Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ В СЕЛЕКЦИИ ВИШНИ
1.1. Выращивание верхушечных меристем в культуре in vitro; 7
1.1 а. Стерилизация 8
1.1 б. Введение эксплантов в культуру in vitro 11
1.1 в. Пролиферация или собственно размножение 17
1.1 г. Ризогенез 19
1.1 д. А даптация растений вишни к условиям in vivo 23
1.2. Влияние ионов тяжелых металлов (ТМ) на
развитие растений; .27
1.2 а. Фитотоксичностъ ионов цинка (Zn); 28
1.2 б. Фитотоксичностъ ионов кобальта (Со); 30
1.2 в. Фитотоксичностъ ионов свинца (РЬ) 31
ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ, УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ, ОБЪЕКТЫ, МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Цель и задачи исследований; 35
2.2. Объекты исследований, исходный материал; 36
2.3. Методы исследований; 46
2.4. Условия проведения исследований 50
ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ВИШНИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
3.1. Этап стерилизации исходного материала ; 51
3.2. Сроки введения эксплантов вишни в культуру in
vitro; 52
3.3. Подбор питательных сред на этапах пролиферации и ризогенеза вишни в культуре in vitro; 62
3.3 а. Модификация питательной среды Мурасиге и Скуга для культивирования эксплантов вишни; 63
3.3 б. Изучение влияния состава питательных сред Шенка, Гамборга (В-5) и Блейдза на микро
растения вишни 70
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (ТМ) НА ЭКСПЛАНТЫ ВИШНИ 78
4.1. Влияние Zn на рост и развитие микрорастений вишни в культуре in vitro; 79
4.1 а. Влияние Zn на приживаемость (жизнеспособность) микрорастений вишни в культуре in vitro; 79
4.1 б. Влияние Zn нарост и развитие микрорастений вишни в культуре in vitro 81
4.2. Влияние Со на рост и развитие микрорастений вишни в культуре in vitro; 92
4.2а. Влияние Со на приживаемость (жизнеспособность) микрорастений вишни в культуре in vitro; 92
4.2 б. Влияние Со нарост и развитие микрорастений вишни в культуре in vitro 92
4.3. Влияние Pb на рост и развитие микрорастений вишни в культуре in vitro; 99
4.4. Химический анализ микрорастений вишни, выращенных на селективных питательных средах с ионами тяжелых металлов....99
ГЛАВА 5. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ИОНОВ ТМ НА ЗЕЛЕНЫЕ ЧЕРЕНКИ ВИШНИ 104
5.1. Влияние ионов Zn на состояние зеленых черенков сортов вишни; 105
5.2. Влияние ионов Со на состояние зеленых черенков сортов вишни; 108
5.3. Влияние ионов РЬ на состояние зеленых черенков сортов вишни;
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 121
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 124
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 125
- Выращивание верхушечных меристем в культуре in vitro;
- Цель и задачи исследований;
- Этап стерилизации исходного материала
Введение к работе
Вишня - широко распространенная косточковая плодовая культура. При правильном подборе сортов с учетом их биологических особенностей и соблюдении требований агротехники она рентабельна и экономически выгодна. Вишня всегда пользовалась большой популярностью у населения за раннее созревание, хорошие вкусовые качества и урожайность. Основные регионы выращивания вишни в СНГ - Украина, Белоруссия, Молдова, Краснодарский край, Поволжье, Центральная и Центрально-черноземная зоны России.
Однако в последние годы произошло значительное снижение урожайности и сокращение площадей, занимаемых этой культурой. Основные причины этого - недостаточное количество сортов, способных к вегетативному размножению, снижение всхожести семян из-за грибной и бактериальной инфекции (Жуков, Желтотрубова, Степанова, Чмир,1988; Кашин, Борисова, Павлова, 1998; Колесникова, Джигадло, 1998).
Для восстановления культуры необходимо провести ряд мероприятий: иметь сорта и подвои устойчивые к грибной и бактериальной инфекции, а также экономически эффективную технологию производства посадочного материала с использованием микроклонального размножения, позволяющую производить в достаточном количестве растения для научных и производственных целей (Колесникова, Колесников, Муханин, 1986; Джигадло, Джигадло, Голяева,1988; Колесникова, Джигадло, 1998; Мотылева, Сосни-на,1998). В связи с тем, что в сортименте вишни нет устойчивых к вирусной и микоплазменной инфекции сортов и подвоев, их необходимо создать селективным путем на новой генетической основе. Микроклональное разможе-ние косточковых культур имеет ряд трудностей из-за их склонности к клонированию, что делает актуальным оптимизацию методики на каждом этапе культивирования. Для успешного выращивания растений вишни в культуре
in vitro необходимо оптимизировать существующие методики микрокло-нального размножения. При микроклональном размножении необходимо учитывать генетические особенности сортов. Очень важно подобрать оптимальный состав питательной среды, на которой можно успешно выращивать экспланты вишни в зависимости от их происхождения. Перспективность метода микроклонального размножения растений в системе производства оздоровленного посадочного материала высших категорий качества не вызывает сомнений (Высоцкий, 1998; Джигадло, 1988; Вовк, 2000). Микроклональное разможение косточковых культур имеет ряд трудностей из-за их склонности к клонированию, что делает актуальным оптимизацию методики на каждом этапе культивирования.
Наряду с этим, надо учитывать нарастающее техногенное загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами (ртуть, свинец, кадмий, мышьяк, цинк, медь, никель). Соединения тяжелых металлов длительное время сохраняют высокую подвижность и токсичность. Это ведет к загрязнению сельскохозяйственной продукции и делает ее опасной для потребления. Соединения ТМ оказывают отрицательное влияние на их генотип и состояние.
Определение степени и характера влияния ионов тяжелых металлов на рост и развитие плодовых растений представляет большой научный и производственный интерес. Особое значение приобретает подбор сортов, устойчивых к наличию тяжелых металлов в почве.
Выращивание верхушечных меристем в культуре in vitro
Процесс микроклонального размножения состоит из ряда последовательных операций, каждая из которых имеет свою специфику (Деменко В.И., 1997). Их делят обычно на четыре этапа:
отбор исходного растения, стерилизация и вычленение эксплантов, создание оптимальных условий для их развития на питательной среде;
снятие апикального доминирования и стимуляция развития пазушных почек, микрочеренкование побегов, сохраняющих апикальное доминирование;
укоренение микропобегов и адаптация пробирочных растений к переносу в нестерильные условия;
перенос пробирочных растений в нестерильные условия, адаптация и выращивание полученных растений в закрытом грунте (Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур, 1995).
Названные этапы соблюдают также в процессе микроразмножения культуры вишни.
Для микроклонального размножения плодовых культур обычно используют вегетативные почки с однолетних побегов на стадии распускания (Borkowska, 1983; Sclutti, Morini, 1993). Однако Высоцкий (1989), Упадышев (1997) рекомендуют для введения в культуру in vitro вишни использовать покоящиеся почки.
Введение экспланта в культуру in vitro является одним из наиболее ответственных этапов клонального микроразмножения. Апексы часто гибнут от присутствия сапрофитной микрофлоры, ожога стерилизующими веществами, механического повреждения клеточной структуры при вычленении или же при несоответствии питательной среды. По данным некоторых исследователей максимальное инфицирование (свыше 50%) характерно для эксплантов, выделенных в декабре, марте и апреле (Михальчик, Деменко, 1988).
Стерилизация исходного материала является сложной задачей, т.к. поверхностные ткани растения заражены бактериями, грибами и их спорами. При выборе стерилизующего агента необходимо выполнить два условия -нейтрализовать микрофлору и не повредить ткань растений. Стерилизующее вещество не должно обладать способностью проникать в растительные ткани.
Выбор стерилизующего вещества зависит от чувствительности растительного материала. Оно должно легко удаляться из тканей. Некоторые стерилизаторы легко разрушаются и легко выделяются, например, гипохлорид натрия - разрушаясь в тканях, дает активный хлор (стерилизующее начало) и гидроксид натрия (легко выводится из ткани). Эффективность стерилизующих веществ повышается, если добавить небольшое количество детергента или ПАВ (поверхностно активного вещества) в количестве 0,05%. Для этого используют Твин-20, Твин-40 (Крамаренко, Катаева, Скворцов, 1988; Шели-фост, 1993; Плаксина, 1996; Подорожный, 1996; Деменко, 1997; Вовк, 2000; Матушкина, 2000; Zimmerman, 1978; James, 1980; Cossio, 1981; Ruzic, 1996;).
В практике микроклонального размножения используют следующие стерилизаторы:
- гипохлорид кальция (9-10% раствор, 5-30 мин, эффективность хорошая, удаляется легко);
- гипохлорид натрия (2% раствор, 5-30 мин, эффективность хорошая, удаляется легко);
- перекись водорода (10-12%о раствор, 5-15 мин, эффективность хорошая, удаляется легко);
- бромная вода (1-2% раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая, удаляется легко);
- нитрат серебра (0,8-1% раствор, 5-30мин, эффективность хорошая, удаляется трудно); - сулема (0,1-1% раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая, удаляется плохо);
- 70% этанол (1-2мин, удаляется хор, используется как предварительный
стерилизатор);
- диацит (этанол меркури хлорид и борная кислота с цетил пиридин бромидом в качестве детергента - 0,1-1%раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая, удаляется хорошо) (Деменко, 1997).
Стерилизацию начинают с подготовки исходного материала, заключающейся в удалении кроющих чешуи и промывке в течение 20-30 мин. проточной водой (Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур, 1995).
Стерилизующие вещества используют в различной экспозиции. Такие как 0,1% диацит - 3-5 мин, 0,1% сулема - 7-10 мин. Последующая обработка 70% этиловым спиртом в течение 2-3 секунд способствует увеличению числа чистых и способных к дальнейшему развитию апексов на 20-30% (Методические рекомендации по применению искусственной культуры тканей и органов в генетико-селекционных работах с плодовыми, 1987; Джигадло, Джи-гадло, 1988; Джигадло, 1989; Ковальчук, Боровикова, 1991; Tukey, 1933; Zimmerman, 1978; Jamess, 1980).
Цель и задачи исследований
Для повышения эффективности получения оздоровленного посадочного материала высших категорий качества используют культуру in vitro. Необходимость такой методики очевидна, требуются специальные разработки, касающиеся оптимальных условий культивирования вишни в культуре in vitro. В связи с происходящим постоянным техногенным загрязнением окружающей среды необходимо исследовать растения вишни на устойчивость к воздействию ТМ - выделить сорта, которые меньше накапливают их. Это необходимо в связи с происходящим техногенным загрязнением окружающей среды.
Цель исследований - оптимизация технологии выращивания растений вишни методом верхушечных меристем in vitro, и выделение сортов устойчивых к повышенному содержанию ионов ТМ в почве.
В задачи исследований входило:
- изучить и отработать оптимальный способ поверхностной стерилизации эксплантов;
- выявить наиболее оптимальные сроки для введения в культуру in vitro;
- подобрать оптимальный состав питательной среды для стимулирования пролиферации;
- изучить темпы развития микрорастений и процесса ризогенеза на среде Смирнова и Мурасиге и Скуга в зависимости от происхождения;
- выделить сорта, устойчивые к действию повышенных концентраций ионов ТМ в почве.
Объекты исследований. Объектами исследований послужили сорта вишни, внесенные в Государственный реестр для использования в Центральном и Центрально-черноземном регионах (районированные): Гриот Остгейм-ский (клон 2), Любская, Тургеневка, Ровесница, Шоколадница, Мценская, Новелла, Орлица, Жуковская, Ливенская, а также перспективные сорта: Студенческая, Комсомольская, Кистевая, Быстринка, Антрацитовая, Орлея, Ор-колия, Тихоновская, Трофимовская, Муза, Журавушка, Стойкая, Превосходная Колесниковой; сорта черешни: Поэзия (внесен в Госреестр), Аделина, Фея, Сюбаровская (перспективные).
Сорта для исследований были подобраны с учетом их происхождения и различных хозяйственно биологических признаков. Руководствуясь тем, что в современной классификации сортов учитывают их видовую принадлежность, морфологические признаки, биологические свойства, хозяйственные признаки, в сортименте вишни Юшев (1986) выделил 6 групп сортов:
I. С. vulgaris - сорта с признаками вишни обыкновенной (Андоль-ская, Владимирская, Гриот Лигеля, Гриот Остгеймский, Любская);
II. С. vulgaris х С. avium - сорта с доминированием признаков черешни (Бастрад Черешня, Ширпотреб Черная, Май-Дюк, Жуковская);
III. С. vulgaris х С. avium - сорта с доминированием признаков вишни обыкновенной (Дюшес Палюо, Красавица Рибокура, Подбельская, Ребатская Красавица, Юбилейная, Аморель королевская, Краса Севера, Крупноплодная Горшкова, Шпанка курская);
IV. С. vulgaris х С. fructicosa — сорта с доминированием признаков вишни обыкновенной (Ахтубинская Красавица, Гриот украинский, Десертная волжская, Лотовая, Мономах);
V. С. vulgaris х С. fructicosa - сорта с доминированием признаков вишни степной (Костычевка красная, Герой ранних, Кистевая, Плодородная Мичурина, Уралочка, Надежда Крупская, Полжир, Рубиновая);
VI. С. vulgaris - сорта вишни обыкновенной (Расплетка).
Антрацитовая. Выведен из сеянцев сорта Ширпотреб чёрная от свободного опыления с доминированием черешни.
Дерево низкорослое, высотой до 2,5 м, с широкораскидистой средней густоты кроной. Характер роста и тип плодоношения - промежуточный между кустовидной и древесной формами вишни. Плодоносит преимущественно на однолетних приростах. Сорт скороплодный, первый урожай дает на 4-й год. Отличается высокой зимостойкостью.
Цветение в средние сроки. Сорт самоплодный, но хороший опылитель для него Владимирская. Плоды больше среднего размера, массой 3,8 г, округлые, темно-бордовые, почти чёрные. Сок интенсивно окрашен, плодоножка средней длины; косточка мелкая, свободная. Мякоть плотная, тёмно-бордовая, приятного кисло-сладкого вкуса. Плоды среднепозднего срока созревания, их используют в свежем виде и для переработки. Урожайность высокая.
Быстринка. Выведен от скрещивания сортов Жуковская и Золушка (вишне-черешня х вишня степная с доминированием вишни обыкновенной). Дерево среднего размера, с шаровидной, приподнятой кроной средней густоты. Тип плодоношения смешанный. В пору плодоношения вступает на 4-й год.
Этап стерилизации исходного материала
Одним из наиболее трудных этапов микроклонального размножения является этап введения эксплантов в культуру из-за высокой контоминации среды.
Стандартные условия стерилизации заключаются в 25-30 минутной промывке проточной водой, затем в течение 4-7 с. обработке 70% этиловым спиртом, промывке автоклавированной бидистиллированной воде; далее следует обработка 0,1% раствором сулемы в экспозиции 4-7 мин, и двукратная промывка автоклавированной бидистиллированной водой по 7 минут (Джи-гадло, Джигадло, 1988; Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур, 1995).
В качестве стерилизующих агентов многие исследователи используют 0,1% диацит (Ковальчук, Боровикова, 1991) в экспозиции 3-5 минут, 1%-й дихлорамин в течении 10 минут (Бленда, Радиолова, 1991). Деменко (1997), обобщив материал по стерилизующим веществам, говорит о преимуществах и недостатках следующих реагентов: гипохлорид кальция, гипохлорид натрия, перекись водорода, бромная вода, нитрат серебра, сулема, этанол 70%, диацит. Нами использовался 0,1% раствор сулемы в экспозиции 2-4 минуты в зависимости от состояния эксплантов.
Нами была оптимизирована методика введения в культуру in vitro, в частности этап стерилизации исходного материала. В качестве стерилизующего агента использовался 70% этанол в экспозиции 3-4 с, затем промывали исходный материал 4 мин автоклавированной бидистиллированной водой, далее подвергали материал обработке сулемой 4 мин, дважды промывали автоклавированной бидистиллированной водой по 2 минуты. В итоге затраты времени снизились с 50 - 60 минут до 12 минут. Процент инфицирования питательной среды по нашей методике приближен к нулю (таблица 1).
Из таблицы видно, что у сортов Быстринка, Гриот Остгеймский, Любская, Студенческая, Ровесница, Тургеневка не было инфицированных растений и их было значительно меньше у других по сравнению со стандартной методикой.
