Введение к работе
Актуальность проблемы. Ишемия - состояние, при котором из-за спазма или тромбоза сосудов кровоснабжение части органа оказывается недостаточным для обеспечения метаболизма, является причиной таких патологий как инфаркт миокарда и инсульт головного мозга. Известно, что клетки млекопитающих способны адаптироваться к ишемическому состоянию. Предобработка клеток и органов коротким ишемическим стрессом, тепловым шоком или гипоксией [Currie et al., 1988; 1990; 1993; Меерсон и др., 1990; Donnelly 1992; Yellon 1992; Marber 1993] уменьшает их чувствительность к повреждающему действию последующей ишемии. Таким образом, существует реальная возможность, используя внутренние ресурсы клеток, сохранить их жизнеспособность в течение острого ишемического приступа. В связи с этим особую актуальность приобретает раскрытие эндогенных механизмов клеточной защиты, использование которых позволило бы разработать методы уменьшения структурных и функциональных повреждений клеток в период недостаточного кровоснабжения органа.
Эндотелий является избирательно проницаемым барьером между кровью и подлежащими тканями. Известно, что ишемия вызывает повышение проницаемости эндотелиального монослоя для макромолекул и клеток крови [Sunnergen and Rovetto, 1987; Svendsen et al., 1991], что, в свою очередь, приводит к отеку и тромбозу сосудов и усугубляет ишемическое повреждение органов. Тем не менее, исследований эндогенных механизмов защиты эндотелиальных клеток от ишемии проводится очень мало. Таким образом, выбор эндотелиальных клеток сосудов человека в качестве объекта исследования является актуальным.
Исследования последних лет, направленные на выявление эндогенных механизмов ослабления ишемического стресса показали участие стресс-белков или белков теплового шока (HSPs) в защите клеток от гибели при ишемии/реперфузии. Так гиперэкспрессия HSP70, HSP27, альфа В-кристаллина и совместная гиперэкспрессия HSP60 и HSP10 способны защитить клетки от ишемического повреждения [Marber et al., 1995; Plumier et al., 1995; Martin et al.,1997; Lau et al., 1996]. Известно также, что клетки, подвергшиеся тепловому шоку, после определенного периода восстановления оказываются менее чувствительными к повреждающему действию ишемии [Currie et al., 1988; 1990; 1993; Donnelly et al„ 1992; Yellon, 1992; Marber et al., 1993]. Период защиты тепловым прекондиционированием совпадает со временем накопления в клетках индуцибельной формы HSP70 (HSP70i), а также ряда других HSPs. Таким образом, феномен такой перекрестной толерантности, по крайней мере частично, может быть обусловлен индукцией HSP генов. Однако точный молекулярный механизм защиты клеток стресс-белками от ишемического повреждения остается не ясным.
Одним из существенных повреждений клеток ишемическим стрессом является разрушение актинового цитоскелета [Armstrong and Gannote, 1993]. В то же время, было показано, что стресс-белок HSP27 влияет как на полимеризацию актина, так и на его резистентность к различным стрессам, причем эти функции HSP27 определяются его уровнем экспрессии, степенью фосфорилирования и структурной организацией. Нефосфорилированные мономеры HSP27 способны кзпировать актиновые филаменты [Benndorf et al., 1994], а гиперэкспрессия мутантного неспособного фосфорилироваться HSP27 коррелирует с пониженным содержанием кортикального F-актина в трансфицированных клетках [Lavoie et al., 1993а; Piotrowicz et al., 1997]. С другой стороны, повышенная экспрессия фосфорилируемого HSP27 снижает чувствительность клеток к повреждающему действию теплового шока [Lavoie et al., 1993b; 1995J, окислителей [Huot et al., 1995; 1996] и цитохалазина D [Lavoie et al., 1993a; Guay et al., 1997]. Исходя из этого, а также принимая во внимание, что гиперэкспрессия HSP27 защищает трансфицированные кардиомиоциты от гибели при истощении АТФ [Martin et al., 1997], нам представлялось актуальным проверить способен ли HSP27 защищать актиновые филаменты от разрушения ишемическим стрессом, а также выяснить зависит ли осуществление этой функции HSP27 от степени его фосфорилирования. Решение этой задачи приблизит понимание эндогенных механизмов защиты клеток от повреждения при ишемии, а также позволит указать возможные пути искусственной адаптации тканей и органов к ишемическому состоянию.
Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы является исследование роли HSP27 в механизмах защиты ЭК от ишемического повреждения. 8 работе были поставлены следующие задачи:
1. Разработать экспериментальную in vitro модель ишемического повреждения ЭК
сосудов человека.
2. Показать, как реагирует HSP27 в ЭК на имитирующий ишемию метаболический стресс.
3. Установить связано ли изменение степени фосфорилирования, структурной
организации и локализации HSP27 с состоянием актинового цитоскелета в ЭК при
экспериментальной ишемии in vitro.
4. Исследовать, как влияет предварительное накопление HSP27 в ЭК на их устойчивость
к ишемическому повреждению.
Научная новизна и практическая значимость работы. Разработана экспериментальная модель ишемического повреждения ЭК сосудов человека in vitro.
Впервые показано влияние истощения АТФ на изоформный спектр, структурную организации и локализацию HSP27 в клетках.
Обнаружено существование раннего периода защиты ЭК тепловым шоком,
характеризующегося нормальной морфологией клеток и целостностью эндотелпального монослоя, а также сохранением пула F-актина при ишемическом стрессе, проведенном в первые три часа после теплового шока. Исследование возможного механизма защитного эффекта тепловой предобработки клеток выявило участие в нем тирозиновых киназ.
Для ЭК впервые показано, что тепловой шок с последующим периодом восстановления делает их толерантными к ишемическому стрессу. Показано, что феномен позднего периода защиты, по крайней мере, частично, обусловлен накоплением индуцибельных HSPs в клетках. Установлено, что для приобретения эндотелиальными клетками толерантности к ишемическому повреждению гиперэкспрессии одного только индуцибельного HSP70 не достаточно.
Обнаружено, что ингибиторы фосфатазы 2А, отвечающей за дефосфорилирование HSP27 in vivo, Na3V04, кантаридин и окадаиковая кислота защищают ЭК от ишемического стресса.
Показано существование положительной корреляции между разрушением актинового цитоскелета ЭК и дефосфорилированием/грануляцией HSP27. Эти данные позволяют предполагать, что сохранение содержания фосфорилированного HSP27 выше некоего порогового уровня защищает актиновые микрофиламенты от разрушения при истощении АТФ.
Результаты проведенных исследований могут быть в дальнейшем использованы в медицине, так как указывают две стратегии адаптации клеток к ишемическому состоянию: 1) путем ингибирования дефосфорилирования HSP27 ингибиторами протеинфосфатазы 2А непосредственно во время ишемического состояния (при инфарктах, инсультах, операциях по трансплантации), 2) путем повышения уровня HSPs тепловым прекондиционированием перед ишемическим стрессом (например, для повышения жизнеспособности пересаживаемых органов).
Апробация работы: Результаты работы были представлены на 5-ом Всемирном конгрессе по сердечной недостаточности (Вашингтон, май 1997), на XI Международном симпозиуме по атеросклерозу (Париж, октябрь 1997), на Кистоунском симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии (Lake Tahoe, Калифорния, март 1998), на симпозиуме "Сосудистая биология' 98" (Сан Франциско, апрель 1998) и конференции "Molecular chaperones and heat shock response" (Cold Spring Harbor, май 1993). Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 131
