Введение к работе
Актуальность темы. Клеточная терапия – метод лечения заболеваний с помощью стволовых клеток – активно развивается в последние 10 лет. Трансплантация стволовых прогениторных клеток как одно из направлений клеточной терапии является одним из перспективных, так как позволяет стимулировать репаративные процессы поврежденной ткани (Anversa P. et al., 2004; Gersh B.J., Simari D.R., 2006).
На сегодняшний день существует несколько способов лечения таких распространенных заболеваний, сопровождающихся сердечной недостаточностью, как ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда. Среди них выделяют хирургическое и медикаментозное лечение (Болл С. Дж. и др., 1995., Куртова А.В. и др., 2006), и трансплантацию прогениторных клеток костного мозга (Шахов В.П., Попов С.В., 2004; Li J. et al., 2010). Современная медикаментозная терапия и хирургическое лечение часто оказываются недостаточно эффективными, поэтому для лечения сердечно-сосудистых заболеваний все большее внимание уделяют клеточной трансплантации (Yacoub М. et al., 2006).
За последнее десятилетие было накоплено большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих об эффективности и безопасности клеточных трансплантаций (Zhang C. et al., 2010). Было показано, что трансплантированные клетки могут выживать и участвовать в регенерации и реваскуляризации миокарда (Pangonyte D. et al., 2008). Однако до сих пор нет достоверных данных о том, что трансплантация клеток позволяет не просто восстановить функцию поврежденного миокарда, но в значительной мере устранить и само повреждение (Prockop D.J., 1997). Также остается неясным, какой именно клеточный трансплантат является наиболее безопасным и эффективным. Многие исследователи считают, что нефракционированные мононуклеары являются наиболее приемлемым клеточным трансплантатом (Zhang S. et al., 2010) по ряду причин. Во-первых, мононуклеары получают из красного костного мозга, который является наиболее доступным источником получения прогениторных клеток. Во-вторых, трансплантат мононуклеаров не требует культивирования и индукции дифференцировки, фенотипирования и отбора нужной фракции. Кроме того, в состав фракции мононуклеаров входят мультипотентные стромальные клетки, гемопоэтические стволовые клетки, эритроидные клетки - предшественники, мегакариоцитарные клетки – предшественники и клетки-предшественники миелоидного ряда, что позволяет воспроизвести и оценить комплексное влияние клеток красного костного мозга на репарацию тканей (Iwase T. et al., 2005).
Существуют три способа трансплантации прогениторных клеток: интравенозный, интракоронарный и интрамиокардиальный. Интрамиокардиальная трансплантация наиболее инвазивна, но наиболее эффективна, так как клеточный трансплантат вводят непосредственно в область повреждения (Henning R.J., et al., 2007). Интравенозная и интракоронарная трансплантации менее инвазивны и травматичны, но менее эффективны, так как прогениторные клетки мигрируют в зону повреждения под действием хемоаттрактантов (Grgaard H.K., et al., 2007). Именно поэтому на данный момент все еще стоит вопрос о выборе оптимальной техники введения клеток.
Среди возможных механизмов действия трансплантированных клеток на регенерацию миокарда выделяют заместительный (Orli D. et al., 2001; Bell A. et al., 2010), индукционный (Sieveking P.D. et al., 2009; Wollert K.C. et al., 2010; Yoon C.H. et al., 2010) и механизм клеточного слияния (Balsam L.B. et al., 2001; Tada M. et al., 2003). Заместительный эффект реализуется благодаря высокому пролиферативному потенциалу стволовых/прогениторных клеток и возможности слияния и/или дифференцировки их в кардиомиоциты (Johnston P.V., et al., 2009). Индукция регенерации происходит за счет синтеза и выделения трансплантированными клетками различных сигнальных молекул, которые регулируют пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток в зоне повреждения (Burchfield J.S., Dimmeler S., 2008). Слияние прогениторных клеток с кардиомиоцитами предполагает восстановление пролиферативной активности последних, что и приводит к восстановлению поврежденной ткани (Matsuura K., et al., 2004). Тем не менее, точный механизм действия трансплантированных стволовых клеток не установлен, и его определение является одной из основных задач исследователей.
Таким образом, на данный момент остаются неизвестными механизм действия трансплантированных клеток, наиболее эффективный клеточный фенотип для трансплантации и способ доставки клеток в зону повреждения.
Однако, несмотря на недостаток данных и ряд спорных вопросов, то, что трансплантация мононуклеаров приводит к положительным результатам, свидетельствует о перспективности данного клеточного трансплантата и возможности его использования в клинической практике. Для этого необходима разработка эффективной методики трансплантации и точное знание механизмов действия трансплантированных мононуклеаров, обеспечивающих их терапевтический эффект.
Цель и задачи исследования. Изучить в эксперименте особенности репаративных процессов в инфарктной зоне миокарда после трансплантации аутологичных мононуклеаров красного костного мозга.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать метод интракоронарной трансплантации мононуклеаров костного мозга мелким лабораторным животным.
-
Исследовать топографию трансплантированных мононуклеаров в сердце и других органах через 14 и 30 сут после трансплантации с помощью витальной мембранной метки PkH26.
-
Определить фенотип клеток миокарда, образующихся из трансплантированных мононуклеаров через 14 и 30 суток после трансплантации с помощью морфологического анализа с применением иммуногистохимии.
-
Провести морфометрическое исследование особенностей васкуляризации постинфарктного рубца после трансплантации мононуклеаров.
-
Изучить влияние трансплантации мононуклеаров на постинфарктное ремоделирование левого желудочка с помощью морфометрического анализа серийных поперечных срезов сердца.
-
Оценить глобальную сократимость левого желудочка сердца после трансплантации мононуклеаров по показателям максимального давления и скорости повышения давления в левом желудочке.
-
Оценить уровень экспрессии генов ангиогенеза, ростовых факторов, цитокинов и хемоаттрактантов во фракции мононуклеаров красного костного мозга методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Научная новизна. Разработана модель интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации мононуклеаров мелким лабораторным животным. Особенность разработанной модели состоит в том, что при пережатии аорты большая часть трансплантированных клеток попадает из полости левого желудочка в коронарные артерии при сердечном выбросе. По эффективности доставки клеток в зону повреждения разработанный метод сравним с интрамиокардиальным (50,04% клеток через 14 сут в зоне повреждения после трансплантации, 40,07% клеток через 30 сут), но является менее инвазивным. Интракоронарная трансплантация мононуклеаров безопасна: она не вызывает развития воспалительной реакции.
Исследована локализация и выживаемость мононуклеарных клеток после трансплантации в условиях экспериментального инфаркта миокарда. Трансплантированные аутологичные мононуклеары выживали в течение месяца без изменения локализации. Большая часть клеток локализовалась в сердце и селезенке, единичные клетки были обнаружены в печени и легких.
В сердце клетки располагались только в рубцовой зоне, были окружены пучками коллагеновых волокон и имели фибробластоподобный фенотип через 14 и 30 сут после трансплантации. Часть трансплантированных клеток, помимо флуоресцентной метки трансплантированных мононуклеаров PkH26, экспрессировала маркеры фибробластов Fap и миофибробластов -SMA, что доказывает их дифференцировку в фибробласты и миофибробласты как через 14, так и через 30 сут после трансплантации.
Мононуклеары не дифференцируются в клетки стенок кровеносных сосудов. Трансплантация мононуклеаров приводит к стабилизации процессов васкуляризации, поддерживая количество и объемную плотность сосудов на постоянном уровне, по сравнению с контрольной группой, где было выявлено уменьшение как количества, так и объемной плотности сосудов через 30 сут после трансплантации.
Показана стимуляция пролиферации клеток стромы после трансплантации. Через 14 и 30 сут после трансплантации в рубце опытной группы количество делящихся клеток значительно выше (р0,001), чем в контрольной. При сопоставлении метки было выявлено, что некоторые меченые PkH26 клетки окрашивались мАТ к Ki67, что свидетельствует о пролиферации самих трансплантированных мононуклеаров на протяжении всего срока исследования.
Изучена экспрессия 84 генов во фракции мононуклеаров. Установлена сверхэкспрессия факторов ангиогенеза, факторов роста и дифференцировки, цитокинов и хемоаттрактантов.
Трансплантация мононуклеаров ускоряла процесс созревания коллагена, что повышало механическую прочность стенки левого желудочка в области рубца и препятствовало ее разрыву. Однако дифференцировка мононуклеаров в фибробласты и миофибробласты, синтезирующие коллаген, приводила к разрастанию рубцовой ткани. Трансплантация мононуклеаров не влияла на индекс гипертрофии левого желудочка.
Показано улучшение глобальной сократимости сердца после трансплантации мононуклеаров. Трансплантация мононуклеаров приводила к повышению максимального давления в стенке левого желудочка и увеличению скорости повышения максимального давления в левом желудочке.
Практическая значимость. Разработанная модель интракоронарной клеточной трансплантации мелким лабораторным животным после экспериментального инфаркта миокарда по эффективности сравнима с интрамиокардиальной, но менее инвазивна.
Полученные экспериментальные данные о безопасности и эффективности трансплантации мононуклеаров послужат основой для усовершенствования методики предклинических испытаний.
Полученные данные следует учитывать не только при проведении исследований по клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний, но и в области клеточной ангиопластики и лечения ишемических заболеваний.
Степень личного вклада автора в результаты исследования. Автор принимал участие в хирургических операциях по моделированию инфаркта миокарда, взятии красного костного мозга и интракоронарной трансплантации. Все хирургические манипуляции проводили в Лаборатории биологических испытаний Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в г. Пущино в соответствии с GLP-условиями.
Автор принимал участие в приготовлении клеточного трансплантата и витальном маркировании мононуклеаров. Автором было самостоятельно проведено гистологическое, иммуногистохимическое, морфометрическое исследование, полимеразная цепная реакция в реальном времени. Автор проводил статистический анализ полученных данных.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на:
Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг» (Москва, 2009, 2010, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН); Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (25 - 28 октября 2010 года, Москва, факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова); Научной конференции «Актуальные опросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2010, УРАМН НИИ морфологии человека РАМН); Всероссийской конференции «Фундаментальные и клинические аспекты изучения ангиогенеза. Подходы регенеративной медицины» (Москва, 2011, Московский физико-технический институт); Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011, УРАМН НИИ морфологии человека РАМН); межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН (2011).
Внедрение полученных результатов. На основании полученных данных разрабатываются протоколы клеточных трансплантаций для клинических исследований и протоколы клеточной терапии для лечения пациентов с диагностированной хронической сердечной недостаточностью. Проведенное исследование может служить доклиническим исследованием оценки безопасности и эффективности трансплантации мононуклеаров красного костного мозга.
Результаты диссертационного исследования используются в лекционных и практических занятиях на кафедре гистологии и эмбриологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научные статьи в журналах, представленных в списках ВАК. Получен 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 212 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Литературный указатель включает 227 источников, из них 200 – иностранных, 27 – отечественных. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 5 таблицами.
