Введение к работе
Актуальность темы. Гиперхолестеринемия является распространенной причиной сердечно-сосудистых патологий в человеческой популяции (Климов А.Н., 1977; Сох R.A., Garcia-Palmieri M.R., 1990; Mann D.L., 2002; Cole J.E. et al., 2010). Изучение проблемы гиперхолестеринемии и атеросклеротического процесса имеет длительную историю (Ignatowski А.С., 1908;AnitschkowN.,ChalatowS.51913; DuguidJ.B., 1946;Zilversmit B.A., 1973; Kunitomo M. et al., 1986), однако по-прежнему остается актуальным. Гиперхолестеринемия приводит к структурно-функциональным перестройкам в сердце и развитию сердечной недостаточности (Семенова Л.А. и др., 1985; Непомнящих Л.М., 1991). Морфогенез и механизмы холестеринового повреждения миокарда, в отличие от повреждений сосудов (Лысова Н.Л. и др., 2007; Соловьева Н.А. и др., 2008; Рагино Ю.И. и др., 2008, 2011; Соловьева Н.А., Лысенко А.И., 2010; Shah Р.К., 2002, 2003), мало изучены. Понимание процессов формирования компенсаторно-приспособительного ответа на тканевом и клеточном уровнях помогает выяснению закономерностей развития общих патологических процессов и позволяет решать частные задачи восстановления функции поврежденного миокарда.
Анализ литературы дает представление о комплексной природе холестериновых повреждений сосудов и сердца, затрагивающих различные функциональные системы организма, в том числе и иммунную систему (Климов А.Н. и др., 2003; Нагорнев В.А. и др., 2007; Cole J.E. et al., 2010; Santos M.J., Fonseca J.E., 2010; Luczak M. et al., 2011), что создает дополнительные сложности при исследовании данной патологии. Особенности липидного обмена у крыс (Cullen P. et al., 2003; Xiangdong L. et al., 2011) позволяют изучать токсическое воздействие избыточного содержания холестерина в крови на миокард в отсутствие ишемии и вызванных ею метаболических нарушений в кардиомиоцитах.
В выяснении причин сократительной недостаточности сердца большую роль играют методы молекулярной биологии и морфологии. Повышенный уровень холестерина в крови влияет на Са2+-сигналинг в кардиомиоцитах через изменение экспрессии белков, вовлеченных в транспорт кальция (Alvarez Е. et al., 2010; Luo T.Y. et al., 2004), а также изменяя функциональность ионных каналов, модулируя мембранный потенциал и активность ионных обменников (Luo T.Y. et al., 2004; D'Aranzo N. et al., 2011; Deng W. et al., 2012). Нарушение Са2+-сигналинга меняет электрофизиологические характеристики кардиомиоцитов — потенциал действия, плато потенциала действия, появляются осцилляции в работе Na+- и К+-ионных каналов (Noble D., Noble P.J., 2006; Ceylan-Isik A.F. et al., 2011; Liang S. et al., 2012; Rozanski G.J., 2012), что обусловливает формирование аритмогенной активности и снижение сократительной функции сердца.
В свою очередь, изменения сократительной функции кардиомио-цитов в результате модификации кальциевого обмена обусловливают развитие комплекса структурных перестроек мышечных клеток сердца, отражающих их функционирование в измененных условиях регуляции сократительной активности. Анализ морфофункциональных изменений миокарда при развитии гиперхолестеринемии должен включать не только характеристику структурной реорганизации кардиомиоцитов, выяснение типов их повреждения и форм гибели, но также и возможные изменения их пролиферативной активности и потенциал развития компенсаторно-приспособительных реакций. В конечном итоге интенсивность процессов гибели и регенераторной (в том числе, и пролиферативной) активности кардиомиоцитов в условиях гиперхолестеринемии определяет особенности ремоделирования миокарда, оценка которых имеет непосредственное отношение к прогнозу состояния, обратимости структурных перестроек и выбору способов коррекции атерогенных повреждений миокарда.
Одним из основных подходов к коррекции атеросклеротических повреждений органов и тканей в настоящее время является применение препаратов и биоактивных соединений (статинов, фибратов, секвестран-тов желчных кислот, юЗ-жирных кислот и т.п.), снижающих уровень холестерина в крови. Применение препаратов и химических соединений, модулирующих активность ионных каналов, потенциал действия сарколеммы и сопряжение процесса сокращения — расслабления, определяется симптомами нарушений сердечной деятельности и связано, как правило, с лечением осложнений атеросклеротического процесса, когда структурная реорганизация миокарда может носить необратимый характер.
Верапамил - блокатор кальциевых каналов, широко используемый при лечении гипертонии, коронарной болезни сердца и аритмии (Кулешова Э.В., 1999; Frommeyer G. et al., 2012; Milberg P. et al., 2012). В последнее время появляются данные и о целесообразности использования верапами-ла для коррекции атерогенных повреждений сердца (Versari D. et al., 2009; Salabei J.K. et al., 2012). Однако эти данные основаны преимущественно на статистическом анализе клинических данных, в то время как механизмы действия верапамила изучены недостаточно, что сужает область его применения и не позволяет предупредить нежелательные побочные эффекты. Использование верапамила в экспериментальной модели позволит изучить вклад внутриклеточных токов Са2+ в повреждение кардиомиоцитов при экспериментальной гиперхолестеринемии.
Цель исследования — изучить характер структурной реорганизации миокарда и изменений экспрессии мРНК белков, регулирующих внутриклеточный транспорт Са2+ в кардиомиоцитах, при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить характер структурной реорганизации миокарда крыс при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.
-
Изучить динамику изменений общей численности кардиомиоцитов в сердце и субпопуляций кардиомиоцитов при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.
-
С помощью иммуногистохимических методов изучить пролифе-ративную активность кардиомиоцитов при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.
-
Изучить характер изменений экспрессии мРНК белков, регулирующих внутриклеточный транспорт Са2+ в кардиомиоцитах, при моделировании хронической гиперхолестеринемии и введении верапамила.
Научная новизна. Впервые с помощью комплексного морфологического, биохимического и молекулярно-биологического анализа проведено изучение характера структурной реорганизации миокарда, пролиферативной активности кардиомиоцитов, изменений их общей численности в сердце крыс, а также изменений экспрессии мРНК RyR2 и SERCA2a в миокарде при моделировании хронической гиперхолестеринемии (в течение 64 сут) и введении верапамила. Показано, что морфологические изменения миокарда при содержании крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом носят сходный характер (преобладание кардиомиоцитов с литическими изменениями, выраженное полнокровие вен и капилляров, интерстициальный отек, диффузный фиброз, гипертрофия и гиперплазия гладкомышечных клеток в интрамуральных артериях) и усиливаются по мере увеличения сроков цитопатического воздействия.
Впервые установлено, что введение верапамила способствует уменьшению выраженности литических изменений кардиомиоцитов и фибропластических реакций стромы с сохранением более выраженного диффузного фиброзирования стромы у крыс, получавших с кормом экзогенный холестерин.
Впервые показано, что морфофункциональные изменения миокарда при развитии гиперхолестеринемии и гипертриглицеридемии сопровождаются усилением пролиферативной активности кардиомиоцитов (индекс мечения ядер кардиомиоцитов Ki-67 повышен в 14 - 17 раз по сравнению с контролем через 30 сут эксперимента). Впервые установлено, что введение верапамила способствует более выраженному повышению пролиферативной активности кардиомиоцитов.
Впервые установлено, что содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином первоначально приводит к уменьшению (на 17%) доли одноядерных и увеличению (на 35%) доли многоядерных кардиомиоцитов с инверсией этих показателей в более поздние сроки. Введение верапамила приводит к нормализации доли многоядерных клеток за счет уменьшения доли двуядерных кардиомиоцитов. Содержание крыс на атерогенной диете с мерказолилом не меняет соотношение субпопуляций кардиомиоцитов, при этом общая численность кардиомиоцитов через 64 сут уменьшается на 10%. Введение верапамила приводит к увеличению
доли многоядерных кардиомиоцитов при сохранении уменьшенной общей численности кардиомиоцитов.
Впервые показано, что при содержании крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом в миокарде значительно уменьшается количество MPHKRyR2 (в среднем на 70%) имРНК SERCA2a (в среднем на 80%). Введение верапамила способствует нормализации количества мРНК RyR2 и SERCA2a только при атерогенной диете с экзогенным холестерином.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные о характере структурной реорганизации миокарда, молекулярных механизмах нарушения сократительной функции кардиомиоцитов и их регенераторных стратегиях при развитии гиперхолестеринемии и введении верапамила, которые расширяют существующие представления о вариантах ремоделирования и репаративной регенерации миокарда.
Установленное влияние верапамила на пролиферативную активность кардиомиоцитов, изменения общей численности клеток, соотношений одно- и многоядерных кардиомиоцитов, снижение выраженности литиче-ских повреждений клеток (цитопротекторный эффект), нормализация под его влиянием количества мРНК RyR2 и SERCA2a в миокарде открывают новые перспективы использования данного препарата для оптимизации репаративных процессов миокарда при атерогенных кардиомиопатиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Атерогенная диета с введением экзогенного холестерина или мер-казолила обусловливает развитие гиперхолестеринемии и гипертриглице-ридемии у крыс, которые сопровождаются структурной реорганизацией миокарда, повышением пролиферативной активности кардиомиоцитов, изменениями общей численности кардиомиоцитов в сердце и пулов одно-, дву- и многоядерных клеток.
-
Введение верапамила существенно не влияет на уровень холестерина, но сопровождается достоверным увеличением уровня триглицеридов в сыворотке крови. Введение верапамила способствует уменьшению выраженности литических изменений кардиомиоцитов без выраженных изменений фибропластических реакций стромы, усилению пролиферативной активности кардиомиоцитов и увеличению доли многоядерных клеток.
-
Содержание крыс на атерогенной диете с экзогенным холестерином или с мерказолилом приводит к уменьшению в миокарде крыс Вистар количества мРНК RyR2 и SERCA2a. Введение верапамила приводит к исчезновению статистических различий по количеству мРНК RyR2 и SERCA2a только при содержании на атерогенной диете с экзогенным холестерином.
Апробация работы. Результаты исследования представлены на 1-й Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012),
IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012), Научно-образовательном форуме «Кардиология 2012» (Москва, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии» (Томск, 2013), 6-й Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013), межлабораторной научной конференции в ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН (Новосибирск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 - в журналах по списку ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста, иллюстрирована микрофотографиями и графиками, содержит 13 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Список литературы включает 257 источников.
