Введение к работе
Актуальность исследования
Травма спинного мозга остаётся одной из актуальных медико-социальных проблем. Эффективных методов её лечения не существует, что является причиной глубокой инвалидизации пострадавших. Возможность преодоления последствий травмы спинного мозга связывают с применением нейротрофических факторов (НТФ), которые поддерживают жизнеспособность нейронов и регенерацию аксонов в спинном мозге (Jones et al., 2001; Lu, Tuszynski, 2008; Hollis, Tuszynski, 2011). Однако в ходе клинических испытаний с системной их доставкой были выявлены неприемлемые побочные реакции и низкая эффективность (Apfel et al., 2002). При непосредственном введении НТФ в область повреждения действие оказалось нестойким вследствие быстрого расщепления протеазами. Эти трудности стимулировали поиск других способов повышения содержания НТФ в повреждённой ткани. Среди них наиболее эффективной оказалась доставка генов НТФ.
Для доставки в область травмы спинного мозга терапевтических генов начато применение вирусных и невирусных векторов (De Laporte et al., 2011; Bo et al., 2011; Hutson et al., 2012). Невирусные векторы, в частности плазмиды, несмотря на низкую трансфекционную активность, считаются более безопасными. Одновременная доставка в повреждённую ткань нескольких генов НТФ кажется наиболее эффективной, а дальнейшее её изучение представляется актуальным. При проведении генной терапии с целью стимулирования нейрорегенерации особенно перспективна одновременная доставка генов НТФ и ангиогенных факторов. Примером может служить комбинация генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) (Islamov et al., 2004; Sabti, 2007), применение которой при травме спинного мозга не исследовано.
Клеточная терапия рассматривается как один из перспективных способов преодоления последствий при травме спинного мозга. С этой целью исследуют эмбриональные и нейральные стволовые клетки, глиальные клетки обонятельных структур, клетки крови пуповины, микроглия-подобные клетки, шванновские клетки и многие другие (Eftekharpour et al., 2008; Xu, Onifer, 2009; Ronaghi et al., 2010). Трансплантируемые клетки поддерживают восстановление матрикса ткани для регенерации нервных волокон, оказывают трофическое влияние на нейроны и глию, обеспечивают рост аксонов и участвуют в их ремиелинизации. Наиболее перспективными представляются клетки крови пуповины, оценке результатов экспериментальной трансплантации которых при травме спинного мозга посвящено достаточное количество работ (Hernandez et al., 2011; Park et al., 2011; Sun, Ma, 2012). Трансплантация клеток крови пуповины человека при травме спинного мозга угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует неоваскуляризацию (Chen et al., 2008) и снижает экспрессию проапоптозных генов (Dasari et al., 2009). Трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП), как известного источника стволовых и прогениторных клеток, активно исследуют для преодоления последствий травмы и ишемии мозга, а также для лечения нейродегенеративных заболеваний (Kuh et al., 2005; Rizvanov et al., 2008; Rodrigues et al., 2012).
Несмотря на актуальность дальнейших исследований по трансплантации клеток при травме спинного мозга, стало очевидным, что только клеточная терапия в чистом виде приводит лишь к умеренному улучшению структурных показателей и недостаточному восстановлению функции. Именно поэтому для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга внимание исследователей привлекли генетически модифицированные клетки с усиленной экспрессией терапевтических генов НТФ.
При травме спинного мозга для анализа результативности нейрорегенерации в условиях генно-клеточной терапии, наряду с применением общепринятых критериев, таких как степень восстановления функциональных параметров, сохранность ткани, выраженность патологической кавитации, количество регенерирующих миелиновых волокон, представляется важным оценить состояние клеток конкретных популяций. Среди них астроциты как наиболее многочисленные глиальные клетки, которые обеспечивают поддержание гомеостаза в мозге и нарушение функции которых немедленно приводит к развитию нейродегенерации (Rossi, Volterra, 2009; Matyash, Kettenmann, 2010; Allaman et al., 2011).
Другим клеточным типом, на который в нашей работе было обращено особое внимание, явились шванновские клетки. Эти клетки в нормальных условиях не мигрируют в мозг из периферических нервных структур. Но они появляются в ЦНС в очагах демиелинизации и в области травматического повреждения и могут участвовать в миелинизации аксонов в ЦНС (Jasmin et al., 2000; Totoiu, Keirstead, 2005; Oudega, Xu, 2006). Несмотря на пристальный интерес к проблеме миграции шванновских клеток в область повреждения мозга и проведённые исследования в этом направлении, многие вопросы поведения этих клеток требуют изучения. Не определены динамика численности популяции шванновских клеток-мигрантов в области травматического повреждения и количество жизнеспособных клеток, способных участвовать в ремиелинизации центральных аксонов. Применительно к задачам генно-клеточной терапии представляется актуальным оценить возможность поддержания в области травмы спинного мозга популяции шванновских клеток-мигрантов и влияния на их фенотипические характеристики.
Поскольку наша работа предполагает доставку плазмидного вектора с комбинацией генов, продукты которых стимулируют неоваскуляризацию, в качестве объекта исследования выбраны перициты, экспрессирующие -рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR). Определение их количества позволит оценить значение одновременной доставки в область травматического повреждения терапевтических генов VEGF и FGF2 для реваскуляризации как фактора поддержания посттравматической нейрорегенерации.
Цель исследования – оценить эффективность мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, для преодоления последствий контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях их однократной трансплантации в область повреждения.
Для достижения цели поставлены следующие задачи, решаемые на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы в условиях локальной доставки в область повреждения терапевтических генов на клеточных носителях:
1. Изучить сроки выживания и миграционный потенциал трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека.
2. Исследовать динамику восстановления двигательной функции в поведенческом тесте ВВВ.
3. Оценить суммарную площадь патологических полостей, площади сохранённого серого и белого вещества на поперечных срезах спинного мозга и количество миелиновых волокон в фиксированных наружных зонах белого вещества.
4. Определить количество клеток, экспрессирующих белок S100В, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.
5. Установить количество периваскулярных клеток, экспрессирующих PDGFR, в наружных зонах белого вещества в области повреждения.
6. Оценить количество и фенотип шванновских клеток, мигрировавших в область повреждения.
Научная новизна
Впервые показано стимулирующее влияние на процессы нейрорегенерации доставки в область травмы спинного мозга комбинации генов VEGF и FGF2 при помощи трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 МККП человека, что проявляется в уменьшении площади деструкции серого и белого вещества, патологической кавитации, увеличения количества миелиновых волокон и улучшения восстановления двигательной функции. Получены новые данные по срокам выживания и миграционному потенциалу трансплантированных в спинной мозг крысы МККП человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2. Впервые при контузионной травме спинного мозга и трансплантации трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 МККП в белом веществе области повреждения показано увеличение количества S100В+- и PDGFR+-клеток. Приоритетными являются данные о том, что трансплантация МККП в область травмы спинного мозга оказывает поддерживающее влияние на популяцию мигрирующих в мозг шванновских клеток, а в сочетании с доставкой терапевтических генов VEGF и FGF2 этот эффект усиливается. Впервые обнаружена экспрессия белка теплового шока 25 (HSP25) в шванновских клетках, мигрирующих в белое вещество спинного мозга в пределах области повреждения и экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и транскрипционный фактор Krox20.
Научно-практическая значимость работы
Полученные результаты о стимулирующем влиянии на процессы нейрорегенерации МККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, в условиях их доставки в область травмы спинного мозга обосновывают выбор этого способа генно-клеточной терапии для последующего углублённого исследования на доклиническом этапе, что позволит приступить к клиническим испытаниям. Полученные данные подтверждают актуальность и перспективность работ по усовершенствованию и последующему применению разработанной технологической платформы создания генетических конструкций в качестве инструмента для формирования на основе этой же платформы других, возможно более эффективных средств для лечения и реабилитации больных с нейротравмой и тяжёлыми неврологическими заболеваниями.
Положения, выносимые на защиту:
1. Трансплантация в область контузионной травмы спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, стимулирует нейрорегенерацию.
2. Доставка терапевтических генов VEGF и FGF2 в область травматического повреждения спинного мозга при помощи мононуклеарных клеток крови пуповины человека поддерживает в нём популяцию шванновских клеток-мигрантов.
Апробация материалов диссертации
Основные положения и результаты работы доложены на: IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011); V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Уфа, 2012); XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.
Связь работы с базовыми научными программами
Работа поддерживалась грантами: РФФИ №07-04-00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксимедона» (2007–2009 гг.), ОПТЭК «Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейротрофических факторов» (2012 г.), РФФИ №12-04-31092-мол_а «Сравнение эффективности клеточно-опосредованной и прямой доставки генов нейротрофических факторов на посттравматическую регенерацию спинного мозга» (2012–2013 гг.).
Структура и объем диссертации
