Введение к работе
Актуальность темы. На протяжении последних десятилетий изучение микроорганизмов рубца, их роли в пищеварении и обмене веществ в многокамерном желудке жвачных вызывает повышенный интерес, как ученых, так и практиков -животноводов, поскольку результаты этих исследований способствуют организации более рационального и полноценного кормления животных и эффективного использования кормов для повышения продуктивности (Пивняк, Тараканов, 1982; Георгиевский, 1990; Прохоренко, 2006; Стрекозов и др., 2006; Романенко, 2007; Эрнст, Зиновьева, 2008; Hungate, 1966).
Основные знания о микрофлоре рубца и ее функциях были получены с помощью классических методов микробиологии (Bryant, 1959; Hungate, 1966; Dehority, Orpin, 1988; Hespell et al., 1997). Однако в настоящее время исследователями описан ряд ограничений и недостатков данных методов - прежде всего их трудоемкость и неточность (Dehority, 2003). Помимо этого, зарубежными специалистами было показано, что значительная часть микроорганизмов рубца представлена некультивируемыми видами. Поэтому многие ученые считают, что представления, основанные на традиционных микробиологических методах, не отражают всей полноты процессов, происходящих в рубце (Amann et al., 1992; Wintzingerode et al., 1997; Zoetendal et al., 1998; Krause et al., 2003; Shin, 2004).
Развитие метагеномных методов делает возможным дальнейшее изучение разнообразия микроорганизмов без ограничений традиционных методов микробиологии - т.е. минуя стадию культивирования. Большинство данных методов основано на анализе разнообразия консервативных элементов генома микроорганизмов (например, 16S/18S рРНК) и часто включают в себя стадии клонирования общей ДНК всех микроорганизмов в вектор, а затем анализ полученных библиотек клонов в базах данных (Stackebrandt, Goebel, 1994; Amann et al., 1995; Madden et al., 1996; Tajima et al. 1999; Nelson et al., 2003; Handelsman, 2004). Однако, несмотря на широкий спектр возможностей, данные методы являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими. Кроме того, часто перед исследователем стоит задача не просто изучить структуру микробного сообщества, но и проследить за изменением этой структуры в результате какого-либо воздействия. Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является Т-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) - молекулярно-биологический метод для изучения структуры микробной экосистемы, основанный на анализе полиморфизма длин амплифипированных рестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов. Преимуществом использования данного подхода является возможность получения профиля микробного сообщества (бактерий, архей, грибов), что позволяет установить количество и относительную численность доминирующих групп микроорганизмов. Для определения таксономической структуры бактериальных сообществ по длинам рестрикционных фрагментов созданы компьютерные программы, например, программа FragSort (March et al., 2000). Таким образом, в результате возможно выявление микроорганизмов, оказывающих непосредственное влияние на продуктивность животных.
Цель исследований. Изучить состав микрофлоры рубца крупного рогатого скота, его изменения в течение суток, в процессе роста и развития животных, а также под действием пробиотических препаратов на основе молекулярно-биологического метода T-RFLP для оценки возможности использования данного подхода в разработке способов его оптимизации.
Задачи исследований:
- модифицировать методику T-RFLP для изучения микрофлоры рубца крупно
го рогатого скота;
- сравнить результаты классических методов микробиологии и T-RFLP-
анализа при изучении микрофлоры рубца жвачных животных;
изучить закономерности суточной и возрастной динамики микробного сообщества рубца бычков с помощью T-RFLP-анализа;
установить особенности микробиоценоза рубца дойных коров в зависимости от уровня продуктивности и состояния здоровья;
оценить влияние пробиотических препаратов на микрофлору рубца крупного рогатого скота.
Научная новизна исследований. Впервые проведен комплексный анализ таксономической структуры микробного сообщества рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного молекулярно-биологического метода T-RFLP, в результате чего было выявлено более 200 филотипов бактерий, архей и грибов, в том числе некультивируемых, а также установлена возможная роль данных микроорганизмов в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных. Изучены изменения во всех компонентах микробного сообщества (бактерии, археи, грибы), происходящие в течение суток, связанные с кормлением животных. Установлено, что рост и развитие пищеварительной системы животных сопровождается сменой доминирующих таксономических групп в составе бактерий, архей и грибов. В условиях рубцовой экосистемы проанализировано действие пробиотиков Целло-бактерин-Т и Целлобактерин-S на разные физиологические группы микроорганизмов.
Выявлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и количеством микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.
Практическая значимость работы. С использованием модифицированного метода T-RFLP в рубце крупного рогатого скота выявлено более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), установлена их связь с физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных, что позволяет разработать способы регулирования микробиологических процессов в рубце, направленных на повышение эффективности использования корма жвачными животными, снижение заболеваемости и увеличение продуктивности животных.
Материалы исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Использование пробиотика Целлобактерин-Т в кормлении жвачных животных» (Дубровипы, ВИЖ, 2011).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены:
- на Международной конференции «Проблемы увеличения производства про
дуктов животноводства и пути их решения» (Дубровипы, октябрь 2008 г.);
на 13 и 14 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука 21 века» (Пущино, 2008-2009 г.),
на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов» (Москва, 19-20 августа 2009 г.);
на пятой Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 14-16 сентября 2010 г.);
на пятой Международной конференции «Современное производство комбикормов «Комбикорма - 2010» (Москва, 22-24 ноября 2010).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 13 научных статей, в том числе пять в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Положения, выносимые на защиту:
изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного метода T-RFLP позволяет идентифицировать более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), в том числе не культивируемых, а также установить их возможную роль в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных;
установлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и содержанием микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 197 страницах компьютерной верстки, содержит 40 таблиц, 18 рисунков, структурно включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, предложения производству и список использованной литературы, включающий 342 источника, в том числе 303 на иностранном языке.
