Введение к работе
1.
Актуальность темы. Технология клонирования в большинстве
развитых стран мира открывает существенные возможности животноводству,
биотехнологии, фармацевтической промышленности, производству
трансгенных животных, сохранению исчезающих видов животных, медицине человека (Niemann et al. 2005, Campbell et al. 2007, Robl et al. 2007, Duszewska et al. 2010).
В животноводстве технология клонирования может быть направлена на
размножение уникальных, высокоценных и выдающихся животных в целях
улучшения селекционного процесса, быстрого получения оптимизированных
генотипов, а также для сохранения исчезающих пород домашних и диких
животных. Не менее важно создание трансгенных животных с измененным
обменом веществ в направлении повышения качества и эффективности
продукции, животных-продуцентов биологически активных веществ
лекарственного назначения, а также животных, генетически устойчивых к ряду инфекционных заболеваний.
Метод межвидового клонирования, в частности пересадка ядер
соматических клеток человека в энуклеированные яйцеклетки крупного
рогатого скота открывает возможности получения культуры стволовых
плюрипотентных эмбриональных клеток и является наиболее
перспективным направлением в репаративной медицине.
Несмотря на то, что в последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, эффективность технологии получения клонированных зародышей крупного рогатого скота, равно как и других домашних животных остается крайне низкой, часты случаи аномального эмбрионального развития, а рожденное потомство менее жизнеспособно.
Причиной такого положения является то, что от момента получения клеток источников цитопластов и клеток-доноров кариопластов до получения зародышей и живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и большое количество непонятых механизмов, которые влияют на развитие реконструированных зародышей. Кроме того техника переноса ядер соматических клеток с использованием в качестве цитопластов ооцитов крупного рогатого скота с самого начала базировалась на методических приемах оплодотворения in vitro. Однако в связи с тем, что отдельные принципиальные положения клонирования не прошли испытания временем, ученые занятые данной проблемой, вынуждены возвращаться к изучению каждого этапа клонирования вновь.
Более того, в мировой литературе есть сведения о получении клонированных зародышей и потомства крупного рогатого скота (Cibelli et al., 1998; Kato et al., 1998), однако, механизмы позволяющие воспроизвести подобные технологии, полностью не раскрываются. Особенно это касается условий подготовки цитопластов, способов их реконструирования, параметров слияния питопласта и кариопласта, режимов и условий
активации, а также приемов синхронизации клеточного цикла соматических клеток.
Цель исследований. На основе изучения факторов, влияющих на результативность отдельных этапов клонирования, моделировать технологию получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro методом переноса ядер соматических клеток в энуклеированные оопиты.
В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:
определить параметры синхронизации бычьих эмбриональных фибробластов в фазе G0/G1, с целью их последующего использования в качестве кариопластов;
определить эффективность «слепой энуклеации» оопитов, в зависимости от расположения первого направительного тельца относительно хромосом на стадии метафазы второго деления мейоза и времени созревания оопит-кумулюсных комплексов;
исследовать влияние времени культивирования in vitro и гормона пролактина на созревание оопит-кумулюсных комплексов и положение первого полярного тельца относительно метафазной пластины в оопитах коров;
изучить влияние питохалазина Б на реконструирование оопитов методом переноса ядер соматических клеток крупного рогатого скота;
установить оптимальные параметры электрослияния питопласта и кариопласта с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf (Германия);
изучить влияние пролактина на развитие партеногенетических и клонированных эмбрионов крупного рогатого скота.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние бычьего пролактина на выделение и миграцию первого полярного тельца относительно метафазы II, на эффективность «слепой энуклеации», а также на развитие клонированных эмбрионов в зависимости от продолжительности созревания оопитов крупного рогатого скота in vitro. Впервые показано отрицательное действие цитохалазина Б на устойчивость к микроманипуляциям оопитов, созревших в среде, содержащей пролактин и определены параметры электрослияния эмбриональных фибробластов и энуклеированных оопитов с использованием мультипоратора фирмы Eppendorff.
Практическая значимость. Вследствие усовершенствования способа синхронизации клеточного цикла эмбриональных фибробластов на стадии G0/G1 и созревания оопит-кумулюсных комплексов, а также методов «слепой энуклеации» и электрослияния питопластов и кариопластов повышена эффективность технологии получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота.
Апробация результатов диссертации. Основные материалы диссертации доложены на научных конференциях Цента биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ в период с 2009 по 2011 гг.,
а также на научных конференциях: 8-я Международная научная конференция-школа ВИЖ "Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных" (Дубровипы, 2009), региональная конференция молодых ученых Курганской ГСХА "Молодежный научный потенциал в инновационном развитии уральского региона" (Курган, 2009), Международная научно-практическая конференция Уральской государственной академии ветеринарной медицины: «Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии» (Троицк, 2011), I Всероссийская конференция "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, питоскелет" (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, из них 3 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, который включает в себя 276 источников, в том числе 267 иностранных авторов. Работа содержит 7 таблиц, 18 рисунков.
