Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Цикл развития спорыньи пурпуровой (Claviceps purpurea), распространение эргоалкалоидов в природе 10
1.2. Спорынья как продуцент биологически активных веществ. Алкалоиды спорыньи 14
1.3. Биологическое действие эргоалкалоидов и их применение в медицине 15
1.4. Выращивание паразитарной спорыньи в системе гриб-растение, традиционная технология сапрофитного культивирования инфекционного материала спорыньи на твердых питательных средах 19
1.5. Сапрофитное выращивание и кинетика роста микроорганизмов в условиях глубинного культивирования 24
1.6. Влияние состава питательной среды на алкалоидообразование, рост и развитие микроорганизмов в условиях глубинного культивирования 26
1.7. Влияние других факторов на процессы развития микроорганизмов 30
1.8. Масштабирование процесса выращивания микробиологических объектов 31
Глава 2. Объекты и методы исследований 34
2.1 Получение мицелиально растущей культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма 34
2.2.Морфофизиологические исследования
2.3. Биохимические исследования 38
2.4. Фиторегуляторы 39
2.5. Условия асептики 39
2.6. Масштабирование процесса 40
2.7. Планирование экспериментов и методы статистической обработки данных 40
Глава 3. Получение мицелиальнои формы гриба спорыньи эргокриптинового штамма и изучение морфо физиологических показателей ее роста и интенсивности конидиогенеза 42
3.1. Получение мицелиальной культуры гриба Claviceps purpurea традиционным и предлагаемым способами 42
3.2. Морфологическая характеристика гриба спорыньи в сапрофитных условиях культивирования на твердом питательном субстрате 45
3.3. Морфологическая характеристика гриба спорыньи в искусственных условиях культивирования в жидкой питательной среде 48
3.4. Изучение динамики нарастания мицелиальной формы гриба спорыньи в условиях глубинного культивирования 51
Глава 4. Оптимизация условий выращивания мицелиальной суспензионной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма 62
4.1 Влияние объема и возраста инокулюма на рост и конидиогенез спорыньи 62
4.2 Влияние рН питательного субстрата на рост и конидиогенез спорыньи 65 4.3 Оптимизация минеральной части питательной среды 66
4.4. Оптимизация питательной среды по углеводному компоненту 67
4.5 Влияние экзогенных фиторегуляторов на конидиогенез и рост мицелиальной культуры гриба спорыньи 70
4.5.1 Влияние на продуктивность культуры регуляторов роста БАЛ и кинетина- представителей группы тщтокининов
4.5.2 Влияние регуляторов роста НУК и ИУК-представителей ауксиновой группы 73
4.5.3.Влияниегиббереллина(ГК) 75
4.5.4. Влияние фиторегуляторов ретардантного действия (ССС и 2-ХЭФК) 78
Глава 5. Изучение зависимости процессов конидиогенеза и роста мицелиальной суспензионной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма в оптимизированных условиях культивирования 83
5.1. Характеристика роста и конидиогенеза мицелиальной суспензионной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма 83
5.2. Изучение поглощения углеводного компонента из питательного субстрата мицелиальной суспензионной культурой гриба спорыньи эргокриптинового штамма 88
5.3. Изучение потребления кислорода мицелиальной суспензионной культурой гриба спорыньи эргокриптинового штамма 94
Глава 6. Изучение возможности процессов масштабирования роста мицелиальной суспензионной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма 100
6.1. Определение объемного коэффициента массопередачи, характеризующего обеспечение популяции
микроорганизмов кислородом 100
6.2 Выращивание инфекционного материала спорыньи эргокриптинового штамма в лабораторном
ферментаторе 102
Заключение 107
Выводы из список литературы
- Выращивание паразитарной спорыньи в системе гриб-растение, традиционная технология сапрофитного культивирования инфекционного материала спорыньи на твердых питательных средах
- Биохимические исследования
- Морфологическая характеристика гриба спорыньи в сапрофитных условиях культивирования на твердом питательном субстрате
- Влияние экзогенных фиторегуляторов на конидиогенез и рост мицелиальной культуры гриба спорыньи
Введение к работе
Актуальность темы. Осуществление целенаправленной биорегуляции продукционного процесса с использованием двух биологических систем: растения и культуры гриба, является уникальным этапом во всей производственной схеме получения лекарственных препаратов на основе эргоалкалоидов.
В настоящее время ВИЛАР является единственным в России и странах СНГ учреждением, обладающим комплексной технологией от создания селекционных штаммов спорыньи Claviceps purpurea (Fr) Tul до промышленного производства лекарственных препаратов.
В коллекции ВИЛАР имеются штаммы эрготаминового (BKMF-2641Д), эрготоксинового (ВКМР-2450Д), эргокриптинового (BKMF-3602Д) и эргокристинового (ВКМР-3401Д) типов. На основе всех перечисленных штаммов созданы ценные лекарственные препараты, находящие широкое применение в разных областях медицины.
Традиционное получение элитного инфекционного материала селекционных штаммов поверхностным способом на твердой питательной среде является трудоемким и длительным элементом во всей технологической схеме производства сырья спорыньи. Его продолжительность составляет около шести месяцев.
Для получения инфекционного материала необходимо разработать новые технологии, позволяющие ускорить и технологически усовершенствовать этот процесс, обеспечивающие сохранение конидиообразующих способностей мицелия. Одним из таких современных технологических разработок является способ глубинного культивирования.
Мицелиальная культура спорыньи является сложной
биологической системой двух взаимозависимых процессов: роста мицелия и конидиогенеза. Непременным условием проводимых исследований является повышение продуктивности репродуктивных процессов мицелия, выращиваемого в контролируемых условиях, так как источником инфицирования растений ржи служит суспензия конидий.
Представленная работа является частью исследований, связанных с решением данной проблемы.
Особая актуальность проводимых исследований очевидна в отношении селекционного штамма эргокриптинового типа, который является основой получения сырья для производства препарата
Абергин нейрогормонального действия. Продуктивность конидиогенеза этого штамма существенно уступает штаммам других типов : эрготаминовому, эргокристиновому и эрготоксиновому
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований является разработка способа получения инфекционного материала эргокриптинового штамма методом глубинного культивирования в виде мицелиально растущей культуры гриба спорыньи с высоким потенциалом конидиогенеза.
Поставленная цель достигается решением следующих задач:
изучить кинетику роста и конидиогенеза мицелиально растущей культуры гриба спорыньи;
изучить действие на рост мицелия и процесс конидиогенеза объема и возраста инокулята, рН питательной среды, минерального состава и углеводной составляющей питательной среды;
исследовать действие на процесс конидиогенеза и рост мицелия экзогенных фиторегуляторов;
- изучить кинетику поглощения углеводного компонента
питательной среды и скорости потребления кислорода культурой в
процессе роста;
отработать условия культивирования мицелия и конидиоспор гриба в лабораторном ферментаторе;
проверить в полевых условиях жизнеспособность конидиоспор гриба, выращенных в условиях глубинного культивирования;
-разработать инструкцию по получению инфекционного материала гриба спорыньи при глубинном способе выращивания.
Научная новизна. Впервые предлагается глубинный способ получения элитного инфекционного материала (ВКМР-3602Д) эргокриптиновой спорыньи для инфицирования посевов ржи.
Впервые изучена сопряженность роста мицелия и конидиогенеза при глубинном культивировании инфекционного материала эргокриптинового штамма спорыньи.
Изучено влияние ряда технологических показателей (объем и возраст инокулюма, рН питательной среды, коэффициент массопередачи) на рост и конидиогенез мицелия гриба спорыньи эргокриптинового штамма.
Впервые показана существенная зависимость конидиогенеза и роста от экзогенного гормонального фактора на культуре
промышленного штамма гриба спорыньи, выращиваемой в условиях глубинного культивирования.
Показана возможность получения инфекционного материала промышленного штамма гриба спорыньи в ферментаторах.
Научно-практическая значимость. На основании проведенных исследований разработана «Инструкция по получению элитного инфекционного материала спорыньи глубинным способом в колбах на качалке» (И-04868244-005-2006). Полученный материал служит основой для составления регламента на получение суспензии конидиоспор из мицелия гриба спорыньи, выращенного глубинным способом.
Разработанная технология позволяет усовершенствовать и ускорить процесс получения элитного инфекционного материала спорыньи для инфицирования посевов ржи спорыньей с использованием промышленных ферментаторов.
Инфекционный материал, полученный глубинным способом,
обладает такой же активностью по инфицированию посевов ржи, как
инфекционный материал, полученный традиционным
поверхностным способом.
Связь темы диссертации с планом научных исследований.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с
«Программой фундаментальных и приоритетных прикладных
исследований Всероссийского научно-исследовательского
института лекарственных и ароматических растений по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2003-2006 гг.»
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на 3-й Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (г.Москва, 2005 г), на VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва - Пущино, 2005 г), на юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию ВИЛАР (г.Москва, 2006 г.)
Работа выполнена в лаборатории отдела биотехнологии ГУ ВИЛАР.
Публикации.
Выращивание паразитарной спорыньи в системе гриб-растение, традиционная технология сапрофитного культивирования инфекционного материала спорыньи на твердых питательных средах
Мощное физиологическое действие алкалоидов спорыньи используется в практических целях на протяжении нескольких веков. Бще в 16 веке рожки (склероции) спорыньи использовались для ускорения родов. Однако, поскольку доза не была точно определена, применение этого препарата часто приводило к разрыву матки. Поэтому после 1822 года эргоалкалоиды не использовались при родах, хотя оставались средством остановки послеродовых кровотечений [105]. В настоящее время эргоалкалоиды продолжают играть важную роль в терапии. Основные области применения эргоалкалоидов - терапия болезни Паркинсона, нарушение мозгового и периферического кровообращения (мигрени, болезни Рейно и др.) и заболеваний, являющихся следствием повышенного уровня гипофизарных гормонов пролактина и соматотропина.
Эргоалкалоиды обладают высокой и разносторонней активностью. Считается, что большинство эффектов эргоалкалоидов объясняется их взаимодействием с рецепторами нейромедиаторов адреналина (норадреналина), серотонина и дофамина [73]. Это взаимодействие обусловлено структурным сходством последних с эрголиновым ядром эргоалкалоидов.
Многие эргоалкалоиды способны специфично блокировать а-адренорецепторы, осуществляющие возбуждение гладких мышц сосудов, главным образом, кожи, слизистых оболочек, органов брюшной полости, селезенки, сфинктеров желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря. Серотонинэргическим действием природных эргоалкалоидов объясняется клиническое проявление эрготоксикоза (воспаление конечностей, гангрена). Отравление спорыньей приводило к эпидемиям еще в средневековой Европе. Употребление в пищу продуктов, приготовленных из ржаной муки, содержащей склероции спорыньи, вызывало токсикозы у населения. Жертвами эрготизма во Франции в 944 году н.э. (в то время «огонь Святого Антония») стали около 40000 человек. Так же в 1935 году имел место случай массового отравления спорыньей. Отмечаются случаи эрготоксикоза в результате применения медицинских препаратов, содержащих эргоалкалоиды [99]. Эрготизм часто наблюдается у животных, так как кормовые злаки в большей степени поражаются продуцентами эргоалкалоидов, чем пищевые.
Модифицированные производные алкалоидов (например, бром-производные и гидрированные) в основном применяются в акушерско-гинекологической практике, при лечении заболеваний, связанных с нарушениями мозгового и периферического кровообращения, а также при нейрогормональных расстройствах.
Для профилактики и лечения мигрени активно используются гидрированные производные пептидных эргоалкалоидов - эрготамина, эргокристина, эргокорнина, эргокриптина, эти же препараты применяются при других нарушениях кровообращения - болезни Рейно, болезни Боргера, церебральном атеросклерозе и т.д.
В России на базе ВИЛАР разработан препарат Новокристин, в состав которого входит дигидроэргокристина мезилат, являющийся сосудорасширяющим средством. Новокристин представляет собой дигидроэргокристина мезилат, получаемый полусинтетическим методом из рожков спорыньи эргокристинового штамма. Одна таблетка содержит 0,00025 г дигидроэргокристина мезилата. Действующее вещество - альфа-адреноблокатор. Новокристин обладает выраженным центральным и периферическим альфа-адреноблокирующим действием: предупреждает развитие спазмов мозговых сосудов адренергической природы, оказывает гипотензивный эффект и замедляет частоту сердечных сокращений. Новокристин обладает слабыми серотонинолитическими, противосвертывающими и седативными свойствами, малотоксичен. Усиливает эффект сосудорасширяющих и антигипертензивных средств. Уменьшает побочные эффекты антидепрессантов. Применяют препарат у взрослых при нарушениях мозгового кровообращения, связанных с гипертонической болезнью, ранними стадиями атеросклероза сосудов мозга, последствиями черепно-мозговых травм, мигрени, нарушениях периферического кровообращения (болезнь Рейно и др.), а также с целью улучшения кровоснабжения мозга у людей пожилого возраста [25]. Для производства препарата Новокристин используется селекционный штамм спорыньи BKMF-3401Д - продуцент эргокристина (патент РФ № 2078084,1998 г.).
Другой препарат - беллатаминал разработан на основе фенобарбитала, эрготамина тартрата и суммы алкалоидов красавки. Для производства этого препарата используется селекционный штамм спорыньи ВКМР-2641Д-продуцент эрготамина и эргометрина (патент РФ № 1284231, 1994 г). По составу и действию беллатаминал аналогичен препарату белласпон (Bellaspon). Фармакологические свойства беллатаминала и его аналогов соответствуют действию их составных частей: препараты уменьшают возбудимость центральных и периферических адренергических и холинергических синапсов организма, оказывают успокаивающее влияние на ЦНС. Применяют при повышенной раздражительности, бессоннице, климактерических неврозах, нейродермитах, вегетативных дистониях [50].
Препарат эрготал представляет собой смесь фосфатов алкалоидов спорыньи, преимущественно эрготоксина и эргометрина. Применяли при маточных кровотечениях, вызванных атонией матки, для ускорения обратного развития матки в послеродовом периоде. Для производства препарата использовался селекционный штамм спорыньи ВКМР-2450Д1 - продуцент эрготоксиновых алкалоидов (патент РФ № 1251377,1994 г.).
В клинической практике большой популярностью пользуются препараты, выпускаемые на основе бромэргокриптина [12]. Препараты на основе этого соединения уменьшают секрецию пролактина и повышенную секрецию соматотропного гормона, подавляют физиологическую лактацию, нормализуют менструальную функцию, замедляют рост пролактином, уменьшают размеры и количество кист в молочной железе при маститах и мастопатиях, оказывают влияние на пост- и пресинаптические дофаминовые рецепторы подкорковых ядер, давая противопаркинсонический эффект и увеличивая двигательную активность. Их применяют при лечении гиперпролактинэмии и аденом, вырабатывающих пролактин, бесплодия у мужчин и женщин, акромегалии, для торможения лактации после родов, после абортов, при маститах и масталгии, а также при паркинсонизме. Бром-производные эргоалкалоидов получают путем модификации эрготоксиновых алкалоидов бромированием, например абергин (на основе 2-бром-а-эргокриптин мезилата+2-бром-р-эргокриптин мезилата) [23,40]. Характеристика препаратов, выпускаемых на основе бромэргокриптина, представлена в табл. 1.3.1.
Биохимические исследования
Биохимические исследования проводили с биомассой, высушенной до воздушно-сухого состояния. Для этого биомассу отфильтровывали через воронку Бюхнера, подвергали воздушной сушке при 26 С в течении 5 суток, после чего определяли ее сухую массу.
Определение содержания сахарозы в питательном субстрате проводили фенольным методом [26].
Для качественной характеристики испытуемого объекта на присутствие производных индола применяли химический экспресс-метод анализа с реактивом ван-Урка [6,18,19,41].
Экспресс-метод анализа на присутствие производных индола: около 1 мл культуральной жидкости помещали в пробирку на 20 мл, прибавляли 1 мл 4% раствора винной кислоты в 50% метиловом спирте и 4 мл реактива ван-Урка, при наличии производных индола происходит изменение окраски раствора от зеленого до синего и сине-фиолетового цвета.
Для качественной характеристики испытуемого объекта на присутствие аминокислот был использован ТСХ экспресс-метод анализа, адаптированный для одновременного сравнительного испытания более 10 индивидуальных образцов [49]. В качестве стандартных веществ использовали L-триптофан, аланин, L-валин, L-фенилаланин (Sigma, Fluka).
ТСХ экспресс-метод анализа на присутствие аминокислот: На пластину Силикагель 240 (Мерк) 20x20, наносили полосой около 1см по 50 мкл испытуемых образцов и растворы стандартных веществ, пластинку помещали в камеру со смесью растворителей: н-бутанол, уксусная кислота, дистиллированная вода (4:1:1). После того как фронт растворителей достигал края пластинки, ее вынимали, подсушивали около 1 мин на воздухе, обрабатывали раствором 0,2% нингиндрина в бутаноле. Присутствие аминокислот оценивали визуально, на уровне пятен свидетелей должны находиться соответствующие пятна розового цвета.
В исследованиях использовали следующие 4 группы экзогенных регуляторов роста: - цитокининовой природы - кинетин, 6- бензиламинопурин (БАЛ). - ауксиновой природы - индолилуксусная кислота (ИУК), 1- нафтилуксусная кислота (НУК). - гиббереллин (ПС) с преимущественным содержанием ГКЗ. - ретардантного действия - хлорхолинхлорид (ССС), кампозан (2-ХЭФК).
Фиторегуляторы цитокининовой и ауксиновой природы использовали в форме химических реактивов фирмы Sigma. Остальные регуляторы роста использовали в форме коммерческих препаратов: гибберелин (Россия), хлорхолинхлорид (ССС) и 2-хлорэтилфосфоновая кислота (2-ХЭФК, компазан, этефон) («Биттерсфельд», Германия). Концентрацию регуляторов роста рассчитывали по действующему веществу. Опыты проводили в трехкратной повторности.
Пересев каллусных и суспензионных культур проводили в стерильных условиях - в боксах-ламинарах. Питательные среды стерилизовали в автоклаве при давлении 0,5 ати., в течение 35 мин. Посуду, пробки, салфетки, инструменты стерилизовали в стерилизующем шкафу при температуре 180 С и в автоклаве ( при 2 ати.) в течении одного часа. Для стерилизации рабочих поверхностей и рук использовали 70% этиловый спирт.
Культивирование инфекционного материала спорыньи проводили в лабораторном ферментаторе АК -210 с рабочим объемом заполнения 7,0л.
Определение массообменных характеристик культивационных сосудов (колб, лабораторного ферментатора) проводили по методу статической дегазации [2] по оценке скорости десорбции углекислого газа из раствора бикарбоната натрия. О скорости десорбции судили по изменению величины рН модельного раствора, которая зависела от концентрации растворенного углекислого газа и концентрации бикарбонатного иона. Коэффициент массопередачи кислорода (Ко2) определяли, используя соотношение:
Планирование экспериментов и методы статистической обработки данных Планирование экспериментов осуществляли с использованием методов постановки факторных экспериментов [9]. При статистическом анализе опытов использовали дисперсионный, регрессионный и корреляционный методы оценки (определяли средние значения, стандартные отклонения, коэффициенты регрессии и корреляции) Использование математической модели обратимого равновесного РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ автокаталитического роста [2] позволило определить запас субстрата в питательной среде, а также коэффициенты: метаболизма вещества, полезного использования питательного субстрата, массопередачи по кислороду.
Морфологическая характеристика гриба спорыньи в сапрофитных условиях культивирования на твердом питательном субстрате
Биологическая продуктивность спорыньи по конидиям в естественных условиях распространения достаточно высокая. Пробы медвяной росы, взятые с экспериментальных участков посевов ржи, показали, что содержание конидий доходило до уровня 4,11-Ю8 шт в мл. Это так называемая природная биологическая продуктивность штамма по конидиогенезу. В условиях искусственного культивирования, как показывают проведенные эксперименты, этот показатель значительно ниже.
В естественных условиях гриб-паразит получает все необходимое для своего развития из растения хозяина. В нашу задачу входило, как можно эффективнее приблизить искусственно создаваемые условия культивирования к естественным природным.
В искусственных условиях выращивания стимулами, включающими определенную стадию онтогенеза, в частности, процесс конидиогенеза, могут быть различные факторы, среди которых существенными являются некоторые компоненты питательного субстрата, биологически активные вещества гормонального действия, а также другие факторы: объем и возраст инокулюма, рН питательной среды и т.д. Эта глава будет посвящена рассмотрению действия перечисленных факторов на стимулирование процесса конидиогенеза.
Проведенные опыты по прямому пересаживанию зрелой мицелиальной массы в возрасте 10-15 суток на новый питательный субстрат не дали положительных результатов. Был отмечен активный рост вегетативной массы мицелия, сопровождавшийся низким уровнем конидиогенеза. В поле зрения микроскопа на фоне большой массы мицелия отмечались лишь единичные конидии. В течение трех субкультиваций таким методом мицелий приобретал вид сплошного аморфного тела, не распадавшегося при встряхивании. Конидии полностью отсутствовали. Можно предположить, что обновление питательной среды для зрелого мицелия не приводило к стимуляции спорообразования. По-видимому, на обогащенной питательной среде конкурируют два способа вегетативного размножения: первый- конидиогенез, второй - разрастание вегетативной массы самого мицелия. Исходя из такого предположения, было скорректировано проведение последующих опытов.
Инокулятная масса представляет собой суспензию, состоящую из конидий и мелких фрагментов мицелия. Путем нескольких фильтраций мы достигли значительного преимущества конидий в культуральной жидкости. Исходный объем инокулята содержал определенную концентрацию конидий.
Был поставлен опыт, в котором изучали влияние дозы инокулюма, из расчета на 100 мл питательной среды, в трех градациях. Методом разбавления были достигнуты те значения по плотности инокулюма, которые изучали в опыте: -1мл. суспензии плотностью (0,8 -1,5)-105 шт / мл ; -1мл суспензии плотностью (20-30)-105 шт / мл.; -1мл суспензии плотностью ( 90-110) 105 шт / мл. При этом использовали питательную среду Тс. Анализ полученных данных проводили на 16 сутки роста. Данные представлены в табл.4.1.1. Таблица 4.1.1 Влияние плотности инокулюма на рост и конидиогенез мицелиальной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма Плотностьинокулюмапо конидиям,шт/мл Объеминокулюма,мл Масса мицелия сухая, г/л Конидии, шт/мл -105 Продуктивность конидий, шт/г
В результате этого опыта было установлено, что на фоне повышенных концентраций инокулята проходило более активное нарастание биомассы при достаточно интенсивном процессе конидиогенеза. Однако при пересчете числа конидий на сухую массу выращенного мицелия (биологическая продуктивность) можно видеть, что оптимальным объемом являлся инокулюм, равный 1 мл, соответствующий по плотности конидий (20-30)-105 шт/мл В этом варианте опыта продуктивность мицелия по конидиям соответствовала 6,4-10 шт/г.
При таком методе посадки в условиях контролируемого
культивирования гриб проходил цикл своего развития от нарастания мицелия до образования конидий. Вероятно, при этом соблюдалось определенное соотношение баланса биомассы и питательных веществ, что приводило к запуску процесса конидиогенеза.
Следовательно, посадка суспензионной культуры гриба спорыньи должна проводиться суспензией конидий с плотностью не менее (20-30)-105 шт/мл. 4.2. Влияние рН питательного субстрата на рост и конидиогенез спорыньи
Основным источником кислотности жидкой питательной среды являлась лимонная кислота, при внесении которой происходило сильное подкисление субстрата - до рН 2.0. Изучалось действие начальных значений рН в пределах от 4,0 до 7,0. В каждом из вариантов опыта рН питательного субстрата изменяли при помощи добавления аммиака. При постановке опыта использовали оптимальную концентрацию инокулята. Анализ полученных данных проводили на 20 сутки роста. Данные представлены в табл. (4.2.1).
Было установлено, что рост культуры возможен в диапазоне начальных значений рН 4,0-7,0. При этом наблюдалось стабильное нарастание биомассы, которое достигало по сухой массе 19,75г/л.
Оптимальным для конидиогенеза и роста мицелия гриба спорыньи является значение рН в пределах от 5.0 до 6,0. В приграничных областях кислотных и щелочных значений рН имело место снижение уровня конидиогенеза. Полученные экспериментальные результаты показывают, что изменением значения величины рН питательной среды можно существенно влиять на процесс конидиогенеза.
Для роста и развития спорыньи, как и для большинства микроорганизмов, требуется источник азота. В природных условиях гриб получает его из растения. В условиях искусственного культивирования в состав стандартной питательной среды вводили в качестве источника азота дрожжевой экстракт, являющийся нестандартным органическим соединением. Возникла необходимость выяснить, можно ли использовать для эргокриптинового штамма в качестве источника азота его минеральную форму.
Был поставлен однофакторный опыт, в котором изучали действие на мицелий минеральной формы азота в виде соли NH4NO3. Азот в данной соли присутствует в двух формах: нитратной и аммиачной. При постановке опыта учитывали уровень суммарного азота на фоне использования установленных ранее оптимальных концентраций инокулята и значения рН питательной среды.
Чтобы установить реакцию мицелия на минеральный азот, испытывали концентрации азота с достаточно большим шагом. В качестве контроля выступала среда Тс с дрожжевым экстрактом. Содержание углевода- сахарозы, в этой среде соответствовало 10%.
Влияние экзогенных фиторегуляторов на конидиогенез и рост мицелиальной культуры гриба спорыньи
Можно предположить, что такие изменения в онтогенезе развития суспензионной культуры гриба спорыньи могут быть вызваны тем, что концентрация сахарозы 6% создавала в питательном субстрате такое осмотическое давление, которое приводило к изменению метаболических процессов в клетке и синтезу таких продуктов метаболизма, которые способствовали активации конидиогенеза. Концентрация сахарозы, равная 6%, являлась начальной при создании в питательном субстрате оптимальных условий для продуктивности культуры.
Поэтому в дальнейших экспериментах по оптимизации условий выращивания культуры было решено использовать концентрацию сахарозы, равную 6 %.
Для подтверждения достоверности полученных результатов был проведен еще один опыт во времени, с более малым шагом контроля продуктивности культуры. После проведения данного опыта подтвердилась закономерность полученных результатов. Результаты представлены в табл. 4.4.3. Данные этого эксперимента будут использоваться в качестве контрольного варианта для всех представленных ниже опытов по влиянию экзогенных гормональных эффекторов на продуктивность культуры гриба. Сравнение проводили с лучшим показателем в контроле - на 26 сутки роста.
Влияние экзогенных фиторегуляторов на конидиогенез и рост мицелиальной культуры гриба спорыньи
Как отмечалось выше, в исследованиях, проведенных ранее [33], впервые был изучен гормональный статус суспензионной культуры гриба спорыньи. Было установлено, что мицелий в своем развитии синтезировал и выделял в питательный субстрат эндогенные фитогормоны ИУК, цитокинины, ГК и АБК. Было отмечено резкое увеличение содержания гибберелловых кислот на 12-15 сутки роста, что соответствовало периоду активного конидиогенеза.
Представлялось целесообразным исследовать влияние экзогенных фиторегуляторов гормонального действия и ретардантов на развитие и продуктивность суспензионного мицелия эргокриптинового штамма спорыньи. 4.5.1. Влияние на продуктивность культуры регуляторов роста БАП и кинетина- представителей группы цитокининов
С целью определения влияния каждого из перечисленных фиторегуляторов на репродуктивные и ростовые процессы мицелия спорыньи был проведены однофакторные опыты. БАП и кинетин испытывали в двух концентрациях 1,0 мг/л, и 2,0 мг/л. Полученные данные регистрировали в динамике роста с шагом в 3 - 5 суток (табл. 4.5.1.1).
Анализируя данные табл. 4.5.1.1, установлено, что при введении в питательный субстрат БАЛ в концентрации 1мг/л максимальное количество конидий в культуральной жидкости наблюдалось уже на 16 сутки роста и составляло 6,23-106 шт/мл при массе мицелия 14,60г/л, в то время как в контрольном варианте -только на 26 сутки роста (табл. 4.4.3). В последующие сутки в результате прорастания количество конидий резко снижалось. Микроскопический анализ показал, что этому времени соответствовало образование мелкого молодого мицелия, который не успевал развиться в зрелый мицелий. Таким образом, максимальная продуктивность конидий мицелием гриба по сравнению с контролем повышалась в 1,2 раза,
Увеличение концентрации БАЛ в два раза обеспечивало аналогичный эффект. Максимум конидиообразования, так же как и в варианте с концентрацией БАЛ 1мг/л, наблюдали на 16 сутки роста, он составлял 5,99-106 шт/мл при массе мицелия 14,88г/л. Максимальная продуктивность по конидиогенезу в обоих вариантах практически одинаковая.
Однако более эффективным для поддержания роста мицелия и достаточно интенсивного уровня конидиогенеза из изучаемых цитокининов оказался кинетин (табл. 4.5.1.2).
Анализ результатов (табл. 4.5.1.2) показал, что введение в питательный субстрат этого фиторегулятора уже в концентрации 1,0 мг/л стимулировало ростовые процессы. Уже на 12 сутки прирост биомассы составлял почти 16 г/л, в то время как в контрольном варианте этому сроку соответствовал прирост, равный 12,6 г/л, а в варианте с БАЛ - 13,6 г/л. При этом цикл развития культуры сокращался почти на 10 суток. Максимум продукции конидий приходился на 12 сутки роста и составлял 0,61 -109 шт/г. Увеличение концентрации кинетина в два раза еще больше стимулировало процесс конидиогенеза. Продуктивность мицелия увеличивалась при этом до 1.1-109 шт/г, т.е. практически в два раза, а по сравнению с контрольным вариантом - в 3,1 раза.
С целью определения влияния каждого из названных фиторегуляторов на ростовые и репродуктивные процессы мицелия спорыньи были проведены однофакторные опыты. НУК и ИУК испытывали в двух концентрациях 1,0 мг/л. и 2,0 мг/л. Данные регистрировали в динамике роста с шагом в 3 -5 суток. Результаты представлены в табл.4.5.2.1.
Из данных табл. 4.5.2.1 следует, что в вариантах с регулятором роста ИУК при его концентрации 1мл/л максимальное число конидий, а именно 9,61-Ю6 шт/мл при массе мицелия 14,34 г/л, наблюдалось на 16 сутки. Максимальная продуктивность конидий при этом составляла 0,67 -109шт/г и превышало контроль в 2 раза. Увеличение концентрации фиторегулятора в два раза незначительно снижало рост мицелия, но существенно подавляло конидиогенез. Таблица 4.5.2.1
Включение в питательный субстрат регулятора роста НУК также стимулировало ростовые и репродуктивные процессы мицелия, но в меньшей степени, чем при использовании ИУК. Максимальная продуктивность мицелия по конидиям при концентрации НУК 1,0 мг/л составляла 0,43 -109шт/г. Увеличение концентрации фиторегулятора в два раза приводило к некоторому снижению продуктивности мицелия (табл.4.5.2.2).
