Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 9
1.1. Подсолнечник как объект хозяйственного использования 9
1.1.1. Ботаническая характеристика подсолнечника {Helianthus annus L.) 9
1.1.2. Народнохозяйственное значение подсолнечника 11
1.1.3. Основные болезни подсолнечника 13
1.2. Культура ткани подсолнечник in vitro 16
1.3. Клеточная селекция растений на устойчивость к болезням 24
1.3.1. Использование патогенов в клеточной селекции растений на устойчивость к болезням 24
1.3.2. Использование культурального фильтрата патогена при клеточной селекции растений на устойчивость к болезням 26
1.4. Механизм устойчивости растительных клеток к действию биотических факторов 33
Глава II. Объект и методы исследований 41
2.1. Объекты исследований 41
2.2. Методы исследований 42
2.2.1. Условия культивирования 42
2.2.2. Клеточная селекция подсолнечника in vitro 43
2.2.3. Биохимические и морфофизиологические исследования 44
2.2.4. Статическая обработка результатов исследований 45
Экспериментальная часть
Глава III. Экспериментальный морфогенез в культуре изолированных тканей и органов подсолнечника in vitro 47
3.1. Оптимизация условий получения хорошо растущей стерильной культуры подсолнечника 47
3.2. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от первичного экспланта 49
3.3. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от исследуемого генотипа 51
3.4. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от гормонального состава питательной среды 53
3.5. Морфофизиологические характеристики каллусных культур 59
3.6. Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенез каллусной ткани подсолнечника различных генеотипов 61
Глава IV. Клеточная селекция подсолнечника на устойчивость к патогену Sclerotinia sclerotiorum 67
4.1. Получение культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum 68
4.2. Фитотоксичность культурального фильтрата гриба Sclerotinia sclerotiorum 72
4.3. Клеточная селекция подсолнечника 77
Глава V. Роль фенольных соединений в адаптации каллусных культур подсолнечники in vitro к действию экзометаболитов гриба Sclerotinia sclerotiorum 84
5.1. Количественный состав фенольных соединений в первичном экспланте и каллусной ткани подсолнечника культивируемой в стандарных и стрессовых условиях 86
5.2. Качественный состав фенольных соединений в первичном экспланте и каллуснои ткани подсолнечника культивируемой в стандарных и стрессовых условиях 91
5.3. Изменение полифенолоксидазы в первичном экспланте и каллуснои ткани, культивируемой в стрессовых и стандартных условиях in vitro 99
Глава VI. Экспресс-биологический метод и его применение для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к белой гнили (Sclerotinia sclerotiorum) 103
Выводы 107
Список использованной литературы 109
- Культура ткани подсолнечник in vitro
- Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от первичного экспланта
- Клеточная селекция подсолнечника
- Экспресс-биологический метод и его применение для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к белой гнили (Sclerotinia sclerotiorum)
Культура ткани подсолнечник in vitro
В литературе описано большое количество экспериментов по изучению влияния различных факторов на морфогенез и каллусогенез подсолнечника. Исследователи использовали в качестве первичных эксплантов для индукции морфогенеза, каллусогенеза и регенерации такие ткани подсолнечника как: незрелые зародыши, семядольные листья, гипокотильные и эпикотильные сегменты, корни, настоящие листья (Калашникова, Миронова, Короткова и др., 2004; Попов, Юшкина, Шарыпина, 2006; Озигит, Гозукирмизи, Семиз, 2006; Nestares, Zorzoli, Mroginski et al.b 1996, 2001; Berrios, Gentzbittel, Serieys et ah 1999; Ozyigit, Bajrovic K, Gozukirmizi et al, 2002). Исходя из литературных данных можно заключить, что основная работа по культуре ткани подсолнечника проводится на изолированных незрелых и в меньшей степени на зрелых зародышах. Этот метод получи название эмбриокультура, который позволяет преодолеть постгамную несовместимость растений. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его на питательных средах в условиях in vitro.
Так в работе Monika Jack и Leslaw Przywara получили соматические эмбриоиды из незрелых зародышей четырех тестируемых генотипов подсолнечника. Зародыши на стадии «торпеды» длиной 3-4 мм отличались наибольшей активностью. Их стерилизовали, выделяли из зародыша половину каждой семядоли, часть центральной оси и помещали в темноту при 25С на две недели на питательную среду, содержащую соли по МС (Murashige and Skoog,1962), витамин В5 (Gamborg et ah, 1968), 1 г/л гидролизата казеина, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л MES, 6 мг/л 6-БАП , 0,8 % агара и 2 % сахарозы при рН среды 5,8. По истечении этого срока экспланты переносили в климакамеру на 16-часовой фотопериод при той же температуре {Monika Jack, Leslaw Przywara., 2000).
В отделе молекулярной и клеточной биологии растений Лион, исследовали возможность культивирования in vitro незрелых зародышей подсолнечника, полученных от самоопыления. В работе использовали 6 инбредных линий. Зрелые соцветия самоопыляли и на 4-21 дн. после опыления незрелые зародыши изолировали из завязей, поверхностно стерилизовали и помещали на среду МС или среду В5 , содержащие различные концентрации бензиладенина и индолилуксусной кислоты. Пробирки с эксплантатами ставили в климакамеры с 16-часовым светопериодом, освещенностью 1500 лк и температурой 2бС. Образующиеся из зародышей хорошо сформированные проростки переносили в почвенные смеси и выращивали в теплице. Показано, что незрелые зародыши размером 0,1-5 мм, сформировавшиеся в результате самоопыления, могут нормально развиваться на искусственных питательных средах. Для их развития требовалась последовательная пересадка развивающихся зародышей на среды с изменяющимися соотношениями БАП и ИУК. Весь процесс от получения незрелых зародышей до образования фертильных растений занимал 4-5 мес, из них 4-5 нед. приходились на культуру in vitro. Полученные фертильные растения-регенеранты по фенотипу не отличались от исходных инбредных линий {Freyssinet М., Freyssinet С, 1988). Предлагаемые методы могут включены в схему классической селекции подсолнечника.
Аналогичные исследования были проведены Пушкаренко А.Я., Игнатова С.А., Лукьянюк С.Ф. с изолированными зародышами подсолнечника (гибрид Одесский 122). Использование питательных сред с различным содержанием БАП и НУК позволило авторам получить до 10% растений-регенерантов. Лучшее развитие стеблевого органогенеза отмечено на среде Мурасига-Скуга с пониженным содержанием гормонов - БАП и НУК (0,05 мг/л) (Пушкаренко, Игнатова, Лукьянюк , 1990).
Таким образом, применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для преодоления постгамной несовместности растений при отдаленной гибридизации, для получения растений из неполноценных зародышей, при работах по клеточной селекции а также с целью размножения ценных гибридов.
Наряду с эмбриокультурой широкое распространение в культуре in vitro получило направление, связанное с регенерацией растений из первичной и пересадочной каллусной ткани, полученной из различных типов эксплантов, а также непосредственно из культивируемых дифференцированных клеток. Так в центре экологической физиологии растений Буэнос-Айрес, исследовали возможность культивирования различных тканей подсолнечника на искусственных питательных средах с целью получения растений-регенерантов. Семена подсолнечника гибридного происхождения поверхностно стерилизовали и проращивали в условиях in vitro для получения стерильных проростков, с них изолировали гипокотили и семядоли, которые выступали в качестве первичных эксплантатов для получения культуры тканей. Эксплантаты помещали на модифицированную среду Мурасига-Скуга или Миллера, содержащую различные добавки регуляторов роста. Культуры выращивали при 16-часовом светопериоде (1,8 Вт/м ) и температуре 24 С. Показано, что на среде Миллера, дополненной 0,5 мг/л кинетина и 2 мг/л нафтилуксусной кислоты, эксплантаты, полученные из гипокотилей и семядолей проростков в течение 1-2 пассажей, образовывали хорошо пролиферирующий структурированный каллус. При переносе такой каллусной ткани на среду, содержащую 5 мг/л кинетина и 1 мг/л НУК, в ней дифференцировались меристематические зоны, корни и почкоподобные структуры. При выращивании каллусной ткани, полученной из семядольных эксплантов на среде с повышенным содержанием тиамина в ней возникали глобулярные эмбриоиды. Однако перенос таких эмбриоидов на свежие среды и попытки получить из них целые растения-регенеранты к успеху не привели (Буэнос-Айрес, 1986).
Kraater R, Friedt W. проводили исследования на селекционных линиях подсолнечника: BaSo, Noba, НА89, female 499, female 500 и R427. Семена изучаемых линий стерилизовали и культивировали на модифицированной питательной среде Мурасига и Скуга 1 недельные проростки разрезали на сегменты и помещали на свежую питательную среду МС, содержащую тиамин, мезоинозит, БАП, сахарозу и агар, рН 5,4-5,6. В опыте изучали сегменты котиледонов, гипокотилей (1 см), корней (1 см) и верхушки проростков, которые культивировали на питательной среде МС без регуляторов роста и с уменьшенным содержанием сахарозы. Все культивируемые ткани подсолнечника формировали каллусную ткань, которая не в всех вариантах была способна к регенерации растений. Сегменты гипокотилей линий BaSo, female 400 и R429 образовывали только побеги, а других линий - корни. Растения-регенеранты были получены только от линий Baso, Noba, НА89 ufemale500 {Krauter R, Friedt W., 1991).
Lupi M.C., Bennici A., Locci F., Gennai D. исследовали регенерацию побегов в культуре верхушечных меристем и каллусов подсолнечника. В качестве исходного материала использовали сорт масличного подсолнечника Аргентарио. Авторы отмечали рост каллусной ткани и дифференнирацию побегов. Каллус легче всего образовывася из тканей гипокотильных и семядольных эксплантов на средах, содержащих 2 мг/л нафтилуксусной кислоты и 0,5 мг/л бензиладенина. Ткани эксплантатов подсолнечника могут непосредственно образовывать дополнительные побеги, если их выращивать на средах, содержащих 0,5-2,0 мг/л БАЛ. Максимальная частота регенерации растений из тканей гипокотиля наблюдалась при выращивании эксплантов на среде с 1,5% сахарозы. Образующиеся на эксплантатах или в каллусной ткани побеги пересаживали на среду с 2 мг/л кинетина, 5 мг/л гибберелловой кислоты и 1 мг/л БАЛ. На такой среде каждый побег образовывал до 10 дополнительных побегов. Побеги укореняли на среде без регуляторов роста {Lupi, Bennici, Locci, Gennai, 1987).
Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от первичного экспланта
В качестве первичного экспланта использовали сегменты гипокотилей и семядольных листьев, изолированные с 5-дневных проростков подсолнечника, а также зрелые зародыши. Все исследуемые экспланты культивировали на питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей НУК в концентрации 2,0 мг/л и кинетин 1,5 мг/л. Данные концентрации были выбраны нами исходя из литературных источников(ІУІЄ5/агеу, Zorzoli, Mroginski et al, 1996, 2001; Berrios, Gentzbittel, Serieys et al. 1999; Ozyigit, Bajrovic K, Gozukirmizi et al, 2002). Установлено, что через 3-5 дней с момента культивирования эксплантов в данных условиях, происходило увеличение размера эксплантов по длине и ширине, а затем на 10-й день начинался процесс каллусогенеза. Причем каллусная ткань образовывалась по всей поверхности первичного экспланта, интенсивность которой находилась в четкой зависимости от исследуемого первичного экспланта (рис.5). Так, наибольшей способностью к каллусогенезу обладали гипокотильные сегменты, а наименьшей - семядольные листья. Изолированные зародыши занимали промежуточное положение (рис.4). Данная ответная реакция различных эксплантов была характерна для всех исследуемых генотипов.
Необходимым условием использования каллусных клеток с целью повышения генетического разнообразия и улучшения сельскохозяйственных культур является их способность к регенерации растений. Поэтому особое внимание следует уделять изучению процессов образования каллусной ткани и зависимости его от генетических и физиологических факторов.
Каллусную ткань получали из всех перечисленных в методике первичных эксплантов. Культивирование проводили на стандартной среде, содержащей макро- и микроэлементы, витамины, сахарозу по прописи Мурасига и Скуга, а также НУК (2,0 мг/л) и кинетин (1,5 мг/л). Все экспланты располагали на питательной среде горизонтально и культивировали на свету. Экспериментально установлено, что экспланты всех изучаемых сортообразцов были способны формировать каллусную ткань. Как правило, этот процесс начинался с дедифференцировки клеток, находящихся в местах среза (в случае семядолей и гипокотилей) или в нижних клеточных слоях изолированных зародышей, которые находились в непосредственном контакте с питательной средой. Спустя 10-14 дней клетки полностью дедифференцировались и во всех исследуемых вариантах образовывалась каллусная ткань. Следует отметить, что способность первичных эксплантов к каллусогенезу была различной, и находилась в зависимости от исследуемого генотипа. Наибольшей пролиферативной способностью обладали экспланты сорта Кубанский 93, а наименьшей - ВК 580. Сортообразец ВК 653 занимал промежуточное положение (рис. 6).
Полученные результаты дают возможность сделать вывод относительно влияния генотипа на процессы каллусогенеза и регенерации. Хорошо известно, что высокая способность к каллусогенезу генетически детерменирована. Генотипическое влияние на частоту индукции каллусогенеза для ряда культур отмечали ранее многие исследователи (Сидоров, 1988; Калашникова, 1993, 2003; Нгуен, 1995; Озигит, Гозукирмизи, Семиз, 2006; Schmitz, 1989; Berrios, Gentzbittel, Serieys et al 1999).
Клеточная селекция подсолнечника
Работа по клеточной селекции была нами проведена на каллусной ткани подсолнечника. В качестве стресс-фактора использовали КФ патогена полученного по выше изложенной методике (глава 4 раздел 1). В питательную среду КФ патогена добавляли в концентрации 5%, 15%, 25% и 35% от конечного объема. Культивирование каллусной ткани на селективных средах проводили в течение VI пассажей. Результаты исследований представлены на рисунках 30-32.
Из результатов следует, что для всех изучаемых генотипов характерна общая закономерность в поведении каллусных тканей в стрессовых условиях, а именно: с увеличением концентрации КФ в питательной среде уменьшается прирост каллусной ткани. Причем при длительном культивировании каллуса в стрессовых условиях прирост биомассы клеток в течение первых 4-х пассажей существенно снижается. Главным образом это присходило за счет частичной (фрагментарной) гибели каллусной ткани и уменьшения способности клеток к пролиферации. При дальнейшем культивировании каллусной ткани на селективных средах (V и VI пассажи) наблюдалась его стабилизация, что проявлялось в несущественном изменении прироста клеток.
При более детальном рассмотрении поведения клеток каллусной ткани в стрессовых условиях в зависимости от исследуемого генотипа следует отметить, что генотипические особенности оказывают существенное влияние на поведение клеток в стрессовых условиях. Так для генотипа Кубанский 93 во всех вариантах присутствия различных концентраций КФ патогена в среде было характерно уменьшение прироста каллусной ткани в среднем на 40 80 50% уже на первых пассажах. При дальнейшем культивировании клеток на селективных средах существенного изменения в приросте каллусной ткани не было отмечено. Следует отметить вариант, где КФ патогена присутствовал в питательной среде в концентрации 35%. Как следует из рисунка 30, в течение всего селекционного цикла прирост каллусной ткани не изменялся. Все это свидетельствует о том, что данная концентрация стресс-фактора оказывает ингибирующий эффект на ранних этапах культивирования, что не приводит к запуску механизмов адаптации дедифференцированных клеток к действию стресс-фактора. ;
Для генотипа ВК 580 (рис. 31) в стрессовых условиях формирование каллусной ткани и ее пролиферативная активность изменялась в процессе культивирования незначительно. Причем, как и для генотипа Кубанский 93 при повышенных концентрациях КФ патогена (35%) в питательной среде прирост каллусной ткани не изменялся.
Особо следует отметить генотип ВК 653, для которого низкие концентрации КФ (5%) оказали стимулирующий эффект,1 который проявлялся в резком увеличении прироста каллусной ткани на первых этапах культивирования. Причем, наши данные полностью согласуются с результатами, полученными на пшенице, картофеле, моркови (Калашникова, 2003), свидетельствующие о стимулирующем эффекте.низких концентраций селективного фактора. Присутствие стресс-факора в концентрациях 25 и 35% приводило к ингибированию пролиферативной активности клеток, что проявлялось в полной гибели культивируемой ткани (рис.32). Эти результаты свидетельствуют о низкой адаптационной способности каллусных клеток сортообразца ВК 653 к действию культурального фильтрата патогена Sclerotinia sclerotiorwn. v.
Для выяснения различий в ответной реакции клеток на стресс, нами были проведены исследования по изучению морфофизиологических характеристик каллусных клеток, культивируемых в контрольном и опытном вариантах (рис.33-35). Исследования показали, что каллусные ткани изучаемых генотипов, состояли из гетерогенных клеток по форме и размеру. В процессе длительного культивирования эти характеристика менялись. В контрольном варианте, как правило, ткань состояла из крупных клеток овальной формы или слегка продолговатой, содержащих большую вакуоль и маленькое ядро. В вариантах присутствия стресс-фактора на ранних этапах культивирования клетки не существенно отличались от контрольного варианта. Однако при длительном выращивании каллусной ткани в стрессовых условиях морфофизиологические характеристики клеток менялись. Так в стрессовых условиях клетки, как правило, сохраняли овальную форму, однако значительно уменьшались в размере. Такие изменения были характерны для сорта Кубанский 93 и генотипа ВК 653, а для генотипа ВК 580 клетки в процессе культивирования в стрессовых условиях не меняли свою структуру.
Исходя из полученных результатов, было сделано предположение, что уменьшение размера клеток под действием стресс фактора происходит, вероятно, из-за изменения строения клеточной стенки. Одной из причин, вызывающих такие ответные реакции клеток на стресс, может быть изменение метаболизма фенольных соединений (Раскалиева, 2001; Калашникова, 2003), в состав которых входит и лигнин, выполняющий определенную защитную роль в растениях при воздействии фитопатогенов (Загоскина и др., 1994; Запрометов, 1996; Зайцева, 2007; Lofty, Fleuriet, 1989; Valluri, Treat, 1991). Для доказательства данного предположения необходимо провести изучение фенольного комплекса в клетках, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях.
Экспресс-биологический метод и его применение для оценки устойчивости различных генотипов подсолнечника к белой гнили (Sclerotinia sclerotiorum)
Для ускорения селекционного процесса возникает необходимость тестирования генотипов на устойчивость к абиотическим или биотическим факторам окружающей среды на уровне первичных эксплантов или семян. Для такого тестирования в практике широко применяется экспресс-метод, позволяющий экономить время и площади, необходимые для исследований, а также за короткий промежуток времени, возможно, протестировать значительное число исследуемых генотипов. На основе полученных результатов (биометрические или биохимические показатели) можно рекомендовать отдельные генотипы для включения их в селекционный процесс. Экспресс-метод по устойчивости растений к факторам биотической природы с успехом проводят на пшенице, огурце, рисе, аспарагусе и других культурах (Ткачева, 2007; Raducanu, Vranceanu, Hagima, 1999; Pontaroli et al, 2000; Van Becelaere, Miller, 2004).
Объектом наших исследований служили семена 7 сортов подсолнечника - Кубанский 930, Кубанский 86, Триумф, Юпитер, ВК 653, ВК 580 и Кубанский 93. Семена выращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной 100%-ным культуральным фильтратом патогена (Sclerotinia sclerotiorum) (методика получения КФ изложена в главе 2 «Материал и методы исследований»). Контролем служил вариант проращивания семян на воде. В каждом варианте было проанализировано по 100 семян. Повторность опыта трех кратная.
Учет результатов проводили на 7-дневных проростках, при этом оценивали следующие показатели: длина корневой системы, высота надземной части, число проросших семян. На основании полученных результатов нами была рассчитана фитотоксичность КФ для исследуемых генотипов. Полученные результаты представлены в таблице 10.
Данная таблица свидетельствует о том, что исследуемые генотипы обладают различной ответной реакцией на действие экзометаболитов гриба (Sclerotinia sclerotiorum). Можно предположить, что чем меньше фитотоксичность, вызываемая КФ патогена, тем большей устойчивостью обладают данные генотипы к действию КФ, а следовательно и к самому патогену. Наши исследования подтверждают данные, полученные другими авторами (Ткачева, 2007; Pontaroli et al, 2000).
Исходя из методических указаний по определению устойчивости растений к действию стрессовых факторов (Удовенко, 1973), нами были проведены соответствующие расчеты градаций исследуемых генотипов подсолнечника по устойчивости к склеротиниозу.
Согласно формуле (7) значения устойчивости каждого генотипа позволяют распределить их по группам:
2 = l + 3,3lgn{l), где г - число групп (или классов) устойчивости;
п - количество вариантов;
г = 1 + 3,3 lg7 = 3,78
Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемые генотипы можно распределить на 4 группы по устойчивости.
Определение величины интервала между группами рассчитывают по формуле (8):
К = Х Х (8), г
где Хтах - максимальное значение варианты;
Xm;n - минимальное значение варианты;
Расчетные данные позволили установить интервал между группами, который равен 11,7.
Суммируя полученные данные все исследуемые генотипы можно раз-бить на 4 группы по устойчивостьи к КФ патогена (Sclerotinia sclerotiorum). Значение групп будет следующим:
I - свыше 62,5% - неустойчивые;
II - 50,8-62,5% - слабо устойчивые;
III- 39,1-50,8% - средне устойчивые;
IV- 27,4-39,1% - более устойчивые;
Изученные генотипы распределяются по группам следующим образом: + неустойчивые к склеротиниозу: Кубанский 930, ВК 653; + слабо устойчивые к склеротиниозу: не выявлены; + средне устойчивые к склеротиниозу: Триумф, Кубанский 86; + более устойчивые к склеротиниозу: Кубанский 93, Юпитер, ВК 580. Как было отмечено в главе 5, фенольные соединении играют определенную роль в иммунитете растении. Исходя из этого, были проведены исследования по содержанию растворимых фенольных соединений в 7-дневных проростках подсолнечника, культивируемых в нормальных и стрессовых условиях. Результаты представлены в таблице 11.
Таким образом, на основании полученных результатов нами была установлена обратная корреляция между значением во сколько раз изменяется содержание растворимых фенольных соединений в тканях проростков опытного варианта (КФ) по отношению к контролю (К) с фитотоксичностью (значение корреляции равен 0,8). Эти данные еще раз подтверждают, что фенольные соединения играют защитную роль в растениях при воздействии факторов биотической природы.
