Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Современное состояние грибоводства в России 9
1.2. Эколого-биологическая характеристика 11
представителей рода Pleurotus 11
1.3. Основные принципы и состояние селекции вешенки 19
на продуктивность плодовых тел 19
1.3.1. Современные промышленно культивируемые штаммы и их продуктивность 19
1.3.2. Использование молекулярно-генетических методов селекции грибов на продуктивность 23
1.4. Лигноцеллюлазный комплекс грибов рода Pleurotus 35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 49
3.1. Разработка селекционного процесса с использованием показателя активности лакказ 49
3.1.1. Разработка способа отбора гаплотипов грибов рода Pleurotus с повышенной активностью лакказ 49
3.1.2. Выявление вариабельности признака активности лакказ 57
и целлюлаз у монокариотического и дикариотического 57
мицелия вешенки 57
3.1.3. Влияние рН-субстрата на динамику активности лакказ 65
и сопряженность этого фактора с инициацией плодоношения 65
3.2. Получение гибридных штаммов вешенки 71
3.2.1. Оценка гибридов вешенки по показателю активности лакказ 71
3.2.2. Оценка продуктивности плодовых тел гибридов вешенки 76
3.2.3. Органолептическая оценка плодовых тел вешенки и анализ их химического состава 82
3.3. Формирование нового селекционного материала вешенки на основе изолятов лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа 86
3.3.1. Выявление и видовая идентификация «летних» штаммов вешенки лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа 87
3.3.2. Исследование генетического полиморфизма природных 92
популяций P. pulmonarius 92
3.3.3. Активность лакказ мицелия природных 99
штаммов P. pulmonarius 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103
ВЫВОДЫ 105
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 106
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 107
ПРИЛОЖЕНИЯ 123
- Современное состояние грибоводства в России
- ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Разработка селекционного процесса с использованием показателя активности лакказ
Введение к работе
Промышленное культивирование плодовых тел высших съедобных ба-зидиомицетов по экономической эффективности может успешно конкурировать с традиционными методами получения пищевых продуктов (Бисько, 1996). Рентабельность производства вешенки составляет в среднем 30% (Де-вочкина, Алексеева, 1998). Вешенка обыкновенная Plenrotus ostreatus (Fr.) Kumm. является одним из перспективных компонентов экологически чистых пищевых продуктов, обладающих высокой биологической ценностью и лечебно-профилактическими свойствами. Интенсивное культивирование вешенки на разнообразных целлюлозо- и лигнинсодержащих отходах сельского и лесного хозяйства, а также перерабатывающей промышленности с последующим использованием субстратов после плодоношения в качестве кормовых добавок в животноводстве или удобрений в тепличном хозяйстве позволяет сделать производство съедобного гриба вешенки безотходным (Поединок, 2004). В производственной практике культивирования вешенки представлен небольшой ассортимент штаммов, большая часть из которых являются штаммами зарубежной селекции. Еще меньшее их количество имеют официальную регистрацию на территории России в качестве объекта изобретения или селекционного достижения. Отсутствуют четкие рекомендации по обеспечению технологических условий, обеспечивающих реализацию биологического потенциала того или иного штамма.
Поэтому важной задачей современного интенсивного грибоводства, является получение и внедрение в производство высокоурожайных штаммов, полученных с использованием научно обоснованных методов, в совокупности с применением технологии производства вешенки, соответствующей ее биологическим требованиям.
Актуальность исследований. Проблема недостаточного обеспечения рациона человека белком от года к году не становится менее острой. На фоне
5 роста стоимости зерновых культур недостаточно полно используется потенциал вовлечения лигноцеллюлозных отходов в производство дополнительной продукции. Одним из эффективных методов переработки растительных отходов является их биоконверсия при выращивании базидиальных грибов. Среди промышленно культивируемых грибов вешенка занимает одно из ведущих мест по объему производства грибной продукции в России.
Динамическое развитие грибоводства в России выявило потребность производства в штаммах вешенки, удовлетворяющих современным требованиям интенсивных технологий: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, бесшоко-вость, высокая продуктивность и товарные качества плодовых тел. Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ..., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. В связи с этим важной задачей современной грибной индустрии является создание новых высокопродуктивных сортов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Wang, Anderson, 1972; Eger G., 1974; Larraya, 2002), однако системных исследований по их использованию при проведении гибридизации и отборе штаммов выполнено недостаточно.
Цель и задачи исследований создание исходного материала рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm методом отбора гаплотипов по активности лакказ для селекции на продуктивность. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Разработать метод отбора монокариотического и дикариотического мицелия по активности лакказ.
Выделить из промышленно культивируемых штаммов моноспоровые изоляты, произвести их анализ и отбор по активности лакказ.
Провести гибридизацию отобранного монокариотического мицелия разных штаммов и оценить активность лакказ полученных гибридов.
Изучить продуктивность и габитус плодовых тел коммерческих и полученных гибридных штаммов P. ostreatus в научно-хозяйственных испытаниях.
Исследовать местообитания «летних» штаммов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на территории Северо-Западного Кавказа, установить вариацию активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.
Научная новизна. Разработан экспресс-метод определения активности лакказ мицелия вешенки.
Впервые экспериментально подтверждена целесообразность осуществления отбора дикариотических и монокариотических форм мицелия по признаку активности лакказ при проведении селекции вешенки на повышение продуктивности.
Впервые показана взаимосвязь активности лакказ и инициации плодоношения вешенки обыкновенной с рН субстрата при ее твердофазном культивировании.
Впервые проведено изучение популяции «летних» штаммов вешенки лесных биоценозов Северо-Западного Кавказа, установлена вариация активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.
По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие основные положения:
Разработан метод отбора гаплоидов вешенки по активности лакказ на плотных питательных средах.
Использование гаплотипов вешенки с повышенной активностью лакказ при проведении селекции обеспечивают увеличение продуктивности получаемых гибридов.
Получен гибридный штамм P. ostreatus (Fr.) Kumm. ВКМ F-3889D методом отбора гаплоидов с высокой активностью лакказ, достоверно превышающий по продуктивности родительские формы.
Культивирование вешенки на субстрате с повышенным значением рН увеличивает период наступления максимума активности лакказ и инициации плодоношения на десять суток.
Штаммы вешенки лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа обладают значительной вариацией лакказ мицелия и высоким уровнем генетического полиморфизма. Отобранный генетический материал пригоден для селекции штаммов, формирующих базидиомы в летний период при культивировании интенсивным методом.
Практическая значимость работы. Разработанная методика отбора родительских форм по признаку активности лакказ была применена при проведении селекции на продуктивность и для создания гибридных штаммов (патент РФ на изобретение № 2295728).
Получен гибридный штамм ВКМ F-3889D, позволяющий повысить продуктивность плодовых тел вешенки и исключить стадию холодового «шока» и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН им. Г. К. Скрябина.
Исследовано генетическое разнообразие внутри природных популяций вешенки. Собранные образцы могут быть использованы в селекции при отборе штаммов для промышленного культивирования в условиях летнего сезона.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены: на VII и VIII Региональных научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2005; 2006); Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции по инновационному малому предпринимательству в приоритетных направлениях науки и
8 высоких технологий (Москва, 2006); Заключительном туре Всероссийской конференции смотра-конкурса на лучшую студенческую работу по направлению растениеводство и земледелие (Москва, 2006); конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (Киров, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2008).
Публикации. Результаты исследования отражены в 10 печатных работах, из них 1 патент и 2 работы опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, предложений производству и списка используемых литературных источников, включающего 144 источника, в том числе 40 зарубежных авторов. Работа изложена на 123 страницах и иллюстрирована 19 рисунками, 11 таблицами, содержит 3 приложения.
Современное состояние грибоводства в России
Вешенка является важным резервом расширения ассортимента овощной продукции, позволяет обеспечить население ценным продуктом питания с лечебно-профилактическими свойствами в течение круглого года, и особенно, во внесезонный период (Литвинов, 1998). Грибная биомасса характеризуется высокой сорбционной способностью. Мицелий способен связывать значительное количество тяжелых металлов, что делает пригодным его использование в качестве основы для разработки и создания эффективных сорбентов (Ровбель, 2004). Вешенка характеризуется высоким содержанием полисахаридов, которые обеспечивают ее противораковое действие. Это свойство сохраняется и после тепловой обработки, при этом часть полисахаридов переходит в бульон. В умеренных дозах грибная клетчатка, образующая клеточную стенку, нормализует деятельность кишечной микрофлоры (Бабицкая, 1996).
Кроме того, отработанный субстрат может использоваться в кормлении животных. Для повышения питательной ценности и переваримости соломы применяют различные способы ее подготовки к скармливанию - физические, химические, биохимические. Перспективный метод использования соломы озимых и яровых злаковых культур - пшеницы и ржи - это обогащение ее мицелием съедобных целлюлозоразрушающих грибов рода Plenrotus (Fr.) P. Kumm. В результате можно получать высокобелковые деликатесные продукты питания — плодовые тела и протеин содержащий грубый корм (Дурова, 1997).
Грибы могут занять важное место в удовлетворении потребностей человека в белке. По данным некоторых авторов содержание белка в плодовых телах вешенки составляет 3-4% и около 0,14% в форме небелкового азота при влажности плодовых тел 90-92 %. В аминокислотном составе обнаружено аминокислот, которые имеют достаточно высокую концентрацию за исключением метионина и фенилаланина (Жмудь, 2007; Вапо, 1963).
На рынке грибной продукции выделяют несколько сегментов: свежие грибы, замороженные грибы, консервированные грибы, в некоторых случаях как самостоятельный сегмент рассматривают сушеные грибы. По данным маркетенговых исследований (Черняховская, 2008) особенностью отечественного грибного рынка является тот факт, что реальный объем потребления грибов существенно превышает объем продукции, представленной на рынке. Это объясняется тем, что российские потребители остаются верны дикоросам - семь из десяти съеденных в нашей стране грибов собраны в лесу.
В целом в России в год съедают свыше 500 тысяч тонн грибов, то есть не менее 3 килограммов на человека в год. Для сравнения: в США и во Франции - по 2,5 килограмма, в среднем по Европе - чуть больше 2 килограммов. При этом если за рубежом львиная доля грибов выращена на грядках и в специальных стеллажах, то в России на долю культивируемых грибов и грибной продукции в год приходится примерно 170 тысяч тонн общего объема потребления. Из них лишь около 20 тысяч тонн производится в России, остальной объем завозится из Германии, Китая, Польши. Таким образом, еще 330 тысяч тонн ежегодно потребляемых россиянами грибов составляют дикоросы и продукция «самосбора», не представленная на рынке. Между тем, участников рынка обнадеживает тот факт, что в 2007 году потребление культивируемых грибов и грибной продукции увеличилось в России на 10%. При этом, рост идет за счет потребления свежих грибов: если в 2006 году в свежем виде покупалось 25,5% грибов, то в 2007-м этот показатель вырос до 27%. Уровень потребления культивируемых и промышленно переработанных лесных грибов в 2007 году в России в среднем составил 1,2 килограмма на душу населения. Это по-прежнему в 2-3 раза меньше европейского уровня и в 4 раза меньше, чем в Китае. Уже сегодня минимальный уровень потребления культивируемых грибов и грибной продукции в России может быть на уровне 2,5 килограмма. Еще одна важная характеристика рынка - значительное отставание отечественного производства от импорта. И это несмотря на обилие ресурсов дикоросов, а также тенденцию к увеличению количества предприятий, выращивающих культурные грибы.
Объекты и методы исследования
Лабораторные исследования проводили с грибами P. ostreatus штаммами Львовский, Флорида, Пенсильвания, Р77, НК35 (мицелий был представлен ФГУ «Краснодарский биоцентр», г. Краснодар), для изучения генетического полиморфизма использовали 23 штамма из природных условий обитания, штаммы P. pulmonarius ВКМ F-2006 и P. cornucopiae ВКМ F-1979 полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН.
Питательные среды и выделение чистой культуры грибов
Выделение чистых культур, размножение мицелия осуществляли на глюко-зо-дрожжевой среде (Семенов, 1990). Музейные штаммы хранили на сусло-агаровой среде с использованием сусла 1,5-2 по Баллингу при температуре + 4С.
В качестве посевного мицелия использовали грибницу на зерне. Зерновой субстрат готовили общепринятым методом, включающим внесение 5% углекислого кальция и стерилизацию автоклавированием (Промышленное культивирование. .., 1978). В приготовлении субстратов для полупроизводственных опытов использовали смесь подсолнечной лузги и пшеничной соломы (1:1).
Для получения монокариотического мицелия зерновой субстрат в полипропиленовых пакетах засевали родительским дикариотическим мицелием исходных штаммов и инкубировали при 20С. Споровые отпечатки получали в бумажных изоляторах, надетых на молодые плодовые тела. Моноспоровые изоляты получали рассевом водной суспензии базидиоспор (20-40 колоний на чашку) на глюкозо-дрожжевой среде. Споры проращивали в термостате при температуре +25С. После появления единичных колоний мицелий изолировали в пробирки на скошенный агар. Монокариотическое состояние контролировали по отсутствию пряжек над клеточными перегородками гиф, просматривая колонии под микроскопом. Моноспоровые изоляты маркировали индексом «т».
Способы культивирования мицелия и плодовых тел вешенки
Полупроизводственные испытания проводили на базе комплекса ООО «Айлант», расположенного в пригороде г. Краснодара. Грибоводческий комплекс работает в круглогодичном режиме на отечественном оборудовании. Комплекс состоит из участка хранения и подготовки сырья, цеха по производству субстрата и формированию субстратных блоков, камер заращивания и плодоношения.
Субстрат для выращивания вешенки, в качестве которого была солома пшеницы, готовили методом пастеризации в сочетании с ферментацией в субстратной машине барабанного типа СМ-1 (ООО «Техник», г. Саратов). Солому измельчали до нарезки длинной 5-7 см. Технология приготовления субстрата предусматривала загрузку исходных материалов и увлажнение массы. Пастеризацию проводили при температуре 75-80С в течение 8 часов. Затем в течение 3 часов происходило остывание субстрата до 50-55С и данную температуру поддерживали около 12 часов, что способствовало развитию термофильных бактерий. Такая технология позволяет получить селективный субстрат с минимальным содержанием легкодоступных углеводов. Перед формированием блоков субстрат охлаждали до 23-25С и проводили выгрузку. Формирование субстратных блоков осуществляли при помощи механического пресса ПМСБ-1А (ООО «Техник», г. Саратов) производительностью до 3-х блоков в минуту. Норма внесения маточного мицелия составляла 3% от массы субстрата. После формирования блока в полиэтиленовых пакетах прорезали отверстия и переносили в камеру заращивания, а через 15-20 суток в камеру плодоношения (рис. 1).
Разработка селекционного процесса с использованием показателя активности лакказ
В процессе жизнедеятельности грибные клетки продуцируют экзофер-менты, которые воздействуют на субстрат и преобразуют его в доступные для усвоения вещества. Селекция грибов с целью отбора высокопродуктивных штаммов-продуцентов того или иного фермента связана с анализом значительного числа изолятов. Количество исследуемых вариантов зависит от степени вариации исследуемого признака внутри выборки. Так, при изучении продуцентов, относящихся к разным таксономическим группам, вариация изучаемого признака будет высокой даже при изучении небольшой выборки. В случае проведении отбора продуцентов внутри одной таксономической группы, например, биологического вида, необходимо значительно увеличивать размер выборки до 100 и более изолятов, чтобы получить существенную вариацию признака. Данное обстоятельство требует применения методов, позволяющих проводить массовый отбор из большого числа вариантов, которые должны быть одинакового возраста и выращены в одинаковых условиях.
В обзоре литературы был проведен анализ отечественных и зарубежных исследований по вопросам культивирования съедобных грибов, свидетельствующий о том, что в этой области достигнуты определенные успехи: хорошо изучен комплекс ферментов, участвующих в биодеградации субстратов. В основном эти исследования связаны с получением чистых ферментов и изучением фундаментальных основ генетики, в то время как вопросы прикладного характера по повышению продуктивности за счет улучшения генотипа остаются недостаточно изученными. Не ясной остается взаимосвязь между активностью разрушающими субстрат ферментами и продуктивностью, биохимическими процессами в субстрате при твердофазном культивировании и инициацией плодоношения. Значительным препятствием в выявлении косвенных факторов, определяющих продуктивность, остается отсутствие хорошо отработанных методов исследований ферментативной активности в условиях массового отбора штаммов. Изучению этих вопросов и посвящены исследования данного раздела работы.
В основе предлагаемого нами метода определения активности лакказ лежит денситометрическая оценка окрашенных продуктов реакции в результате взаимодействия секретируемого мицелием фермента и хромогенного субстрата. Учитывая сложную систему регуляции продуцирования грибами лигноцеллюлазных ферментов, оценку активности лакказы проводили на средах с добавлением компонентов близких по составу с используемыми при промышленном культивировании субстратами. Каждый
