Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема дефектов соединительной ткани склеры глаза является одной из самых актуальных в современной экспериментальной морфологии и офтальмологии. Прогрессирующая миопия, механические травмы, химические и термические ожоги, атрофические состояния склеры, связанные с использованием цитостатиков и нарушением кровоснабжения и иннервации фиброзной оболочки глаза, сопровождаются структурными, биохимическими и биомеханическими нарушениями, чреватыми ослаблением и потерей склерой своих функций. Эти нарушения проявляются как на клеточном (снижение синтетической и митотической активности), так и на тканевом (уменьшение общего числа клеток, изменение состава и соотношения компонент межклеточного вещества) уровне.
До сегодняшнего дня единственным эффективным методом лечения подобных состояний остаются склероукрепляющие операции, суть которых состоит в хирургическом укреплении склеры различными материалами. Подобный подход чреват интра- и послеоперационными осложнениями, кроме того, лишь косвенно влияет на причину истончения склеры, что приводит к необходимости повторных вмешательств, затрудненных рубцовой тканью, формирующейся после первой операции. Консервативные методы лечения и физиотерапевтический подход не обладают достаточной эффективностью, что делает поиск новых методов восстановления дефектов склеры актуальным и перспективным. Одним из таких малоизученных направлений является клеточная терапия, использующая в качестве активного компонента аутологичные или аллогенные живые клетки. Подобный подход отвечает предъявляемым к потенциальному методу лечения требованиям: он безопасен при использовании аутологичного материала, и способен усилить репаративную регенерацию. В зависимости от типа клеток и их предварительной стимуляции/селекции эффект от трансплантации может существенно отличаться, а результат реализовываться по одному или нескольким из следующих механизмов: антиапоптотическое действие, противорубцовое действие, ангиогенный и митотический эффекты.
На модели асептических разрезов сухожилия и связок уже изучен эффект трансплантации фибробластов дермы и сухожилий, мезенхимальных стволовых клеток при восстановлении дефектов плотной оформленной соединительной ткани. Положительные результаты этих исследований легли в основу нашей работы.
Цель исследования
Оценить морфологические изменения в склере кролика при репаративной регенерации и после трансплантации клеток.
Задачи исследования
1. In vitro выбрать потенциально эффективный тип клеток для трансплантации;
2. Сформировать биологическую модель объемных дефектов склеры;
3. Изучить закрытие дефекта склеры кролика на предлагаемой модели;
4. Изучить закрытие дефекта склеры кролика при трансплантации клеток;
5.Сопоставить восстановление дефектов склеры при репаративной регенерации и после трансплантации клеток.
Научная новизна
1.Впервые проведено сравнение фибробластов склеры и дермы кролика и человека в культуре in vitro.
2.Продемонстрировано положительное влияние активированных лейкоцитов периферической крови на ангиогенез и пролиферацию фибробластов дермы и склеры.
3.Разработан метод и проведена оценка адгезии лейкоцитов и фибробластов к склере за счет окраски флуоресцентными красителями.
4.Разработана новая биологическая модель объемных дефектов склеры с описанием репаративной регенерации.
5.Впервые проведено исследование трансплантации аутологичных фибробластов дермы и лейкоцитов кролика в область дефекта склеры с использованием объективных морфометрических методов.
Практическая значимость
Предложена биологическая модель объемных дефектов склеры, позволяющая объективно оценивать эффективность новых методов лечения дефектов склеры.
Предложенный метод клеточной терапии дефектов склеры – субконъюнктивальная трансплантация аутологичных активированных лейкоцитов, может быть рекомендован для дальнейших клинических испытаний.
Основные положения, выносимые на защиту
1.Активированные лейкоциты периферической крови усиливают ангиогенез на модели хорион-аллантоисной мембраны куриного эмбриона.
2.Супернатант активированных лейкоцитов периферической крови усиливает пролиферацию фибробластов склеры и дермы в культуре in vitro.
3.Операция склерэктомии глубиной 75 мкм в верхне-внутреннем квадранте глаза кролика приводит к формированию объемного дефекта склеры, и может служить биологической моделью для изучения репаративной регенерации плотной соединительной ткани.
4.Субконъюнктивальная трансплантация аутологичных активированных лейкоцитов периферической крови приводит к достоверному усилению регенерации объемных дефектов склеры.
Реализация результатов работы
Материалы диссертации (биологическая модель объемных дефектов склеры, клеточная терапия дефектов склеры) внедрены в научно-исследовательскую практику НИИ ГБ РАМН, кафедры морфологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ им Н.И. Пирогова, педагогическую практику кафедры морфологии.
Апробация результатов работы
Основные положения работы доложены на межкафедральной конференции ГОУ ВПО РГМУ им Н.И. Пирогова в г. Москва (сентябрь 2010), конференции молодых исследователей НИИ ГБ РАМН в г. Москва (апрель 2007), 14 международном студенческом медицинском конгрессе в г. Гронинген, Нидерланды (июнь 2007), 2 международной медицинской студенческой конференции в г.Нови Сад, Сербия (июль 2007), Всероссийской конференции «Современные методы диагностики лечения заболеваний роговицы и склеры» в г. Москва (сентябрь 2007), Всероссийском Иммунологическом Конгрессе в г. Санкт-Петербург (июль 2008), Всероссийской конференции «Глаукома: реальность и перспективы» (Москва, сентябрь 2008), Международном конгрессе медицинских студентов в г.Берлин, Германия (октябрь 2008), VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России в г.Саратов (октябрь 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и 3 – в иностранных журналах, в том числе в журналах, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки Российской Федерации – 6 публикаций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материал и методы исследования, главы собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций; библиография включает в себя 343 работы: 76 источников отечественной и 267 – иностранной литературы. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 33 рисунками.
