Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1. Локусы количественных признаков (QTL) 8
2.1.1. QTL свиней . 8
2.2. Генетические маркеры (ДНК-маркеры). 9
2.3. Гены-кандидаты 14
2.3.1. Позиционные гены-кандидаты 14
2.3.2. Функциональные гены-кандидаты 16
2.4. Генное картирование 18
2.5. Сравнительное генное картирование 20
2.6. Маркер-зависимая селекция 21
2.7. Молекулярная генная диагностика 22
2.7.1. ДНК-диагностика в свиноводстве 23
2.8. Гены белков, связывающих жирные кислоты, как гены- 28
кандидаты содержания внутримышечного жира у свиней
2.8.1. Внутримышечный жир 28
2.8.2. Гены белков, связывающих жирные кислоты (FABP) 30
2.8.3. Полиморфизм генов H-FABP и A-FABP 32
2.8.4. Влияние полиморфизма генов H-FABP и A-FABP нахозяйственно-полезные признаки свиней 33
2.9. Заключение 37
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА 38
3.1. Реактивы и оборудование 3 8
3.2. Животные 39
3.3. Отбор, хранение проб и выделение ДНК 39
3.4. ПЦР-ПДРФ анализ полиморфизма гена H-FABP 41
3.5. Статистическая обработка результатов 42
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 44
Создание банка ДНК свиней 44
Усовершенствование тест-систем для выявления 46
полиморфизма гена H-FABP
Диагностика полиморфизма гена H-FABP 49
Полиморфизм гена H-FABP во взаимосвязи с 54
хозяйственно-полезными признаками
Анализ содержания внутримышечного жира 55
Анализ темпов роста 56
Анализ толщины шпика и состава туш 57
Анализ развития свиней 63
Анализ продуктивности свиней 65
ОБСУЖДЕНИЕ 72
ВЫВОДЫ 80
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 82
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 83
Введение к работе
Актуальность темы.
На формирование продуктивности сельскохозяйственных животных оказывают влияние как генетические, так и средовые факторы. В этой связи, при традиционном отборе животных по фенотипическому проявлению признаков оценка истинного генетического потенциала животных может быть занижена.
С развитием молекулярной генетики и молекулярной биологии становится возможным идентификация генов, напрямую или косвенно связанных с хозяйственно-полезными признаками (геномный анализ) [Foster, 1997]. Выявление предпочтительных с точки зрения селекции вариантов таких генов позволит дополнительно к традиционному отбору животных, например, по уровню удоя, содержания жира и т.п., проводить селекцию непосредственно на уровне ДНК, то есть по генотипу (маркер-зависимая селекция).
Использование генетических маркеров локусов количественных признаков сельскохозяйственных животных и, в частности, свиней открывает новые перспективы в селекции. Селекция по генотипу имеет ряд преимуществ перед традиционными методами. Она не учитывает изменчивость хозяйственно-полезных признаков, обусловленную внешней средой, делает возможным селекцию в раннем возрасте независимо от пола животных и в конечном итоге повышает эффективность селекции. Селекция по генотипу способствует идентификации и быстрому введению предпочтительных аллелей из ресурсных популяций в популяции реципиентов с целью повышения продуктивности и устойчивости к заболеваниям улучшаемых пород животных. Оценка животных по генетическим маркерам, связанным с локусами количественных признаков (QTL), особенно важна для таких признаков, которые фенотипически выявляются относительно поздно или только у животных одного пола (например, молочная продуктивность), а также для тех признаков, на уровень
5 проявления которых значительное влияние оказывают внешние факторы. [Зиновьева Н.А. и др., 2002].
Прежде чем внедрить использование генетических маркеров в селекцию животных, необходимо выполнить ряд мероприятий, таких как: (1) выделить спектр генов-кандидатов, которые могут служить молекулярно-генетическими маркерами QTL; (2) разработать тест-системы для анализа их аллельного полиморфизма; (3) определить частоты встречаемости аллельных вариантов данных генов у различных пород сельскохозяйственных животных; (4) провести корреляционные исследования и (5) оценить эффективность использования генетических маркеров в селекции.
Было выдвинуто предположение, что на рост и воспроизводство оказывают влияние более 100 локусов, при этом около 10 из них имеют относительно сильное влияние на соответствующий признак. В настоящее время уже установлена хромосомная локализация ряда QTL свиней, обуславливающих такие селекционные признаки, как энергия роста, жирность туши, качество мяса, плодовитость, иммунный ответ [Rothschild, Plastow, 1999].
Одними из важнейших селекционных признаков свиней являются мясная продуктивность и качество мяса. Так как эти признаки характеризуются негативной корреляцией, то преимущественная селекция свиней по мясности приводит к значительному ухудшению качества мяса. Селекция свиней по качеству мяса и мясной продуктивности традиционными методами затруднена из-за низкого коэффициента наследуемости признака. В этой связи, возникает необходимость в выявлении и использовании в селекции генетических маркеров, напрямую или косвенно связанных с качественными и количественными признаками мясной продуктивности.
В качестве возможных маркеров признаков мясной продуктивности и качества мяса свиней рассматриваются гены семейства связывающих белков жирных кислот (FABP). Один из генов этого семейства - H-FABP представляет большой интерес в качестве гена-кандидата содержания
внутримышечного жира - важнейшего показателя, определяющего качество мяса, а также в качестве возможного генетического маркера снижения содержания жира в туше свиней [Gerbens et al., 1997].
Цель и задачи исследования.
Целью диссертационной работы являлось выявление полиморфизма гена белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP), и установление его влияния на проявление хозяйственно-полезных признаков свиней различных пород.
Для достижения цели диссертационной работы были поставлены следующие задачи:
Пополнить банк ДНК свиней различных пород и популяций.
Усовершенствовать методику определения полиморфизма гена Н-FABP свиней на основе анализа ПЦР-ПДРФ.
Установить частоты встречаемости аллелей и генотипов гена Н-FABP у различных пород и популяций свиней России.
Провести анализ взаимосвязи генотипов гена H-FABP с содержанием внутримышечного жира.
Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов гена H-FABP с рядом хозяйственно-полезных признаков свиней.
Научная новизна.
Предложена методика определения аллельных вариантов гена H-FABP у различных пород свиней РФ. Определены частоты встречаемости аллелей и генотипов гена H-FABP у шести популяций трех пород свиней, разводимых в Российской Федерации. Изучено влияние вариантов исследуемого гена на содержание внутримышечного жира и другие хозяйственно-полезные признаки свиней.
Практическая ценность работы.
Пополнен банк ДНК свиней различных пород и созданы базы данных хозяйственно-полезных признаков свиней трех пород. Предложена методика
7 выявления аллельных вариантов гена H-FABP для проведения
популяционно-генетических исследований. Показана связь генотипа DD гена
H-FABP с большей толщиной шпика и повышенным содержанием жира в
тушах свиней.
Основные положения, выносимые на защиту.
Создан банк ДНК свиней трех пород (крупная белая - 6 популяций, белая короткоухая, уржумская).
Предложен усовершенствованный метод выявления полиморфных вариантов гена H-FABP свиней.
Выявлены различия в частотах встречаемости аллелей и генотипов исследуемого гена у свиней трех пород.
Установлены тенденции влияния генотипов H-FABP на проявление хозяйственно-полезных признаков свиней.
Структура и объем работы.
Диссертация написана на 97 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методика исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа включает 27 таблиц и 11 рисунков.
Публикации результатов исследований.
По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы.
Апробация работы.
Материалы диссертационный работы были доложены на конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, 2000 год; на международной научной конференции «Актуальные проблемы ДНК-технологий и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2001 год, на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2002 год, на конференции отдела биотехнологии ВРІЖ, 2003 год.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Локусы количественных признаков (QTL)
По числу генов, влияющих на проявление признаков, все признаки можно подразделить на две категории: моногенные или олигогенные признаки, за проявление которых ответственные мажорные (главные) гены и полигенные признаки.
Большинство важных хозяйственно-полезных признаков сельскохозяйственных животных (молочная и мясная продуктивность, темпы роста, содержание жира и белка в молоке и другие) относятся к признакам с полигенной природой наследования. Полигенная природа признака означает, что его количественный уровень генетически определяется различными аллельными вариантами целого ряда локусов, разбросанных по всему геному.
Полигенные участки ДНК, ответственные за проявление хозяйственно-полезных признаков, получили название локусов количественных признаков - QTL (Quantitative Trait Loci s). Индивидуумы в популяции животных, характеризующиеся повышенной продуктивностью, имеют тенденцию к наличию в QTL большего числа предпочтительных аллелей, чем в среднем по популяции. Вследствие отбора таких индивидуумов в качестве родительских пар можно ожидать получение потомков, имеющих более высокую среднюю частоту предпочтительных аллелей, и как следствие более высокую среднюю продуктивность по сравнению с предыдущим поколением [Зиновьева и др., 2002].
QTL свиней.
В настоящее время у свиней идентифицирован ряд важных хромосомальных регионов и главных генов, связанных с хозяйственно-полезными признаками, представляющими экономический интерес. Они включают в себя QTL, ответственные за рост и толщину шпика, качество мяса и воспроизводство (табл. 1).
QTL свиней
В настоящее время у свиней идентифицирован ряд важных хромосомальных регионов и главных генов, связанных с хозяйственно-полезными признаками, представляющими экономический интерес. Они включают в себя QTL, ответственные за рост и толщину шпика, качество мяса и воспроизводство (табл. 1).
Картирование и идентификация QTL и последующее использование этих знаний в разведении в рамках маркер-зависимой селекции открывает возможности дальнейшего усиления эффекта селекции, в первую очередь за свет повышения точности селекции.
Для этого необходимо выполнение двух основных шагов:
- локализация и идентификация QTL;
- исследование возможности использования этих QTL в селекции. Для этих целей нашли применение два метода геномного анализа:
использование генетических маркеров и генов-кандидатов.
Генетические маркеры (ДНК-маркеры).
ДНК-маркеры - это полиморфные участки ДНК с неизвестными до настоящего времени функциями, но с известной позицией на хромосоме. Маркеры находятся в тесном сцеплении с QTL, передаются по наследству потомству и при этом позволяют маркировать и прослеживать происхождение всех локализованных в этом участке, но пока не известных локусов, обуславливающих проявление признаков.
Основным свойством генетических маркеров является полиморфизм. Генетический полиморфизм - это изменения в нуклеотидной последовательности ДНК маркера, обусловленные различными типами мутаций (точковые мутации, инсерции, делеции и т.п.). Формы проявления генетического полиморфизма получили название аллелей. Полиморфный характер конкретного локуса возрастает с увеличением числа аллелей. Наличие двух или более аллелей является необходимой предпосылкой для использования локуса в качестве возможного генетического маркера.
Существует два типа генетических маркеров, основные свойства которых суммированы в Экспрессирующиесяпоследовательности ДНК (например,белки) Относительно низкий уровеньполиморфизма (число различныхаллелей в одном локусе) посравнению с маркерами типа II Вследствие относительновысокого эволюционногоконсерватизма нашли применение всравнительном генном картировании Микросателлиты (ди-, три-,тетрануклеотидные повторы впоследовательности ДНК) Генная функция неидентифицирована Высокая степеньполиморфизма (до 10 различныхаллелей), как внутри, так и междупородами. Не консервативны междувидами.
Одними из первых разработанных маркеров типа I явились так называемые ПДРФ-маркеры (ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов. Если ген, кодирующий экономически важный признак, сцеплен или сам содержит ПДРФ, то с помощью соответствующего рестрикционного фермента может быть создана тест-система данного признака продуктивности. В настоящее время у свиней описано более 20 маркеров типа I, сцепленных с генами хозяйственно-полезных признаков свиней. В настоящее время исследования сосредоточены на поиске дополнительных ПДРФ и выявлении их сцепления с генами QTL.
Маркеры типа II базируются на повторяющихся последовательностях, отличающихся высокой степенью полиморфизма. Такие повторяющиеся последовательности могут быть глобально подразделены на два класса: дисперсные последовательности и тандемные повторы.
Дисперсные последовательности в зависимости от длины классифицируют на два класса: длинные интерсперсионные элементы (LINEs) длиной более 1000 п.о. и короткие интерсперсионные элементы (SINEs) длиной менее 500 п.о. Функции этих элементов пока еще до конца не выяснены. Следует отметить, что данные элементы не отличаются консервативностью между видами животных. Так, между SINEs КРС и свиней не выявлено гомологии [Lenstra et al., 1993].
Тандемные повторы — это повторения определенных последовательностей в ориентации голова к хвосту. Поскольку в них в одном локусе повторяется один и тот же мотив, эти последовательности получили название сателлитов. Схематическое изображение сателлитов представлено на рисунке 1 [по Зиновьевой и др., 2002].
Реактивы и оборудование
Для пополнения банка ДНК были отобраны пробы и выделена ДНК от свиней 6-ти популяций крупной белой породы из следующих племенных хозяйств: ГПЗ «Большое Алексеевское», ГПЗ «Никоновское», ГПЗ «Талдом» Московской области, ГПЗ «Соколовка» Кировской области, ГПЗ «Индустрия» Могилевской области и ГПЗ «Заднепровский» Витебской области; белой короткоухой породы из ГПЗ «Сампурский» Тамбовской области; уржумской породы из ГПЗ «Мухинский» Кировской области.
Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 3.
От опытных животных отбирали пробы кожи уха или пробы крови. Пробы крови консервировали путем добавления кислого цитратного раствора (ACD), добавляя на каждые 6 объемов крови 1 объем ACD [Gustavson et al., 1987, Зиновьева и др., 1998]. Пробы ткани непосредственно после их взятия замораживали при температуре -20С и хранили в таком состоянии до момента использования.
ДНК выделяли посредством солевой экстракции, лизиса в буфере Кавасаки или перхлоратным методом с модификациями [Зиновьева и др., 1998; Гладырь и др. 2001]. Качество очистки и концентрацию выделенной ДНК определяли по методике Зиновьевой и др. [1998].
Выделенную ДНК тестировали по типу А гена H-FABP методом ПЦР-ПДРФ по методике, разработанной Nechtelberger с соавторами [2001], и по типам D и Н по методикам ПЦР-ПДРФ, оптимизированным в ходе выполнения диссертационной работы.
Реакции проводили в конечном объеме 25 мкл с 1 х ПЦР буфером (16,6 мМ (NH4)2S04; 67,7 мМ Трис - НС1, рН = 8,8; 0,1 (v/v) Tween 20), 1,5 мМ MgC12, 200мкМ диоксинуклеозидтрифосфатов, 30 пмоль каждого из праймеров и 1 Ед Taq - полимеразы.
Последовательности праймеров, используемых для ПЦР, представлены в таблице 6.
Амплификацию исследуемых фрагментов ДНК гена H-FABP проводили стандартным методом ПЦР анализа [Saiki et. al., 1988]. После начальной денатурации при температуре 95 С в течение 5 минут выполняли 35 циклов амплификации в следующем температурном режиме: 95С - 1 мин., 60С ( Н аллель) и 58С (D аллель) - 1 мин., 72С - 1 мин.
Полиморфизм по типу Н (5 UTR) выявляли посредством энзиматического гидролиза с использованием рестриктазы Hinfl с последовательностью узнавания G ANTC {генный банк № Х98558, позиции 1321-1325). Отсутствие рестрикционного сайта соответствует аллелю h, в то время как его наличие - аллелю Н. Наличие рестрикционого сайта эндонуклеазы НаеШ или BsuRI с последовательностью узнавания GG CC в интроне 2 гена FABP (генный банк № Y16180, позиции 1810-1813) позволяет идентифицировать аллель d, в то время как его отсутствие соответствует аллелю D.
Для анализа амплифицированных фрагментов ДНК и продуктов рестрикции использовали метод гель-электрофореза. Электрофоретическое разделение проводили при 120 В в 1,8% агарозном геле в буфере ТАЕ с добавлением бромистого димидия до конечной концентрации 30 нг/мл, после чего визуализировали продукты ПЦР-ПДРФ под ультрафиолетовым светом. Документацию результатов осуществляли, используя программу Bio Test 3D.
Содержание внутримышечного жира в длиннейшей мышце спины определяли по количеству обезжиренного остатка по методу СВ. Рушковского СВ. [Дрозденко и др., 1981] в лаборатории химико-аналитических исследований отдела сертификации и экологических исследований в животноводстве ВИЖ.
