Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Маркерная селекция 10
1.2. Взаимосвязь мраморности и содержания внутримышечного жира в мясе крупного
рогатого скота 14
1.3. Стандарты оценки мраморности мяса крупного рогатого скота 17
1.3.1. Выбор стандарта "мраморности"мяса. 18
1.4. Гены-кандидаты, влияющие на липидный обмен и мраморность мяса крупного рогатого
скота 19
1.4.1. Тиреоглобулин (tg5). 22
1.4.2. Диацилглицерол 0-ацилтрансфераза1 (dgat1) 23
1.4.3. Лептин(ьер) 25
1.5. Методы диагностики аллельных вариантов маркерных генов 28
1.5.1. ПЦР-ПДРФ. 28
1.5.2. Пиросеквенирование 30
1.6. Кластерный анализ. 32
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
2.1. материалы 33
2.1.1. Животные. 33
2.1.2. Оборудование. 35
2.1.3. Реактивы. 36
2.2. Методика исследований 37
2.2.1. ПЦР-ПДРФ анализ гена тиреоглобулина 37
2.2.2. ПЦР-ПДРФ анализ гена диацилглицерол 0-ацилтрансферазы1 38
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 41
3.1. Обновление банка ДНК крупного рогатого скота различных пород, 41
3.2. Выбор спектра ДНК-маркеров липидного обмена крупного рогатого скота 42
3.3. Разработка аналитических моделей генотипирования животных по генам TG5, DC ATI и
LEP 44
3.3.1. Разработка системы анализа полиморфизма гена тиреоглобулина (TG5). 46
3.3.2. Разработка системы анализа полиморфизма гена диацилглицерол О-ацилтрансферазы! (DGAT1). 49
3.3.3. Разработка системы анализа полиморфизма гена гена лептина. 52
3.4. Популяционно-генетические исследования крупного рогатого скота различных пород
по вариантам генов TG5,DGAT1 и LEP 56
3.4.1. Генотипирование крупного рогатого скота холмогорской породы по генам TG5, DGAT1 и LEP. 56
3.4.2. Генотипирование крупного рогатого скота черно-пестрой, голштинской черно-пестрой и красно-пестрой пород по генам TG5, DGA ТІ и LEP. 62
3.4.3. Генотипирование крупного рогатого скота бурой швицкой, айрширской и красной горбатовской пород по генам TG5, DGAT1 и LEP. 70
3.4.4. Генотипирование крупного рогатого скота симментальской породы по генам TG5, DGAT1 и LEP. 73
3.4.5. Генотипирование чистопородного и помесного скота ярославской, сычевской, костромской, бестужевской, холмогорской пород по генам TG5, DGAT1 и LEP. 79
3.4.6. Комплексный анализ крупного рогатого скота исследуемых пород по генам TG5 DGAT1 и LEP. 85
3.5. Влияние полиморфизма генов tg5, dgat1 и lep на показатели молочной
продуктивности коров 86
3.5.1. Изучение влияния генотипов гена TG5 на показатели молочной продуктивности коров. 86
3.5.2. Изучение влияния генотипов гена DGAT1 на показатели молочной продуктивности коров.88
3.5.3. Изучение влияния генотипов гена LEPua показатели молочной продуктивности коров... 90
3.5.4. Изучение влияния комплексных генотипов генов TG5, DGA ТІ и LEP на показатели молочной продуктивности коров. 92
4. ОБСУЖДЕНИЕ 96
5. ВЫВОДЫ 104
6. ПРАКТИЧ ЕСКИ Е ПРЕДЛОЖЕНИЯ 107
ЛИТЕРАТУРА 108
Введение к работе
1. Актуальность темы.
Особенности жирового обмена животных как показателя энергии роста имеют большое значение в скотоводстве; направление и интенсивность липидного метаболизма оказывает существенное влияние на качественные характеристики животноводческой продукции. Селекционно значимыми показателями продуктивности, характеризующими жировой обмен, являются мраморность мяса и жирность молока рКарова Т.В., 2005].
В зависимости от направления использования животноводческой продукции существует устойчивый спрос как на мясо с высокой степенью мраморности, так и на постное. Учитывая, что мясное скотоводство в России в виде специализированной отрасли только начинает создаваться [Пегошин ГЛ. и др., 2005}, разработка и внедрение новых методов оценки качественных характеристик мяса имеет большое значение. В молочном скотоводстве следует отметить селекционную приоритетность показателя жирности молока.
Таким образом, существует потребность в методах оценки склонности животных, в частности, крупного рогатого скота, к образованию характерной мраморности мяса и повышенному содержанию жира в молоке [Bamndse W.J., 1999].
Одним из эффективных подходов оценки направления и интенсивности липидного обмена и, как следствие, проведения отбора животных по данным признакам является использование ДНК-маркеров. Разработка систем анализа возможных ДНК-маркеров липидного обмена животных и изучение влияния полиморфных вариантов таких маркеров на показатели продуктивности являются актуальной задачей современной животноводческой науки [Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2004].
Цель и задачи исследований.
Целью настоящей работы явилась разработка систем молекулярно-генетического анализа полиморфизма генов-кандидатов, влияющих на липидный обмен, и их экспериментальная апробация для генотипирования крупного рогатого скота различных пород.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
-
Выполнить анализ спектра генов, влияющих на показатели липидного обмена, в частности, на мраморность мяса и жирность молока у крупного рогатого скота.
-
С использованием технологии пиросеквенирования разработать методики определения полиморфизма генов тиреоглобулина, диацилглицерол 0-ацилтрансферазы1 и лептина, потенциально влияющих на показатели липидного обмена крупного рогатого скота.
-
Провести генотипирование крупного рогатого скота различных пород по изучаемым генам.
-
Выполнить анализ генетической структуры популяций крупного рогатого скота различных пород по генам тиреоглобулина, диацилглицерол 0-ацилтрансферазы1 и лептина.
-
Изучить влияние генотипов исследуемых генов на показатели молочной продуктивности коров.
Научная новизна.
С использованием разработанных в ходе выполнения диссертационной работы тест-систем изучен полиморфизм генов-кандидатов мраморности мяса и липидного обмена тиреоглобулина (TG5), диацилглицерол 0-ацилтрансферазы1 (DGAT1) и лептина (LEP) у крупного рогатого скота различных пород, разводимых на территории России. Выполнен анализ иерархических связей между исследуемыми группами крупного рогатого скота различных пород с использованием в качестве критерия частоты встречаемости генотипов
исследуемых генов. Изучена молочная продуктивность коров различных пород в зависимости от генотипов по генам TG5, DGAT1 и LEP.
Практическая значимость работы.
Разработаны тест-системы определения полиморфизма генов TG5, DGAT1 и LEP как потенциальных маркеров липиднога обмена и мраморности мяса крупного рогатого скота. Проведена апробация систем при определении частот встречаемости вариантов этих генов в 28 группах крупного рогатого скота пород: холмогорская, красно-пестрая, черно-пестрая, ярославская, симментальская, красная горбатовская, бестужевская, сычевсхая, костромская, айрширская, голштинская черно-пестрая и бурая швицкая.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Молекулярно-генетические системы анализа полиморфизма генов-кандидатов липидного обмена и мраморности мяса крупного рогатого скота TG5, DGAT1 и LEP.
-
Характеристика генетической структуры популяций крупного рогатого скота различных пород по изучаемым генам.
-
Оценка генетических различий между исследуемыми группами скота различных пород с использованием в качестве критерия полиморфизма по генам TG5, DGAT1 и LEP.
-
Влияние полиморфизма изучаемых генов на признаки молочной продуктивности коров различных пород.
Апробация работы.
Результаты исследований были доложены на: III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», ВИЖ, 2005 г.; международной научной конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2005; международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.Н. Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», Бишкек, Киргизия, 2005; в школе-практикуме «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2005.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа написана на 127 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа включает53таблицыги 29 рисунков. Список литературы включает 175 источников, в том чи№е1151істочнЙков на иностранных языках.
Маркерная селекция
На эффективность производства продукции животноводства оказывают влияние множество факторов, одним из наиболее значительных является генетический потенциал животных, использующихся в племенной работе [Эрнст Л.К., 2005; Амерханов Х.А., 2003]. Генетическое усовершенствование существующих пород животных - длительный и трудоемкий процесс, т.к. большинство экономически значимых показателей, включая мраморность мяса и жирность молока, имеют полигенную природу, то есть определяются многими генами. Маркерная селекция в качестве дополнительного метода может стать мощным инструментом селекционного отбора животных, характеризующихся повышенным накоплением внутримышечного жира и более интенсивным синтезом жира в молоке [BennewitzJ., 2003].
Маркерная селекция (Marker-Assisted Selection, MAS) - это программ генетического усовершенствования животных, включающая использование в качестве критериев информации о результатах тестирования маркерных генов селекционно-значимых QTL (quantitative trait loci, локусы количественных признаков). Она наиболее оправдана в дополнение к традиционной селекции, а также к селекции, основанной на использовании индексов EPD (expected progeny difference, прогнозируемое различие потомства). Система индексов EPD - система оценки племенной ценности животных, основанная на сравнении животных одной породы из разных стад и учитывающая влияние на проявление интересующего признака всего комплекса генов. В дополнение к индексу племенной ценности для каждого отдельно взятого производителя рассчитывается точность оценки селекционно-значимых признаков, которая зависит от количества информации о предках и потомках данного животного. Значение точности может варьировать от 0 до 1 (чем больше значение, тем выше достоверность оценки) и рассматривается в качестве эффективного инструмента управления риском [Dekkers J.СМ., 2004].
Первоначально генетические маркеры были представлены только полиморфными системами групп крови и сайтами рестрикционных ферментов. В настоящее время под генетическими маркерами подразумеваются микросателлиты и полиморфизмы отдельных нуклеотидов («точковые мутации», SNP). Передача маркерного гена от родителя к потомству дает информацию о наследовании региона хромосомы, охватывающего маркерный ген. Размер каждого региона хромосомы, передающегося от родителя к потомству, не может быть определен точно, поскольку в формировании признаков, как правило, задействованы несколько пересекающихся участков ДНК, фланкирующих место локализации маркера. Наличие информации о наследовании маркерного гена, т.е. вероятность проявления желательного признака у потомства, является необходимым условием в племенной работе [Kashi Y., Lande R., 1990].
Несмотря на значительные достижения в области молекулярной генетики в течение последних 15 лет, только небольшое число ДНК-маркеров нашло применение в селекции для улучшения продуктивных качеств и контроля наследственных заболеваний крупного рогатого скота. Большинство коммерческих маркерных генов характеризуют простые QTL (наследственные заболевания, цвет кожи, обмускуленность), но имеются также ряд маркеров, связанных с экономически важными признаками полигенной природы, появление которых зависит, в том числе, и от внешних факторов [Schmutz S.М. и др., 1995].
Стратегия оценки потенциальной роли новых маркерных генов в селекции основана, прежде всего, на определении экономического значения данного маркера и потребностей рынка в разрабатываемом продукте. При этом во внимание принимаются следующие параметры:
Животные
На следующем этапе исследований для каждого из вышеназванных SNP (см. табл. 9) нами были разработаны модели их анализа, базирующиеся на технологии пиросеквенирования. Создание тест-систем для каждого из генов проводилось в несколько шагов.
Первоначально проводили диагностику 30-50 образцов с использованием стандартных методик на основе секвенирования и ПЦР-ПДРФ анализа, описанных в литературных источниках. Затем проводили теоретическое моделирование новых систем анализа выбранных SNP с использованием пиросеквенирования. Для этого нами был разработан дизайн олигонуклеотидных праймеров для ПЦР и пиросеквенирования, подобраны и оптимизированы условия проведения ПЦР-анализа и пиросеквенирования с учетом следующих критериев: количество и концентрация праймеров для ПЦР и пиросеквенирования, состав ПЦР-буфера, температура и продолжительность циклов денатурации, отжига праймеров и синтеза ДНК цепи, количество циклов амплификации. Следует отметить, что ключевым моментом в моделировании дизайна анализа полиморфизма каждого из изучаемых генов является настройка программного обеспечения компьютера для обработки данных пиросеквенирования, а именно задание контрольной нуклеотидной последовательности, включающей как образующие мутацию, так и референтные нуклеотиды. Согласно ей в процессе анализа происходит синтез новой ДНК-цепи, результаты анализа в виде графиков (пирограмм) сравниваются с контрольной гистограммой этой последовательности. Совпадение пиков проверяемых и референтных нуклеотидов полученных пирограмм с соответствующими контрольными гистограммами тех же генотипов свидетельствует о достоверности результатов исследования и высокой точности разработанной системы генотипирования.
Завершающим шагом являлось проведение экспериментальной апробации разработанных систем на 30-50 референтных образцах (предварительно протестированных с использованием стандартной методики ПЦР-ПДРФ анализа для генов TG5 и DGAT1 и с использованием секвенирования для всех 3-х мутаций гена LEP). Только после 100%-го совпадения данных о генотипах животных, полученных с использованием обоих методов, приступали к генотипированию животных различных пород с использованием созданных в рамках данной диссертационной работы аналитических моделей.
Выбор спектра ДНК-маркеров липидного обмена крупного рогатого скота
Совершенно очевидно, что главными орудиями производства в животноводстве являются животные, от продуктивных возможностей которых в решающей степени зависит эффективность и конкурентоспособность отрасли. В связи с этим повышение генетического потенциала продуктивности является одним из актуальных факторов успешного развития животноводства. (Эрнст Л.К., 2005)
С 1990 года в России поголовье скота сократилось более чем на 34 млн. голов или в 2,5 раза с одновременным увеличением импорта говядины почти в 2 раза. Получение говядины осуществляется в основном за счет откорма бычков и убоя выбракованных коров молочных и комбинированных пород. Мясные породы составляют около двух процентов от общего количества скота в нашей стране (всего 450 тыс. голов, 160 тыс. из них - коровы), тогда как во Франции поголовье животных мясных пород составляет 50%, в США - 78%. Даже при образцовой организации молочного скотоводства и откорма сверхремонтного молодняка (и выбракованных взрослых животных) молочные фермы не в состоянии дать необходимое количество говядины и обеспечить соответствующее качество продукции (Легошин ГЛ., 2005, Калашников В.В., 2006)
Организация мясного скотоводства в настоящее время возможна путем использования животных специализированных мясных пород, как отечественной, так и импортной селекции для создания новых генеалогических структур (линий, типов) и разведения «в чистоте». Второй способ создания отрасли - поглотительное скрещивание районированных молочных пород с мясными до полного поглощения первых последними с ориентацией селекции на повышение мясной продуктивности, создание животных с высокой энергией роста и хорошим использованием кормов. В промышленном скрещивании мясной скот позволяет улучшить показатели продуктивности от животных молочных пород. Кроме того, для развития мясного скотоводства необходимо формировать определенный потребительский спрос населения, так как в нашей стране, в отличие от большинства развитых стран, не сформированы потребительские требования по отношению к высококачественному охлажденному мясу мясного скота, стоящему обычно значительно дороже замороженного обычного мяса. [Заверюха А.Х., 1997; Зелепухин А., 2001]
Проведенные нами популяционно-генетические исследования крупного рогатого скота могут позволить значительно форсировать селекцию на улучшение мясных качеств животных отечественных пород, используя установленные генотипы локусов липидного обмена и мраморности мяса TG5, DGAT1 и LEP. Так как в селекционной стратегии важно принимать во внимание возможное влияние генов-кандидатов на другие количественные признаки, ведение племенной работы на улучшение мясных качеств скота возможно без значительных потерь по молочной продуктивности за счет выявленной связи вариантов генов DGAT1 и LEP с показателями молочной продуктивности (удой, жирность молока). Проведение идентификации и целенаправленного отбора животных с желательными генотипами для непосредственного улучшения качества мяса возможно с помощью молекулярно-генетического тестирования.
В настоящее время в странах с развитым животноводством известны коммерческие системы генотипирования животных по генам, связанным с показателями мясной продуктивности, но, вследствие высокой стоимости анализов и удаленности исследовательских лабораторий, представляется сложным и дорогостоящим проведение популяционно-генетического тестирования отечественных пород скота по вышеназванным локусам. В связи с этим, одной из задач наших исследований явилась разработка аналитических систем для определения генотипов потенциальных маркеров липидного обмена и мраморности мяса - TG5, DGAT1 и LEP.
