Введение к работе
Актуальность темы
Одной из важных задач современной онкологии и фармакологии является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остается открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм.
Главными мишенями действия таких лекарственных средств должны являться специфические компоненты раковых клеток, необходимые для их существования и размножения. В нормальных соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный постепенным укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления. Раковые клетки обладают способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности (неограниченного репликативного потенциала). Приобретение иммортальности клетками опухолей напрямую связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение теломер, происходящее в процессе каждого деления клетки. Теломеразная активность (ТА) обнаруживается почти во всех типах злокачественных опухолей человека, в то время как в большинстве нормальных тканей она практически не детектируется. Именно поэтому теломераза рассматривается как уникальный маркер опухолевого роста, а также как перспективная мишень для действия лекарственных препаратов.
Особую группу соединений, исследуемых в настоящее время в
качестве потенциальных ингибиторов теломеразы, представляют
антисмысловые олигонуклеотиды. В отличие от обычной стратегии,
где антисмысловые олигоігуклеотидьі подавляют экспрессию
определенного гена, ингибирование теломеразы основано на
непосредственном блокировании функции фермента
олигонуклеотидами, комплементарными его РНК-компоненту (hTR). Для защиты антисмысловых олигонуклеотидов от деградации, вызываемой действием нуклеаз, при введении в организм применяют методы их химической модификации. На протяжении последних десяти лет активно изучаются механизмы действия и степень влияния на теломеразу модифицированных РНК- и ДНК-олигонуклеотидов, в число которых входят фосфоротиоатные (PS), фосфорамидатные
олигонуклеотиды (NP), пептидно-нуклеиновые кислоты (PNA), а также 2'-0-алкилированные РНК-олигонуклеотиды.
Цель работы
Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных матричному участку РНК-компонента теломеразы, а также олигонуклеотидов, состоящих из теломерных повторов, на теломеразную активность in vitro и оценке их возможного использования в качестве эффективных ингибиторов роста опухолевых клеток.
Задачи исследования:
-
Изучить эффективность ингибирования теломеразной активности модифицированными ДНК- и РНК-олигонуклеотидами в экстрактах, полученных из клеток опухолевых линий, а также из клинического материала от пациентов с различными онкопатологиями.
-
Проанализировать влияние исследуемых ДНК- и РНК-олигонуклеотидов на рост и выживаемость опухолевых клеток in vitro.
-
Определить характер действия рассматриваемых олигонуклеотидов на стадии клеточного цикла и апоптоз.
-
Исследовать динамику накопления и локализацию модифицированных олигонуклеотидов внутри опухолевых клеток методом конфокальной микроскопии.
Научная новизна работы:
-
Впервые показана возможность применения фосфоротиоатных олигонуклеотидов для ингибирования теломеразной активности в лизатах клеток трех типов онкопатологий (рак желудка, рак простаты, рак щитовидной железы).
-
В результате проведенного исследования выявлены два соединения, способные подавлять рост опухолевых клеток с достаточно высокой эффективностью.
-
Методом конфокальной микроскопии впервые обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды, ингибирующие теломеразную активность, характеризуются различной компартментализацией внутри опухолевых клеток в зависимости от их нуклеотидного состава. Практическая значимость исследования
Результаты работы совместно с литературными данными позволяют дополнить представления о важной роли теломеразы в
онкогенезе таких новообразований как рак желудка, рак предстательной и щитовидной желез.
Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, способные подавлять ТА и рост опухолевых клеток, могут использоваться в дальнейших исследованиях с целью создания противоопухолевых препаратов нового поколения.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Теломераза играет ключевую роль в процессе онкогенеза злокачественных новообразований желудка, предстательной и щитовидной желез.
-
Фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 (комплементарный матричному участку hTR) и PS-TM024G (имитирующий G-богатую цепь теломерной ДНК) специфически ингибируют теломеразу в лизатах опухолевых клеток линии MCF-7 и характеризуются 1С5о, равными 10 нМ, в то время как 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид (TelP5-R) с последовательностью, комплементарной матричному участку hTR, не оказывает влияния на ТА.
-
Фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-TM024G снижают выживаемость опухолевых клеток, способствуют их накоплению в S-фазе клеточного цикла, стимулируют апоптоз, а также характеризуются различной локализацией после трансфекции в опухолевые клетки.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на Российских и Международных конференциях: V Московский Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2009), III Международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины" (Ростов-на-Дону, Россия, 2009), III Научно-практическая конференция "Перспективы развития инноваций в биологии" (Москва, Россия, 2009), Московская международная научно-практическая конференции "Биотехнология: экология крупных городов" (Москва, Россия, 2010), VII Конференция с международным участием "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, Россия, 2010).
Публикации
По результатам диссертационной работы опубликовано 2 оригинальные статьи в журналах, входящих в список изданий, рекомендованных ВАК, а также 6 тезисов докладов на Российских и Международных конференциях.
Структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы, включающий 165 источников. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 8 таблицами.
Работа выполнялась при поддержке программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.»).
