Введение к работе
Актуальность темы
Вторичный метаболизм сапрофитно культивируемых микроорганизмов, в том числе мицелиальных грибов традиционно привлекает внимание исследователей, что обусловлено перспективностью промышленного использования их с целью получения большого разнообразия биологически активных веществ. К таким соединениям принадлежат различные алкалоиды, терпеновые соединения, полифенолы, гликозиды, специфичные пептиды и так далее.
Одной из самых изученных и распространенных групп алкалоидов, продуцируемых мицелиальными грибами, являются эргоалкалоиды, или алкалоиды спорыньи. Свое название они получили по тривиальному наименованию своих основных продуцентов – грибов-паразитов злаков из рода Claviceps (ergot, спорынья).
В настоящее время эргоалкалоиды занимают важное место в фармацевтической промышленности, так как используются в качестве фармакологических средств разнообразного направления и механизма действия. Считается, что большинство эффектов эргоалкалоидов объясняется их взаимодействием с рецепторами нейромедиаторов адреналина, норадреналина, дофамина и серотонина.
На сегодняшний день в мире выпускается более 80 лекарственных средств на основе эргоалкалоидов. Применяются эргоалкалоиды как индивидуально, так и в составе многочисленных комбинированных лекарственных препаратов. В России (ВИЛАР) на основе эргоалкалоидов разработаны препараты Абергин, Новокристин, Беллатаминал и Эргометрина малеат различного спектра действия.
Основным источником для получения эргоалкалоидов является спорынья пурпуровая (Claviceps purpurea (Fr.) Tul). В промышленном производстве гриб спорыньи используется как паразитарная культура и выращивается на посевах ржи. Данный способ имеет ряд существенных недостатков, к примеру, получение только одного урожая склероциев в год и значительная зависимость от погодных условий.
В настоящее время для получения эргоалкалоидов активно ведутся работы по изучению использования сапрофитной культуры гриба спорыньи.
Получение эргоалкалоидов, основанное на глубинном культивировании сапрофитных штаммов, имеет ряд преимуществ. Данный способ позволяет создать экологически чистое безотходное производство, получать стандартное сырье независимо от времени года, сократить время выращивания сапрофитной культуры, снизить производственные затраты и так далее.
Несмотря на многочисленность ранее проведенных исследований, эффективная технология получения пептидных эргоалкалоидов из сапрофитных культур отсутствует, или охраняется патентами, являясь собственностью коммерческих организаций. В Российской Федерации на сегодняшний день нет промышленных штаммов-продуцентов эргоалкалоидов в сапрофитных условиях культивирования.
Учитывая фармакологическую ценность эргоалкалоидов, разработка путей биотехнологического получения алкалоидов спорыньи является важным фактором обеспечения сырьем производства целой группы препаратов в фармацевтической промышленности.
Цель и задачи работы
Целью диссертационной работы являлось изучение гриба Claviceps purpurea (Fr.) Tul. в условиях сапрофитного культивирования, разработка методов селекции штаммов-продуцентов эргоалкалоидов и приемов экзогенной регуляции их продуктивности.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Получить мицелиальную культуру спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма BKMF-3602Д;
-
Изучить морфологические признаки и биохимические характеристики мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Исследовать возможность экзогенной регуляции гормональными эффекторами ростовых и биосинтетических процессов у мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Выбрать эффективные концентрации регуляторов роста для повышения реализации биосинтетического потенциала продуцирования мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Изучить влияние индуцированного мутагенеза физических (УФ облучение) и химических (колхицин) мутагенных факторов на морфологические признаки, ростовые и биохимические характеристики мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Изучить влияние селективных факторов на морфологические признаки и биохимические характеристики мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Изучить возможность сочетания методов направленной селекции и индуцированного мутагенеза для получения штамма гриба спорыньи с измененными морфологическими и биохимическими характеристиками, на примере мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Дать оценку морфологических и биохимических характеристик модифицированных линий мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Использовать экзогенное воздействие регуляторов роста в эффективных концентрациях для повышения алкалоидообразования у модифицированных линий мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма;
-
Разработать инструкцию по методам селекции сапрофитных штаммов спорыньи пурпуровой – продуцентов эргоалкалоидов.
Научная новизна работы
Изучена возможность максимальной реализации адаптивного потенциала продуктивности эргоалкалоидов в пределах генетической нормы реакции за счет воздействия рострегулирующими факторами на мицелий гриба спорыньи в условиях глубинного культивирования.
Для увеличения влияния на биосинтетическую активность впервые использовали фиторегуляторы, ассоциированные с транспортными биодеградируемыми наночастицами из полибутилцианоакрилата.
В работе впервые исследованы возможности сочетания методов направленной селекции и индуцированного мутагенеза с целью получения генетически измененных линий мицелиальной культуры спорыньи C. purpurea эргокриптинового штамма BKMF-3602Д, обладающих способностью к биосинтезу эргоалкалоидов в условиях in vitro.
Предложенная методология отбора вариантных линий, и экзогенной регуляции ростовых и биосинтетических процессов гриба C. purpurea позволяют получать эргоалкалоиды при глубинном способе культивирования.
Получен сапрофитный штамм C. purpurea – продуцент эргокриптина, зарегистрированный под №04868244-005-2009-Е24-09 ВИЛАР.
Практическая значимость работы
Разработана инструкция по методам селекции сапрофитных штаммов спорыньи пурпуровой – продуцентов эргоалкалоидов. Предложенная методология может быть адаптирована для получения генетически измененных линий других сапрофитных микроорганизмов.
Разработан способ реализации адаптивного потенциала продуктивности эргоалкалоидов в пределах генетической нормы реакции за счет воздействия рострегулирующими факторами на мицелий гриба спорыньи в условиях глубинного культивирования.
Получен сапрофитный штамм C. purpurea – продуцент эргокриптина, зарегистрированный под №04868244-005-2009-Е24-09 ВИЛАР, перспективный для проведения дальнейших работ по селекции и повышению продуктивности.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Способы экзогенного управления ростовыми и биосинтетическими характеристиками сапрофитного штамма гриба спорыньи регуляторами роста стимулирующего и ретардантного действия;
-
Эффективные дозы воздействия индукторами мутагенеза и оптимальная плотность конидий гриба спорыньи для получения вариантных линий;
-
Селективные факторы и их концентрации, обеспечивающие отбор линий с повышенной биосинтетической активностью;
-
Сочетание методов направленной селекции и индуцированного мутагенеза для получения сапрофитного штамма гриба спорыньи с измененными морфологическими и биохимическими характеристиками;
-
Инструкция по методам селекции сапрофитных штаммов спорыньи пурпуровой – продуцентов эргоалкалоидов И 04868244-007-2009 ВИЛАР.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 4-й Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва 2007), Симпозиуме «Биотехнология и медицина в 21 веке» в рамках Международного медицинского Форума «Индустрия здоровья» (Москва 2008), VI Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» (Москва 2008).
Связь задач исследований с проблемным планом НИР
Диссертационная работа выполнена в соответствии с «Программой фундаментальных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации» на 2001-2005 и 2006-2010 гг., а также согласно тематическому плану теоретических и прикладных научно-исследовательских работ ВИЛАР.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Объем и структура диссертации
