Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Общая характеристика марены сердцелистной (Rubia cordifolid) 9
1.1.1. Ботаническая характеристика 9
1.1.2. Фитохимическая характеристика 9
1.1.3. Фармакологические и другие свойства вторичных метаболитов марены 14
1.2. Культуры растительных клеток, продуценты антрахинонов , 18
1.3. Генетическая инженерия как метод биотехнологии 20
1.3.1. История и значение генетической инженерии 20
1.3.2. Генетическая инженерия растений 21
1.3.3. Агробактерии как векторы для трансформации высших растений 21
1.3.4. Ti-плазмиды агробактерии 22
1.3.5. Ri-шгазмиды агробактерии , 22
1.3.6. Механизм переноса Т-ДНК 23
1.3.7. Плазмиды агробактерии как векторы для трансформации 24
1.4. Метаболическая инженерия. Модификация шикимат-фенилаланинового биосинтетического пути ? 25
1.5. Гены rol 28
1.5.1. Краткая история проблемы 28
1.5.2. Характеристика генов rol 29
1.5.3. Опухолеобразующая функция генов rol 33
1.5.4. Гены rol как активаторы вторичного метаболизма 35
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2. МАТЕРИАЛЫ ; 36
2.1. Растения , , 36
2.2. Бактерии и плазмиды 36
2.3. Среды для культивирования культур 36
2.4, Реактивы 39
3. МЕТОДЫ 39
3.1. Получение клеточных культур марены 39
3.1.1. Нетрапсформированная культура марены 39
3.1.2. Культура марены, трансформированная геном rolC 40
3.1.3. Культура марены, трансформированная геном гоШ , 40
3.2. Культивирование бактериальных культур 41
3.3. Культивирование каллусных культур марены сердцелистной 41
3.4. Эксперименты с ингибиторами 41
3.5. Выделение плазмидной ДНК 42
3.6. Доказательство трансгенности полученных культур 43
3.6.1. Выделение тотальной растительной ДНК 43
3.6.2. Полимеразная цепная реакция 45
3.7. Доказательство экспрессии генов vol в трансгенных культурах , 44
3,7.1. Выделение тотальной растительной РНК 44
3.7.2. Обратная транскрипция 45
3.7.3. Полимеразная цепная реакция л7 45
3.7.4. Секвенирование rolB и rolC продуктов .„ 46
3.8. Секвенирование участка гена актина марены на матрицах ДНК и кДНК 46
3.9. Анализ экспрессии кальцийзависимых протеинкиназ , 46
3.10. Анализ экспрессии изохоризматсинтазы 47
3.11. Химический анализ антрахинонов 48
3.12. Измерение концеїпрации внутриклеточного кальция методом лазерной флуоресцентной микроскопии с использованием зонда FURA-2AM , 49
3.12.1. Приготовление клеток , 49
3.12.2, Измерение концентрации кальция 49
3.13. Статистический анализ 50
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
4.1 Характеристика клеточных культур марены , 51
4.1.1. Клеточные культуры марены 51
4.1.2. Доказательство трансгенности rolB и rolC культур марены 51
4.1.3. Доказательство экспрессии генов rolB и rolC
в трансгенных культурах 53
4.1.4. Синтез антрахинонов в культурах марены 54
4.2. Регуляция биосинтеза антрахинонов в трансгенных культурах марены 56
4.2.1. Гены rol активируют экспрессию изохоризматсинтазы 56
4.2.2. Влияние элиситоров на синтез антрахинонов
в культурах марены „, 57
4.2.3. Влияние ингибитора протеинфосфатаз,
кантаридина, на синтез антрахинонов 59
4.2.4. Влияние окадаевой кислоты и стауроспорина 61
4.2.5. Ингибитор NADPH-оксидаз, DPI, не влияет
на синтез антрахинонов в культурах марены 61
4.2.6. Влияние ингибитора тирозинфосфатаз, РАО,
на рост и синтез антрахинонов 64
4.3. Кальциевая сигнальная система в регуляции биосинтеза
антрахинонов в трансгенпых культурах марены 66
4.3.1. Рост траисгенных культур в условиях дефицита кальция 66
4.3.2. Влияние ингибиторов кальциевых каналов на рост
и содержание антрахинонов в культурах марены , 67
4.3.3. Дефицит кальция блокирует
кантаридин-стимулированный синтез антрахинонов 71
4.3.4. Устойчивость го/Я-культуры к дефициту кальция
снимается ингибитором тирозинфосфатаз 72
4.3.5. Влияние перекиси водорода на внутриклеточную
концентрацию кальция в культурах марены 73
4.3.6. Изменение экспрессии кальцийзависимых протеинкиназ
в культурах марены , 75
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 78
6. ВЫВОДЫ 80
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81
- Ботаническая характеристика
- Фармакологические и другие свойства вторичных метаболитов марены
- Получение клеточных культур марены
Введение к работе
Культивируемые клетки растений являются основой для биотехнологического получения биологически активных веществ. Создание активных и стабильных штаммов-продуцентов является фундаментальной задачей для этой отрасли в целом. Настоящая работа посвящена поиску путей, посредством которых можно создавать такие штаммы. На примере генов агробактерий мы показали в настоящей работе, что методы генетической трансформации, посредством которых осуществляется перепое генетической информации в ДНК клеток растений, могут являться мощным инструментом для получения штаммов-суперпродуцентов. Также разбираются возможные механизмы увеличения биосинтетической активности клеток под влиянием трансгенов. Эта работа является одной из немногих, выполняемых в настоящее время в мире, когда для увеличения биосинтеза вторичных метаболитов используют не гены, кодирующие отдельные ферменты вторичного метаболизма, а регуляторные гены.
В процессе взаимодействия Agrobacterium rhizogenes с растениями происходит перенос части плазмидной ДНК агробактерий (Т-ДНК) в геном растения. В составе Т-ДНК расположены гены rolB и rolC, которые переносятся в ДНК растений посредством природного механизма, осуществляемого v/r-генами бактерий и вызывают образование опухолей.
Недавно установлена интересная особенность трансформированных генами го! культур растительных клеток - способность к увеличенному синтезу вторичных метаболитов. Первичные мишени генов га/, пока не найдены, а механизм активации синтеза вторичных метаболитов в трансформированных культурах не изучен.
Понимание этого механизма важно по двум причинам. Во-первых, можно получить новые данные о протекании процесса онкогенеза у растений. Во-вторых, появляется возможность расширить знания об общих принципах регуляции синтеза вторичных метаболитов растений. Ингибиторы сигнальных путей применяются для первичной оценки вклада различных биосинтетических путей в ту или иную клеточную функцию. Мы воспользовались этим подходом для того, чтобы выяснить, меняются ли при воздействии ингибиторов ростовые и биосинтетические показатели трансгенных и контрольных каллусов. Разница в этих показателях могла бы указать "точку приложения" трансгепа в клетке.
В работе исследовали механизм активации генами го! шикиматного биосинтетического пути. В качестве модельного объекта использовали клеточные культуры ценного лекарственного растения Rubia cordtfolia L. (марена сердцелистная) не трансформированные
(контроль) и трансформированные генами rolB и rolC. Испытывая действие различных ингибиторов Са2+-каналов, протеин-киназ и фосфатаз, а также других ферментов, участвующих в сигнальных путях клетки, нам удалось получить новые сведения об их участии в rol-опосредованной активации синтеза антрахиионов. Эти результаты впервые показывают, что эффекты растительных онкогенов тесным образом связаны с Са +-опосредованными сигнальными путями.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение механизма активации синтеза антрахиионов в трансформированных генами rolC и rolB культурах марены сердцелистной,
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Получить трансгенные каллусные культуры марены, стабильно экспрессирующие гены
rol В и rolC.
2. Провести сравнительное изучение ростовых и биосинтетических характеристик
трансгенных культур в сравнении с контрольными.
3. Изучить экспрессию гена изохоризматсинтазы в трансгенных культурах марены.
4. Изучить участие важнейших известных сигнальных путей в rolB и rolC-
опосредованных реакциях. Определить "точку приложения" трансгенов.
Основные положения, выносимые на защиту.
Трансформация агробактериальными генами rolB и rolC представляет собой новый способ в биотехнологии, позволяющий увеличить биосинтетическую активность культивируемых клеток растений. На примере марены сердцелистной показано многократное увеличение содержания антрахиионов, составившее 9,17 % от сухого веса клеток, что в 45 раз выше, чем в корнях дикорастущих растений.
Реакции, вызванные экспрессией генов rol в клетках, не связаны с активацией NADPH-оксидазного, октадеканоидного, этилен-зависимого и салицилатного сигнальных путей, а модулируют сигнальную систему кальция.
Научная новизна. Впервые установлено, что гены rol способны значительно увеличивать накопление антрахиионов в трансгенных культурах растений. Показано, что активаториая способность гена rolB выше, чем гена rolC. Оба гена увеличивают синтез антрахиионов путем активации экспрессии ключевого гена их биосинтеза - изохоризматсинтазы (ICS).
Установлено, что активаторный сигнал генов rol не связан с индукцией октадеканоидного и NADPH-оксидазного сигнальных путей. Показано, что процессы фосфорилирования играют
важную роль в опосредованной генами rol активации биосинтеза вторичных метаболитов. Установлено, что ингибитор тирозинфосфатаз подавляет эффекты гена rolB.
Впервые показана связь между функцией генов rol и сигнальной системой кальция. Установлено, что в трансгенных культурах изменена экспрессия генов важных сигнальных молекул растительной клетки - кальцийзависимых протеинкиназ (CDPK).
Практическая значимость. Максимальная продуктивность культур составила 9,17 % суммы антрахинонов от сухой массы клеток, что в 10 раз превышает их содержание в нетрансгенных каллусах и в 45 раз в корнях марены сердцелистпой.
Поскольку антрахиноны марены сердцелистпой не обладают мутагенным действием, препараты на их основе могут стать конкурентоспособными па рынке препаратов, обладающих способностью растворять и удалять камни из почек при почечнокаменной болезни.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференциях молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2000, 2001, 2003), на международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001), на 7-ой Пущинской школе-коференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003), на 7-ой региональной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы химии и биологии" (Владивосток, 2003), на Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Саратов, 2004), на региональной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Работа выполнена в группе биоинжеперии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Химический анализ антрахинонов выполнен совместно с сотрудниками лаборатории химии природных хиноидных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Анализ токов кальция при помощи флуоресцентных зондов выполнен совместно с к.б.н. Д. Л. Амининым, в лаборатории биоиспытаний Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.
Ботаническая характеристика
Род Rubia (марена) относится к семейству Rubiaceae (мареновые), который включает 450 родов и 6500 видов деревьев, кустарников и, реже, травянистых растений. Большинство видов произрастает в Африке, умеренной Азии, Америке и Индии (Singh et al., 2004).
Марена сердцелистная - Rubia cordifolia L. (синоним R. purpurea DC.) было впервые описано как травянистое растение, растущее па северных нагорьях Пакистана и Индии, имеющее местное название "Manjit" ("Manjistha" в Индии) (Baquar, 1989). Это многолетнее травянистое растение до двух метров в длину с тонким ветвистым корнем. Стебли многочисленные, слабые, сильно ветвистые. Венчик бледно желтый, колесовидный с пятью тычинками. Произрастает в Индии, Шри Ланке, Японии, Африке, Пакистане, на территории России - на юге Приморского края. Марена сердцелистная - растение степей, прибрежных кустарниковых зарослей и горных районов, где приурочено в основном к открытым каменистым склонам (Biswas, Mukherjee, 2003).
Фармакологические и другие свойства вторичных метаболитов марены
Биологические исследования показали, что многие лечебные свойства, приписываемые растениям марены в исторических текстах, имеют научную основу. В народной медицине Востока корни марены используют для лечения водянки, паралича, желтухи, аменореи и запоров и многих других заболеваниях. Марена сердцелистная является важным компонентом в Аюрведах, родоначальнице современной западной медицины (Pandey et al., 1994). Она используется как очиститель крови и иммуномодулятор. Нашли применение такие ее свойства, как противовоспалительное и средство, ингибирующие ФАТ (фактор активации тромбоцитов). Экстракт корней R. cordifolia обладает гепатопротекторными и противоопухолевыми свойствами, а также способствует разрушению и выведению камней из почек (Singh et al., 2004). Он так же проявляет противобактериальную и противовирусную активность (Ozgen et al., 2003). Недавно обнаружено противогрибковое (Manojlovic et al., 2005) и цитотоксическое (Wu et al., 2003) действие марены. Марена сердцелистная входит в состав средства "Qurse-rewand", которое в Пакистане используют для лечения хронических заболеваний печени (Gilani et al., 1994). Гепатопротекторное свойство экстрактов марены сердцелистной показано в опытах по ССЦ-j- индуцированному поражению печени на животных объектах (Gilani, Janbaz, 1995).
Ниже представлена характеристика основных фармакологических свойств марены. Антиоксидаптное действие. Экстракт марены способен подавлять генерацию активных радикалов кислорода и таким образом препятствовать протеканию воспалительных процессов (Jain, Basal, 2003). Антиоксидантная активность рубиадина, одного из антрахинонов марены сердцелистной, против перекисного окисления липидов оказалась выше ЭДТА, ТРИС, маннитола и витамина Е (Tripathi et al., 1997). Позже этими же исследователями было показано, что антиоксидантную активность марены обуславливает не только рубиадин, но и другие вторичные соединения (Tripathi, Sharma, 1998). Антиоксидантное действие объясняется тем, что экстракт марены способен поддерживать восстановленный уровень глутатиона (гамма-глутамилцистеинин глицин), главного антиоксиданта эритроцитов, который связывает оксиданты в присутствии окислительного агента (Pandey et al., 1994), что обеспечивается непосредственным взаимодействием компонентов экстракта с железом. Аитиоксиданты марены сердцелистной оказались эффективны для снижения генерации активных радикалов кислорода во время и после ишемического инсульта (Rawal et al, 2004). Вероятно, за антиоксидантную активность марены сердцелистной отвечают так же гидроксиантрахиноны, фенольные компоненты растения (СаІ et al., 2004). Литолитжеское действие. Антрахиноны марены обладают способностью растворять и удалять камни из почек при почечнокаменной болезни. Вклад в это свойство, возможно, также вносят содержащиеся в марене блокаторы кальциевых каналов (Gilani et al., 1994). При рН 7 свободные антрахиноны образуют окрашенные нерастворимые комплексы Са и Mg, накапливающиеся вместе с мочевыми камнями. При рН 5-7 гликозид-связанные антрахиноны образуют растворимые комплексы, таким образом, уменьшая содержание ионов Са и Mg в моче, и предотвращая образование камней. Препараты марены способны растворять оксалаты, фосфаты соли мочевой кислоты, которые откладываются в почках и мочевом тракте в виде камней и песка. Добавление 20 % экстракта R. tinctorum в диету крыс приводило к ингибированию или полному подавлению образования камней (Singh et al., 2004).
Получение клеточных культур марены
Культура R. cordifolia, RK была получена из надземной части марены сердцелистной, привезенной из Анучинского района Приморского края методом, описанным у Бутенко, 1999.
Свежесобранные растения промывали проточной водой с мылом, затем споласкивали дистиллятом. В условиях стерильного ламинарного бокса у растения отделяли листья, а стебли разрезали на фрагменты длиной около 5 см. Части растения помещали в колбу Эрленмейера и заливай л 0,2% раствором диацида (на 200 мл воды 132 мг aethanol mercury chloridum и 264 мг N-cetylpyridinii chloridum). Аккуратно перемешивали в течение 2-3 минут. При этом необходимо учитывать, что режим стерилизации должен быть щадящим, чтобы не произошло окисление тканей растения. Затем раствор диацида сливали, а растения пятикратно промывали в стерильной воде. Части растения из колбы переносили на чашки Петри и стерильно разрезали на дольки по 1-2 см. Наносили ми кро повреждения для индукции каллуса. Экспланты помещали на питательные индуцирующие среды.
Образование каллуса происходило в течение 40-50 дней при 25 С, относительной влажности воздуха 70 %, в темноте.
Полученная культура имеет вид рыхлой желто-оранжевой ткани, стабильна при длительном культивировании. В экспериментах по исследованию функции генов rol данная культура использовалась в качестве контроля.
