, внеклеточный слой здесь слабо развит, имеет очень плотную структуру, фибриллярность материала слабо заметна, характерное сетчатое строение отсутствует. Рис. 8. Ультратонкий срез мицелия A.terreus I7P при выращи-вании на (а) глюкозе (24 часа роста) и соломе (б -5 часов роста, в - 72 часа роста).
Исходя из полученных данных можно сделать вывод о том, что отсутствие экзоцеллюлярного материала связано с репрессией синтеза внеклеточных полисахаридов легкодоступным углеводным субстратом. При низких концентрациях растворимого углеводного субстрата создаются условия для формирования внеклеточного слоя, что также подтверждается его появлением на стационарной фазе роста на среде с глюкозой по мере ее исчерпания. Электронномикроскопическое выявление локализации целлюлаз на поверхности
Для гидролиза высокомолекулярных полимерных соединений микроорганизмы обычно секретируют внеклеточные ферменты, которые могут либо выделяться в среду, либо связываться с внешней поверхностью клеточной стенки. Ранее в работе Исма-иловой Д.Ю. и др. (Исмаилова и др., 1976) было показано, что высокая целлюлолитическая активность связана с фракцией, слабо связанной с клеточной стенкой. Исходя из наших данных, мы предположили, что связь целлюлаз с клеточной поверхностью осуществляется посредством внеклеточного слоя. Для проверки этого предположения мы провели электронномикроскопическое выявление локализации целлюлаз на поверхности мицелия A.ter-reus 17Р в следующих вариантах: а) Клетки, выращенные на соломе (в этом случае клетки обладали и целлюлолитической активностью и внеклеточным слоем); б) Клетки, выращенные на ыакмц и взятые в логарифмичес - 67 кой фазе роста (клетки обладали целлюлолитической активностью, но не имели внеклеточного слоя). в) Клетки, выращенные на глюкозе, взятые в логарифмичес кой фазе роста (они не обладали целлюлолитической активно стью и внеклеточным слоем); г) Клетки, выращенные на глюкозе и взятые в стационарной фазе роста (они обладали внеклеточньм слоем, но не обладали целлюлолитической активностью). Следует отметить, что использованный нами метод позволяет в данном случае выявить лишь активность, связанную с внешней поверхностью клеточной стенки, поскольку субстрат для выявления целлюлаз (ыакмц ) в клетку не проникает. Наличие продуктов реакции внутри клеток может быть результатом неспецифической реакции внутриклеточных редуцирующих веществ с реактивом Бенедикта.
На рисунке 9а показан: ультратонкий срез клетки, выращенной на ыакмц, после цитохимической реакции. Как видно из этих рисунков, на поверхности клеточной стенки продукт реакции не обнаруживается. То же самое можно сказать о клетках, выращенных на глюкозе (рис. 96, 106). В случае клеток, выращенных на соломе (рис. 10 а), целлюлолитическая активность выявлялась на внеклеточном полисахаридном слое. Продукт реакции - окись меди - специфически связывается с веществом внеклеточного слоя.
