Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
2.1. Перевиваемые линии клеток и методы их культивирования 13
2.2. Получение суспензионных культур клеток 28
2.3. Факторы, влияющие на размножение клеток в суспензии 31
2.4. Размножение вирусов в суспензии перевиваемых линий клеток 43
2.5. Проблема контаминации клеточных культур микроорганизмами и ее профилактика
2.6 Заключение 51
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53
3.1.1. Культуры клеток 53
3.1.2. Питательные среды, растворы и сыворотки 54
3.1.3. Вирусы 54
3.1.4. Микроорганизмы 54
3.1.5. Реактивы 55
3.1.6. Оборудование 56
3.1.7. Методы культивирования перевиваемых линий клеток 5 6
3.1.8. Методы культивирования и титрования вирусов в культуре клеток
3.1.9. Методы цитоморфологического и кариологического анализа 59
3.1.10. Методы бактериологического контроля б 0
3.1.11. Статистические методы 60
3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 61
3.2.1. Получение суспензионной перевиваемой линии клеток теcтикул поросенка
3.2.1.1. Характеристика и оценка банка перевиваемой линии клеток тестикул поросенка музея клеточных культур ГНУ ВНИИВ- 61 ВиМ
3.2.1.2. Трофическая адаптация отобранной популяции клеток ПТП к выращиванию в среде 0,25 % ФГМС с сывороткой крови КРС
3.2.1.3. Селекция и отбор пула перевиваемой линии клеток ПТП в условиях роллерной суспензии
3.2.1.4. Адаптация клеточной популяции ПТП/с к выращиванию суспензионным методом в лабораторных ферментерах
3.2.2. Оптимизация параметров суспензионного культивирования клеток ПТП-с/06
3.2.2.1. Изучение влияния концентрации сыворотки крови в ростовой среде и скорости перемешивания суспензии на жизнеспособ- 67 ность и рост клеток ПТП-с/06
3.2.2.2. Оптимизация посевной концентрации клеток ПТП-с/06 в суспензии
3.2.2.3. Оптимизация величины рН и аэрация среды при выращивании культуры клеток ПТП-с/06 суспензионным методом
3.2.2.4. Коррекция состава питательной среды в процессе суспензионного выращивания клеток
3.2.3. Стабилизация биологических свойств и паспортизация суспензионной культуры клеток ПТП-с/06
3.2.3.1. Пролиферативная стабильность клеток ПТП-с/06 при длительном культивировании в суспензии
2. Кариологическая стабильность клеток ПТП-с/06 при длительном культивировании в суспензии
3. Оценка биологических свойств суспензионной перевиваемой линии клеток ПТП-с/06 при культивировании в условиях ста- 82 ционарного и роллерного монослоя
4. Создание* банка суспензионной перевиваемой линии клеток ПТП-с/06 в жидком азоте и его оценка 85
1. Определение условий выращивания вирусов болезни Тешена и инфекционного гепатита собак в суспензии клеток ПТП-с/06
87
1.1. Влияние исходной концентрации клеток ПТП-с/06 на динамику накопления вируса болезни Тешена
Оценка возможности применения новых антибактериальных препаратов для профилактики контаминации при сус- 89 пензионном способе культивирования клеток
1. Определение минимальной подавляющей и минимальной бактерицидной концентраций ряда антибактериальных препаратов 90 в отношении санитарно-показательной микрофлоры
2. Определение максимально переносимой и минимальной цито-токсической концентраций ряда цефалоспориновых и фторхи- 92 нолоновых препаратов в ПЛК
3. Динамика антибактериальной активности цефтриаксона в процессе культивирования клеток ПТП-с/06
4. Оценка влияния цефтриаксона на вирусрепродуцирующие свойства и кариотип культуры клеток ПТП-с/06
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
5. ВЫВОДЫ 109
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО
7. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 111
8. ПРИЛОЖЕНИЕ 1 141
- Перевиваемые линии клеток и методы их культивирования
- Культуры клеток
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
Введение к работе
Развитие биотехнологии противовирусных вакцин во многом обусловлено достижениями в области выращивания культур клеток. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням животных до сих пор остается напряженной, несмотря на большой арсенал профилактических противовирусных препаратов [Бакулов И.А., 1998; Смирнов A.M., 2003]. В связи с этим актуальным является совершенствование биотехнологического процесса получения высоко эффективных вакцинных препаратов.
Наиболее перспективным в области крупномасштабного производства противовирусных вакцин для животных является суспензионный способ выращивания клеток и вирусов. Он имеет ряд важных преимуществ, основными из которых являются: возможность быстрого масштабирования, культивирование большого количества клеток и вирусов в одном ферментере с высокой плотностью популяции; равномерные условия для клеток и вирусов по всему объему выращивания; эффективный контроль и регулировка условий культивирования, высокая экономичность метода и др. [Самуйленко А.Я., 2000; Жестерев В.И. и др., 2003; Воронин Е.С., 2005].
Эффективность использования этого метода для биотехнологии противовирусных препаратов во многом определяется биологическими характеристиками выбранного клеточного субстрата, тщательностью отработки условий и параметров его выращивания, оптимизацией условий культивирования вируса с сохранением его иммунобиологических свойств [Danes B.S., 1957; Bryant J.С. и др., 1958; Katinger H.W., 1982; Maldarelli F., 1986; Балышева В.И. и др., 1995; Crouch J.H. др., 1998; Гунин М.А., 2000].
Однако, количество клеточных культур, способных к активной пролиферации при безопорном (суспензионном) способе выращивания, крайне ограничено. В тоже время отдельные стабильные варианты линий клеток даже одного происхождения, как правило, характеризуются совокупностью присущих только им ростовых, морфологических, генетических свойств, уровнем пермиссивности к вирусам [Owens О., 1953; Earle W.R., 1956; Опарин В.Н. и др., 1983; Pay T.W. и др., 1985; Saha S.N., 1988; Чермашенцева Н.А., 1996; Ojioto Е., 1999; Каталог РККК, 1999; Юрков С.Г., 2000; Benchautchavadze М. и др., 2006].
Несмотря на перспективность суспензионного метода выращивания клеток и вирусов, до сих пор производство ветеринарных вирусных вакцин (кроме вакцин противоящурной, антирабической и против блютанга) основано на использовании клеток, культивируемых в условиях стационарного или роллерного монослоя. Такими малопроизводительными, трудоемкими и неэкономичными способами осуществляется наработка вирусов классической чумы свиней (КЧС), трансмиссионного гастроэнтерита (ТГС), парвовируса свиней (ПВС), оспы овец, чумы КРС и др. [Балышев В.М. и др., 2000; Бузун А.И. и др., 2001; Грачев Д.В., 2004; Михалкин И.П. и др., 2005; Шишкова А.А. и др., 2007].
Коллекция клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ располагает значительным числом сублиний и трофовариантов клеток тестикулярной ткани поросенка, чувствительных к вирусам различных таксономических групп и имеющих потенции к росту в суспензионных условиях [Горшкова Т.Ф. и др., 1996; Вишняков И.Ф и др.., 1999; Юрков С.Г. и др., 2000; Балышев В.М. и др., 2000; Юрков С.Г. и др., 2000; Балышева В.И., 2005]. В связи с этим представляется актуальным получение перевиваемой линии клеток тестикул поросенка, способной к безопорному росту, оптимизация биотехнологических параметров ее суспензионного культивирования, изучение и стабилизация ее биологических свойств в процессе непрерывного суспензионного культивирования.
1.2. Цель и задачи исследований
Целью исследования являлось получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка, оптимизация условий суспензионного культивирования клеток данной линии и оценка их вирусрепродуцирующеи активности к адаптированным вирусам.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи: 1. Методом селекции получить новую сублинию перевиваемых клеток ПТП, способную к безопорному росту.
2. Оптимизировать условия суспензионного культивирования линии клеток ПТП-с/06 в лабораторных ферментерах (посевную концентрацию клеток, время культивирования, скорость перемешивания, условия аэрации, состав питательной среды) для обеспечения их максимального накопления.
3. Стабилизировать основные биологические характеристики клеток ПТП-с/06 и определить пассажный интервал использования клеток, в течение которого сохраняется их стандартность, включая кариологические показатели.
4. Определить вирусрепродуцирующую активность линии клеток ПТП-с/06 к адаптированным вирусам.
5. Изучить возможность использования ряда антимикробных препаратов для повышения уровня надежности процесса суспензионного культивирования клеток по фактору бактериальной контаминации.
1.3. Научная новизна
1. Получена новая суспензионная перевиваемая линия клеток тестикул поросенка ПТП-с/06, имеющая индекс пролиферации 4 - 6 в среде с 0,25 % ФГМС на солевом растворе Эрла (без солей кальция и магния) и 10 % сыворотки крови КРС.
2. Оптимизированы условия суспензионного выращивания перевиваемой линии клеток ПТП-с/06 в лабораторных ферментерах, обеспечивающие через 72 ча-са культивирования накопление клеток с плотностью 1,8 — 2,1 млн кл/см .
3. Установлена пермиссивность линии клеток ПТП-с/06 к вирусу болезни Тешена (штамм «Закарпатский») и вирусу инфекционного гепатита собак (штамм «Корнелл-2»).
4. Определена возможность применения антибактериального препарата - цеф-триаксона и изучена его стабильность в среде при различных методах культивирования клеток для профилактики контаминации клеточных культур.
1.4. Практическая значимость работы
1. Получена и стабилизирована по биологическим свойствам суспензионная пе ревиваемая линия клеток ПТП-с/06 и создан рабочий банк клеток изготовителя (БРКИ) для глубинного культивирования вирусов болезни Тешена и инфекционного гепатита собак.
2. Паспортизирована перевиваемая линия клеток ПТП-с/06, (паспорт утвержден директором ГНУ ВНИИВВиМ 01.02.2008 г.), и разработаны «Методические рекомендации по поддержанию и хранению перевиваемой суспензионной линии клеток ПТП-с/06», утвержденные в установленном порядке РАСХН.
3. Для профилактики бактериальной контаминации клеточных культур предложен цефтриаксон и схема его применения при различных способах культивирования клеток.
1.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
1. Культуральные, цитоморфологические, кариологические и вирусрепродуци-рующие характеристики суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка ПТП-с/06 и ее использование в вирусологической практике.
2. Биотехнологические параметры суспензионного способа культивирования указанных клеток ПТП-с/06.
3. Стабильность биологических свойств суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка ПТП-с/06 в процессе непрерывного суспензионного культивирования (15 пассажей).
4. Биологические свойства, включая антимикробную активность, антибиотика цефтриаксона при различных способах культивирования клеток (стационарный, роллерный монослойный и суспензионный способы).
1.6. Апробация и публикации результатов исследований
Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- Заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (2006 - 2008 гг.);
- Международной научно-практической конференции, 20-21 декабря 2007 г., ВНИТИБП «Научные основы производства ветеринарных препаратов», Щелково, 2007 г.;
- Заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, Щелково, 2008 г.
Материалы работы включены в отчеты по НИР ГНУ ВНИИВВиМ (01.02.04 и 08.01.03.06.).
Основные результаты диссертации опубликованы в 3 научных работах, в том числе 1 - в научном журнале по перечню ВАК. 1.7. Личный вклад
Основная часть диссертационной работы автором выполнена самостоятельно. Исследования по определению чувствительности линии клеток ПТП-с/06 к вирусам различных таксономических групп проводились на базе лабораторий «Эпизоотологии» и «Музейных штаммов». При выполнении отдельных фрагментов работы оказывали методическую или консультативную помощь сотрудники лаборатории «Культур клеток с музеем клеточных штаммов». Автор выражает искреннюю благодарность Юркову СТ., Смысловой Н.Ю., Кушнир С.Д., Анисимовой Л.И., Филатову А.В., Неверовской Н.С., Леонтьевой Н.А., Бурдинской О.Н., Стрижакову А.А., Балышеву В.М., Румянцевой К.А., Телко-вой Н.А., Мадыриной Н.В.
Перевиваемые линии клеток и методы их культивирования
Метод культуры клеток явился базой для решения многих общебиологических проблем и широкого развития различных направлений исследований в медицине, ветеринарии, биотехнологии и играет большую роль в вирусологии при изучении механизма репродукции и генетики вирусов, диагностике и профилактике вирусных инфекций [Цыбанов С.Ж., 1981; Бектемиров Т. А., 1991; Балашова Е.А., 1993; Алимов А. М., 1998; Герасимов В.Н., 1998; Курин-нов В.В., 2003; Жестерев В.И., 2003; Сергеев В.А., 2007].
Классификация клеточных культур по способу получения и по способу выращивания клеток представлена на рис. 1 и 2.
Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro приводит к резким изменениям их биологических свойств [Анджапаридзе О.Г., 1962; Голубев Д.Б., 1976].
Перевиваемые линии клеток (ПЛК) - клеточные системы, полученные в результате спонтанной или направленной (индуцированной) трансформации первичных или диплоидных клеток, выделенных из нормальных тканей животных, а также изолированные непосредственно из неопластических тканей [Гаврилов В.И., 1964; Новохватский А.С., 1979; Пианев Г.А., 1985; Дьяконов Л.П., 1988, 2000]. Общность ряда биологических свойств этих двух разных по происхождению клеточных систем, таких как способность к «бессмертию», не имеющие ограниченного срока жизни вне организма, культивированию и сохранению жизнеспособности после продолжительного хранения при сверхнизких температурах, длительное время оставляла открытым вопрос возможности их использования в биотехнологии противовирусных иммунобиологических препаратов. Переломным моментом, изменившим отношение к ПЛК, стали данные работ, продемонстрировавшие, что для многих линий клеток способность к перевиваемости не совпадает с их онкогенностью [Анджапаридзе О.Г. и др., 1962; Голубев Д.Б. и др., 1976; Фрешни Р. и др., 1989].
Культуры клеток
В работе использованы следующие культуры клеток:
- перевиваемая линия клеток тестикул поросенка ПТП, катал. № 10.1 «Коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ» (2000 г.);
- трофовариант перевиваемой линии клеток тестикул поросенка ПТП, культивируемый в среде с 0,5 % ФГМС на солевом растворе Эрла с добавлением 10 % сыворотки крови свиней (1991, 18 пассаж, музей клеточных культур ВНИИВВиМ).
- клональная перевиваемая линия клеток ПСГК-60/cl (перевиваемые свиные гетероплоидные клетки Sus scrofa), получена в 2007 г. Филатовым А.В. и соавторами во ВНИИВВиМ из перевиваемой линии клеток почки сибирского горного козерога, любезно предоставленная автором;
- сублиния перевиваемых клеток почки свиньи SK-6, во ВНИИВВиМ поступила из Польши в 1994 г. на уровне 22 пассажа (Кат. № 58.2 «Коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ» (2000 г.))
Культуры клеток получены из лаборатории «Культуры клеток с музеем клеточных штаммов».
Обсуждение результатов исследований
Основные практические достижения в области развития метода клеточных культур, в первую очередь, связаны с созданием широкого круга противовирусных вакцин. Массовое выращивание клеток в культуре является центральным звеном любого технологического процесса, основанного на использовании клеток животных, и, в первую очередь, производства вирусных препаратов.
Анализ применения клеточных культур в отечественной биотехнологии указывает на необходимость повышения эффективности использования клеточных систем, стандартизации условий культивирования и универсализации технологических процессов [Анджапарижзе О.Г. и др., 1962; Новохатский А.С., 1979; Адаме Р., 1985; Глинских Н.П., 1991; Дьяконов Л.П., 2000]. Одним из наиболее экономичных и перспективных способов выращивания клеточных субстратов является суспензионный метод культивирования [Голубев Д.Б. и др., 1976; Фрешни Р. и др., 1989; Курносов А.Н. и др., 1995; Воронин Е.С., 2005; Сергеев В.А., 2007]. В тоже время реализация даже хорошо известных способов всегда требует серьезной адаптации применительно к конкретным условиям культивирования определенных клеток и вирусов с тщательной отработкой и оптимизацией технологических режимов.
Широкое внедрение в биотехнологию суспензионного метода культивирования клеток и вирусов сдерживает ограниченное число клеточных систем, способных к активной пролиферации в безопорном состоянии. Действительно, как отмечал Курносов А.Н., к суспензионному способу культивирования адаптировано сравнительно небольшое количество клеточных культур, полученных из клеток нормальных тканей животных [Курносов А.Н. и др., 1987].
Суспензионные культуры клеток, используемые в производстве иммунобиологических препаратов, должны обладать следующими характеристиками: - обеспечивать высокий уровень пермиссивности в отношении адаптированных вирусов; - способностью активно пролиферировать во взвешенном состоянии при использовании экономичных и доступных питательных сред и сывороток;
- обладать стабильными биологическими характеристиками (морфология, ка-риотип) на протяжении длительного периода пассирования;
- не содержать посторонних агентов (вирусов, микоплазм, грибов, бактерий и клеток других линий);
- не обладать туморогенностью;
- хорошо сохраняться в жидком азоте длительное время в объемах, достаточных для получения биопрепаратов в течение многих лет [Гаврилов В.И., 1964; Юрков С.Г., 1983; ВОЗ, 1988; Юрков С.Г., 2000].
Данные научных работ, проведенных в рамках плановых НИР учеными ВНИИВВиМ по вопросам культивирования клеток и вирусов, позволили в качестве объекта исследований выбрать культуру клеток тестикул поросенка, имеющую потенциал размножения во взвешенном состоянии [Витина С.А. и др., 1990; Курносов А.Н. и др., 1995; Ставничий Е.В., 2003].
Исследования по теме диссертации проводились по трем основным направлениям:
