Введение к работе
Актуальность темы. Создание новых клеточных моделей для использования в медицине, в том числе в ветеринарии, является одним из перспективных направлений развития современной науки. В настоящее время лаборатории многих стран занимаются изучением вопросов, связанных с использованием клеток гонад животных в качестве новых клеточных систем для применения их в биотехнологической и фармацевтической промышленности при разработке, тестировании и производстве новых медицинских препаратов.
На сегодняшний день при изучении сперматогониальных клеток (СпК) млекопитающих, в основном, используются лабораторные животные: мыши (Hamra et al., 2004; Kanatsu-Shinohara et al., 2005b), крысы (Hamra et al., 2005; Ryu et al., 2005), хомяки (Kanatsu-Shinohara et al., 2008), а также собаки (Yeunhee Kim et al., 2008). В последнее время появились публикации, в которых объектами исследований являются СпК сельскохозяйственных животных, таких как: крупный рогатый скот (Izadyar F. et al., 2003; Aponte et al., 2008), мелкий рогатый скот (Honaramooz et al., 2003; Rodriguez-Sosa et al., 2006), свиньи (Dirami et al., 1999; Коржикова, 2002; Савченкова и др., 2006; Goel et al., 2007; Han Su Young et al., 2009). Проводятся работы по выделению и изучению клеток этого типа у человека (Sadri-Ardekani et al., 2009; Lim et al., 2010).
Культуры клеток, полученные в результате длительного культивирования сперматогоний грызунов, были названы линиями половых стволовых (GS) клеток. Получение линий GS-клеток актуально для ветеринарной биотехнологии при изучении инфекционных болезней. Известно, что многие вирусы обладают тропизмом к половым клеткам. В связи с этим сперматогонии хряка представляют собой новую клеточную систему для вирусологических исследований. Однако, несмотря на заметные успехи в данной области, культура СпК хряка еще не создана. Одной из причин этого является недостаточное знание условий культивирования сперматогоний типа А хряка, и влияния различных факторов роста на половые клетки in vitro.
В настоящее время установлено, что факторы роста и цитокины играют важную роль как в поддержании СпК in vitro, так и в индукции их полипотентного статуса (de Rooij and Mizrak, 2008). Среди них выделяют глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), идентичный фактору, ингибирующему активность дифференцировки (DIA) (Smith et al., 1988; Williams et al., 1988). Некоторые из этих факторов продуцируют клетки, которые присутствуют в семеннике: клетки Сертоли (КС), Лейдинга, миоидные, стромальные и гематопоэтические клетки, а также некоторые стабильные клеточные линии, используемые для культивирования ЭСК. Влияние экстраклеточных факторов на СпК является результатом их динамичного взаимодействия с внутриклеточными транскрипционными регуляторами. Такими внутриклеточными маркерами недифференцированного состояния являются три гена транскрипционных факторов, необходимые для поддержания полипотентного статуса стволовых клеток: POU5F1 (Oct3/4), Nanog, Sox-2.
В связи с тем, что сведений по влиянию различных факторов роста на половые клетки in vitro недостаточно, а в отношении СпК хряка они только начинают формироваться, данное направление исследований является перспективным для развития как биомедицинских технологий, так и сельскохозяйственной биотехнологии.
Цель и задачи исследований. Цель данного исследования: изучение влияния условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
выделить из тестикул и подобрать условия поддержания в культуре сперматогоний типа А хряка;
изучить влияние клеток Сертоли на сперматогониальные клетки хряка in vitro;
определить роль микроокружения (фидерных слоев) в культивировании сперматогониальных клеток хряка;
оценить роль фактора, ингибирующего активность дифференцировки DIA/LIF, в поддержании сперматогониальных клеток хряка in vitro;
провести сравнительный анализ экспрессии генов-маркеров в полученных клетках in vitro;
оптимизировать условия криоконсервации сперматогоний хряка.
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые была исследована возможность длительного (до 100 сут включительно) культивирования сперматогоний типа А хряка.
Впервые изучены факторы, влияющие на эффективность выделения сперматогоний типа А хряка. Исследовано влияние очистки, основанной на адгезивных свойствах клеток, на эффективность получения чистой культуры сперматогоний хряка.
Впервые установлено, что КС, продуценты GDNF, при совместном культивировании способствуют как процессу одновременного размножения и получения клонов сперматогониев хряка, так и их дифференцировке в направлении сперматогенеза, о чем свидетельствует обнаружение в них продуктов экспрессии генов PLZF, Nanog и VASA.
Впервые определено, что использование фидерного слоя, представленного клетками STO, и добавление в культуру кондиционированной среды из клеток BRL (клетки печени крысы Buffalo), которая содержит фактор, ингибирующий активность дифференцировки, позволяет поддерживать сперматогонии хряка в культуре длительное время.
Работа имеет как фундаментальную (новые возможности для моделирования развития половых клеток in vitro с целью изучения молекулярных механизмов и биологической основы этого процесса), так и практическую направленность.
Практическая ценность работы. Разработаны условия для длительного поддержания сперматогоний типа А хряка в культуре. Исследованы факторы, влияющие на эффективность выделения сперматогоний.
Применение КС на начальных этапах культивирования сперматогоний типа А хряка позволяет получать половые клеточные культуры свиньи, а добавление DIA в культуру способствует длительному культивированию сперматогониальных клеток хряка и созданию полипотентных клеточных линий.
Разработан эффективный метод сохранения половых клеток из семенников хряков. Учитывая доступность материала и эффективность данного метода, разработанные условия сохранения сперматогоний хряка будут полезны для других видов животных.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
IV-ой Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, 2011г.; на школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины», Санкт-Петербург, Институт цитологии РАН, 2011г.; на Международной виртуальной Интернет - конференции "Биотехнология. Взгляд в будущее", Казань, ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана, 2012г., а также неоднократно обсуждались и получили одобрение на Методической комиссии и Ученом совете ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии.
Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы. Участие соавторов отражено в совместных публикациях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 стр., содержит 3 табл., 36 рис. (в т.ч. 26 фотографий, 5 диаграмм), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 210 источников, в т.ч. 194 на иностранном языке.
