Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода в физиологических условиях
1.1.1. Общие сведения 11
1.1.2. Эмбриональное развитие пищевода 11
1.1.3. Структурная организация и гистофизиология различных слоев слизистой оболочки пищевода 14
Покровный эпителий 14
Собственная пластинка 28
Мышечная пластинка 30
Подслизистая основа 31
1.2. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при действии повреждающих факторов 33
1.2.1. Структурно-функциональные изменения при воздействии соляной кислоты 34
1.2.2. Структурно-функциональные изменения при воздействии алкоголя 37
1.2.3. Структурно-функциональные изменения при воздействии высокой температуры 38
1.2.4. Структурно-функциональные изменения при воздействии микроорганизмов 39
1.2.5. Структурно-функциональные изменения при воздействии ионизирующей радиации и лазерного облучения 41
1.3. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при действии цитостатиков 42
Заключение обзора литературы и
постановка цели и задач исследования 45
ГЛАВА 2. Материал и методика 46
2.1. Организация эксперимента и получение материала . 46
2.2. Общегистологические исследования 47
2.3. Морфометрические исследования 48
2.4. Гистохимические и цитофотометрические исследования 49
2.5. Иммуногистохимические исследования 51
2.6. Статистическая обработка полученных данных 52
Глава 3. Результаты исследования 53
3.1. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода
В контрольных группах животных 53
3.2. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при введении высоких доз циклофосфана и после его отмены 56
3.2.1. Результаты визуального гистологического исследования 56
3.2.2. Результаты морфометрического исследования 73
3.2.3. Результаты гистохимического и цитофотометрического исследования 90
3.2.4. Результаты иммуногистохимического исследования 104
3.3. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при длительном введении умеренных доз циклофосфана 106
3.3.1. Результаты визуального
гистологического исследования 106
3.3.2. Результаты морфометрического исследования 117
3.3.3. Результаты гистохимического и цитофотометрического исследования 133
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных данных 142
4.1. Методические подходы к оценке влияния циклофосфана на морфофункциональное состояние слизистой оболочки пищевода 142
4.2. Структурно-функциональная характеристика слизистой оболочки пищевода у животных контрольных групп 146
4.3. Структурно-функциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при кратковременном введении высоких доз циклофосфана 149
4.4. Структурно-функциональная характеристика слизистой оболочки пищевода после отмены циклофосфана 159
4.5. Структурно-функциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при длительном введении умеренных доз циклофосфана 168
Заключение 174
Выводы 176
Практические рекомендации 178
Литература
- Структурная организация и гистофизиология различных слоев слизистой оболочки пищевода
- Морфометрические исследования
- Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при введении высоких доз циклофосфана и после его отмены
- Структурно-функциональная характеристика слизистой оболочки пищевода у животных контрольных групп
Введение к работе
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Цитостатическая терапия, широко применяемая для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии [48, 128, 141], сопряжена с развитием осложнений, связанных с повреждающим действием цитостатиков на различные ткани и органы, в частности, на слизистые оболочки [25, 26, 99, 112, 125, 198, 288, 294]. Из органов пищеварительного тракта наибольшее внимание в литературе уделено изменениям, вызванным цитостатиками в слизистой оболочке тонкой кишки [129, 174, 252, 291, 327], а также ротовой полости [103, 162, 271, 297]. Между тем, клинические наблюдения свидетельствуют о закономерном возникновении у больных, получавших цитостатическую терапию, ряда заболеваний пищевода: описано частое развитие эзофагитов, как микробных, так и неинфекционных, в отдельных случаях отмечена метаплазия эпителия пищевода [85, 96, 132, 236, 245, 263, 295]. Тканевые и клеточные механизмы этих осложнений остаются мало изученными, а проведенные морфологические исследования влияния цитостатической терапии на состояние слизистой оболочки пищевода единичны и фрагментарны и имеют, главным образом, диагностическую направленность [85, 86, 92, 301, 318, 323]. Как правило, в этих исследованиях не учитываются взаимодействия различных тканей в ответной реакции на введение цитостатических препаратов. Данные о степени обратимости наблюдаемых изменений после отмены цитостатиков отсутствуют.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Комплексное экспериментальное изучение влияния цитостатика на морфофункциональные характеристики слизистой оболочки пищевода, а также оценка обратимости вызываемых цитостатиком изменений.
7 ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Морфофункциональная оценка состояния эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки пищевода при кратковременном введении высоких доз цитостатика алкилирующего ряда циклофосфана (ЦФ) с использованием гистологических, морфометрических, гистохимических и иммуно-гистохимических методов;
Морфофункциональная оценка состояния эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки пищевода в различные сроки после отмены цитостатика, кратковременно вводимого в высоких дозах.
Морфофункциональная оценка состояния эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки пищевода при длительном введении умеренных доз цитостатика.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Впервые проведено комплексное гистологическое, морфометрическое, гистохимическое и иммуногисто-химическое экспериментальное исследование состояния слизистой оболочки пищевода при введении цитостатика алкилирующего ряда ЦФ. Получены новые данные о тканевых и клеточных механизмах воздействия цитостатика, вводимого в различных дозах и с разной длительностью. Впервые установлено, что при длительном введении умеренных доз ЦФ изменения морфо-функциональных показателей слизистой оболочки пищевода выражены значительно слабее, чем при кратковременном введении высоких доз, что обусловлено проявлением реакций компенсаторно-приспособительного характера. Получены новые сведения о том, что наиболее значительные нарушения морфофункциональной организации слизистой оболочки пищевода при длительном введении умеренных доз ЦФ проявляются, в основном, в ранние сроки эксперимента.
Впервые прослежена динамика нарушения цитоархитектоники эпителиального пласта, изменений пролиферативной и метаболической активности эпителиоцитов, выявлено ранее не описанное резкое снижение количества клеток Лангерганса при введении цитостатика. Получены новые дан-
8 ные о динамике относительного объёма сосудов и содержания клеток различных гистогенетических линий в собственной пластинке и подслизистой основе пищевода, а также об изменении популяции тучных клеток в собственной пластинке и подслизистой основе пищевода с учётом особенностей их топографии и функциональной активности.
Впервые прослежена динамика нормализации различных показателей морфофункционального состояния слизистой оболочки пищевода в различные сроки после отмены ЦФ. Получены новые данные о том, что введение цитостатика в высоких дозах вызывает глубокие долгосрочные изменения, вследствие которых часть исследованных показателей не возвращаются к норме в течение продолжительного восстановительного периода.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Научное значение проведённого исследования состоит в расширении и дополнении имеющихся теоретических представлений о влиянии цитостатиков на морфофункциональное состояние слизистой оболочки пищевода. Полученные данные раскрывают ряд ведущих клеточных и тканевых механизмов развития осложнений цитостатической терапии, связанных с нарушением целостности эпителиального тканевого барьера, его регенерации, метаболизма и архитектоники, подавлением специфических и неспецифических защитных реакций, нарушением васкуляризации, расстройствами координированных взаимодействий различных тканей слизистой оболочки.
Практическое значение исследования состоит в обосновании необходимости постоянного контроля состояния слизистой оболочки пищевода при проведении цитостатической терапии с целью предотвращения развития её повреждения и своевременного назначения соответствующей корригирующей терапии. Данные о структурно-функциональных изменениях слизистой оболочки пищевода при введении цитостатиков необходимы для правильной оценки клинических данных, повышения эффективности морфологической диагностики, оптимизации способов лечения заболеваний пищевода.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Введение цитостатика алкилирующего ряда циклофосфана вызывает выраженные изменения в эпителии, соединительнотканном и сосудистом компонентах слизистой оболочки пищевода, обусловленные преимущественно цитотоксическим действием препарата. Глубина и динамика этих изменений зависят от дозы и режима введения препарата.
При кратковременном введении высоких доз циклофосфана в эпителии слизистой оболочки пищевода наблюдаются нарушения процессов пролиферации, дифференцировки и кератинизации, синтеза белков и хода окислительно-восстановительных процессов. В собственной пластинке отмечается отёк межклеточного вещества, который сопровождается нарушением вас-куляризации, снижением содержания клеток различных типов, изменениями их топографии и функциональной активности.
После отмены циклофосфана в течение 20 сут изученные морфо-функциональные показатели состояния слизистой оболочки пищевода лишь частично возвращаются к контрольным значениям, причём в эпителии процессы нормализации выражены в большей степени, чем в соединительной ткани.
При длительном введении умеренных доз циклофосфана в эпителии слизистой оболочки пищевода и в её собственной пластинке наиболее выраженные изменения некоторых морфофункциональных показателей отмечаются в начальные сроки эксперимента. В дальнейшем проявляются реакции компенсаторно-приспособительного характера, которые сильнее выражены в эпителии.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: - V конгрессе международной ассоциации морфологов (г. Уфа, 2000);
XXVII межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященной памяти акад. Е.Н. Павловского (Санкт-Петербург, 2000);
научной конференции «Актуальные вопросы клинической патоморфоло-гии» (Санкт-Петербург, 2000);
международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рожд. акад. П.Я. Герке (г. Минск, 2004);
VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Казань, 2004);
7-м и 8-м международных научных симпозиумах «Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки» (г. Архангельск, 2005,2006);
4-й и 5-й Всероссийских конференциях «Бабухинские чтения в Орле» (г. Орёл, 2005,2006);
научной конференции ученых-морфологов Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2006);
VIII конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Орёл, 2006);
конференции, посвященной 70-летию Тверской государственной медицинской академии и 100-летию со дня рожд. проф. И.С. Кудрина (г. Тверь, 2006);
II Международном эмбриологическом симпозиуме «Югра - эмбрио - 2006» (г. Ханты-Мансийск, 2006);
Всероссийской научной конференции, посвященной 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ (г. Белгород, 2006);
Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию БГМУ (г. Минск, 2006);
научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в вузе», посвященной 100-летию проф. Л.И. Фалина (Москва, 2007).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, включая 8 - в центральном журнале «Морфология».
Структурная организация и гистофизиология различных слоев слизистой оболочки пищевода
Покровный эпителий слизистой оболочки пищевода Общая характеристика. Эпителий пищевода взрослых млекопитающих животных и человека - многослойный плоский, его толщина у взрослого человека достигает 200-300 мкм [6, 8, 68, 71], а по некоторым данным, даже 500 мкм [149,261]. Величина этого показателя у детей в возрасте от 1 года до 5 лет составляет в среднем 136 мкм [213], у детей более старшего возраста она равна 164 мкм [102, 321]. В тех участках, где эпителий покрывает соединительнотканные сосочки собственной пластинки, его толщина составляет всего около одной трети от максимальной [149,272]. У лабораторных мышей толщина эпителия пищевода колеблется от 47 до 70 мкм [270]. В различных участках органа толщина эпителия пищевода существенно варьирует. В целом, в пищеводе человека она нарастает от средней трети органа к нижней [272]. Значительное увеличение толщины эпителия, в частности, сочетающееся с акантозом, рассматривают как патологический признак, поскольку оно отмечается при воспалительных процессах в органе - эзофагитах различной этиологии, а также при введении некоторых фармакологических препаратов [13,213,272,302].
Общее количество слоев клеток в эпителиальном пласте варьирует в зависимости от видовой принадлежности и возраста. Так, эпителий пищевода грудных детей содержит 6-9 слоев клеток, а взрослых людей - до 22-24 слоев [68, 149, 176]. В эпителии пищевода лабораторной мыши насчитывают 6-7 слоев ядросодержащих клеток [270].
Структурно-функциональные видовые различия в строении эпителия пищевода млекопитающих прежде всего определяются свойственным данному виду характером питания и связаны с наличием процесса ороговения в поверхностных слоях эпителия, его выраженностью и характером (по типу орто - или паракератоза). У животных, питающихся грубой растительной пищей (например, у грызунов, жвачных, парнокопытных и др.), эпителий содержит хорошо выраженный роговой слой, напротив, у хищных млекопитающих эпителий неороговевающий, а у животных со смешанным типом питания он может частично ороговевать, нередко с явлениями паракератоза [94, 136,178,270].
В поверхностном слое неороговевающего эпителия крупных млекопитающих содержится много дисульфидных групп цистеина, что указывает на незаконченность процесса формирования поперечных сшивок между полипептидными цепями, на незавершенную гистохимическую дифференциров-ку, то-есть на отсутствие кератинизации. Кроме того в ороговевающем эпителии обнаруживается тирозин, тогда как неороговевающий богат углевод-содержащими биополимерами (гликогеном и нейтральными полисахарида 16 ми), в нём также обнаружен сиаломуцин, хондроитинсульфат, кератансуль-фат [54].
У человека в норме эпителий пищевода - многослойный плоский нео-роговевающий. В старческом возрасте может отмечаться слабо выраженное ороговение эпителия, обычно происходящее механизмом паракератоза [74, 138]. Причины этого явления, однако, остаются невыясненными - одни исследователи считают такое ороговение результатом возрастных изменений, другие связывают его с питанием более грубой пищей вследствие потери зубов.
Вместе с тем, эпителий пищевода у человека сохраняет в полной мере способность к ороговению, которая проявляется в виде реактивных изменений или при некоторых патологических процессах. Так, в ответ на действие раздражающих факторов, таких как алкоголь, чрезмерно острая и горячая пища, курение, в эпителии пищевода человека проявляется способность к ороговению, которая в полной мере реализуется при бластоматозном росте в развитии плоскоклеточных раков пищевода с ороговением [6, 138]. Ярко выраженное ороговение эпителия пищевода человека отмечается в случаях хронического эзофагита с лейкоплакией, когда эпителий утолщается в несколько раз и формирует выраженный роговой слой [71, 138]. При патологических состояниях ороговение в эпителии пищевода человека часто протекает по типу паракератоза. В частности, при эзофагите в эпителиоцитах поверхностного слоя выявляются кератогиалиновые и паракератотические гранулы [168]. На электронно-микроскопическом уровне это проявляется неполным ороговением эпителия с избыточным накоплением цитокератиновых промежуточных филаментов, ядерными изменениями, которые достигают стадий пикноза и лизиса, а также аномалиями десквамации [41,144].
Общий план строения и классификация слоев эпителия. В многослойном плоском неороговевающем эпителии пищевода, в частности, у человека и хищных млекопитающих, гистологически обычно выделяют 3 слоя - базальный, шиповатый (промежуточный) и поверхностный, который име 17 нуют также функциональным [167,189], а в ороговевающем эпителии (у грызунов, жвачных и др.) - базальный, шиповатый, зернистый и роговой слои [68]. Базальный и шиповатый слои эпителия в отдельных участках врастают в подлежащую соединительную ткань собственной пластинки слизистой оболочки в виде эпителиальных гребешков; выросты собственной пластинки между гребешками образуют соединительнотканные сосочки [90,189].
Согласно другой гистологической классификации, эпителий пищевода подразделяют на две зоны - базальную, представленную несколькими слоями мелких малодифференцированных клеток, и зону дифференцированных, постепенно уплощающихся клеток. Базальная зона обладает сложным строением и содержит один слой клеток, располагающихся непосредственно на ба-зальной мембране (базальный слой), и вариабельное число слоев клеток, лежащих над ним (эпибазальные слои) [149, 273]. На базальную зону в норме приходится менее 10% толщины эпителия пищевода человека [149,176].
Клетки эпителия пролиферируют в базальной зоне и постепенно мигрируют в направлении поверхностных слоев. Клетки эпибазальных слоев, в отличие от базального, уже вступили на путь дифференцировки, однако все еще частично сохраняют способность к делению [273]. Миграция клеток к просвету органа сопровождается их выраженными фенотипическими и функциональными преобразованиями с последовательной экспрессией маркеров дифференцировки [182].
Морфометрические исследования
Для целей общегистологического исследования материал, фиксированный в течение 24 часов (см. выше), обрабатывали по стандартной гистологической методике и заливали в парафин. Поперечные срезы передней части пищевода на уровне щитовидного хряща толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином-эозином, а также азур II - эозином по Романовскому. При визуальной оценке изучали не менее 5 срезов у каждого животного. При этом учитывали следующие признаки: характер рельефа и соотношение толщины различных слоев слизистой оболочки, выраженность процесса ороговения в эпителии, цитологические особенности в эпителиоцитах каждого слоя, лейкоцитарная инфильтрация эпителия. В соединительнотканном компоненте слизистой оболочки пищевода визуально оценивали степень выра-женности отёка, соотношение количества клеток и межклеточного вещества, степень развития сосудов, их диаметр и кровенаполнение.
Для контроля цитостатического и иммунодепрессивного эффекта ЦФ у животных проводили также исследование органов иммуногенеза (тимуса и селезёнки).
Морфометрические исследования пищевода, проводимые на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, включали определение толщины всего эпителиального пласта и отдельно толщины его рогового слоя, а также толщины соединительнотканного компонента слизистой оболочки (собственной пластинки совместно с подслизистой основой). Измерения проводили с помощью линейного окулярного микрометра при увеличении х280 (окуляр 7, объектив х40). У каждого животного выполняли по 100 измерений указанных параметров на 5 срезах. В базальном слое эпителия подсчитывали фигуры митозов, просматривая не менее 2000 клеток у каждой мыши при увеличении 900 (окуляр 10, объектив х90). Митотическую активность (МА) выражали в промилле.
В соединительной ткани слизистой оболочки пищевода на парафиновых срезах, окрашенных азур П-эозином по Романовскому, определяли плотность расположения клеток фибробластического ряда, агранулоцитов, гранул оцитов и тучных клеток. Подсчёт производили при увеличении хбЗО (окуляр х7, объектив х90). Концентрацию клеток определяли на стандартной площади среза органа, для чего учитывали все вышеназванные клетки в пределах тест-сетки площадью 25600 мкм2 с последующим перерасчётом на ус-ловный 1мм площади соединительной ткани. Степень дегрануляции тучных клеток оценивали по полуколичественной 4 - балльной шкале [24]. Клетками с отсутствующей дегрануляцией считали те, цитоплазма которых была равномерно интенсивно метахроматически окрашена, отдельные гранулы визу ально не различались; клетками со слабо выраженной степенью деграну-ляции считали те, в цитоплазме которых наблюдалось большое количество частично различимых гранул, ядро не просматривалось; клетками с умеренно выраженной степенью дегрануляции считали те, у которых в цитоплазме наблюдалось умеренное количество гранул, образующих скопления и в то же время хорошо различимых по отдельности, ядро было визуально различимо; клетками с сильно выраженной степенью дегрануляции считали клетки с малым количеством одиночных гранул в цитоплазме и хорошо различимым ядром.
Относительный объём сосудов микроциркуляторного русла в соединительной ткани слизистой оболочки пищевода определяли стереологическим методом точечного счёта. Использовали тест-сетку окулярного микрометра с 25 точками; в ходе исследования учитывали данные, полученные при регистрации 1000 точек [1].
Гистохимические исследования проводились на парафиновых и крио-статных срезах. На парафиновых срезах для оценки содержания гликозами-ногликанов и гликопротеинов ставили ШИК-реакцию [63] и тетразолиевую реакцию на суммарные белки (гистидин, тирозин и триптофан) по Берстону [11].
Для получения криостатных срезов половину материала на всех сроках наблюдения замораживали в жидком азоте немедленно после извлечения, благодаря чему сохранялось прижизненное состояние метаболических процессов. Материал хранили в жидком азоте в сосуде Дьюара до момента резки, которую производили в криостате при температуре - 18С. Резку и постановку гистохимических реакций проводили одновременно для всего материала контрольных и экспериментальных групп после завершения эксперимента, с целью стандартизации методики гистохимического анализа [20].
На криостатных срезах пищевода толщиной 10 мкм выявляли активность фермента НАДН-диафоразы, который является индикатором состояния митохондрий [51, 52], отражая энергообеспечение клеток и характеризуя интенсивность обменных процессов в них. В настоящем исследовании НАДН-диафоразу выявляли тетразолиевым методом по Лойда [51].
Активность НАДН-диафоразы и содержание суммарных белков в эпителии оценивали путём абсорбционной цитофотометрии на спектроцитофо-тометре плаг-методом при объективе х40, окуляре х7, площади зонда 0,785 мкм2.
Длины волн, используемые для проведения исследований, равны максимумам поглощения соответствующих продуктов гистохимических реакций и составляют 545 нм для НАДН-диафоразы и 467 нм для продукта реакции выявления суммарных белков [20]. Результаты цитофотометрического анализа выражали в относительных единицах оптической плотности (D), соответствующей плотности поглощающего эквивалента, в котором одинаковое количество анализируемого вещества равномерно распределено в пределах того же поля. При этом соблюдение указанных параметров и их стандартизация обусловливают соответствие условий количественного анализа реакций в срезах закону абсорбционной цитофотометрии, основанному на физическом законе Ламберта-Бугера-Беера. Согласно последнему, необходимо соблюдение прямой пропорциональности между толщиной светопоглощающе-го слоя и величиной его оптической плотности, а также линейной зависимости между концентрацией измеряемого хромофора в срезе и значением его оптической плотности [20]
Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки пищевода при введении высоких доз циклофосфана и после его отмены
Экспериментальная группа (А). В слизистой оболочке пищевода уже после одной инъекции ЦФ (2-е сут эксперимента) эпителиальный пласт заметно утолщается (рис. 4). Роговой слой приобретает неравномерную тол шину, происходит его локальное расслоение на комплексы чешуек (рис. 5). Резко возрастает количество фигур митоза в базальном слое эпителия (рис. 6), появляются единичные митозы в шиповатом слое. На фоне введения ЦФ отмечаются преимущественно ранние профазы с начальной спирализацией хромосом и сохранением ядерной оболочки. В соединительной ткани появляются отдельные обширные светлые участки, не содержащие волокон и клеток, что можно расценить как начало развития отёка в межклеточном веществе, однако общая толщина соединительнотканного компонента внешне не изменяется (рис. 6). Количество фибробластов и агранулоцитов заметно снижается. Кровеносные сосуды сужаются, уменьшается количество выявляемых сосудов и степень их кровенаполнения. Количество тучных клеток снижается, большая их часть локализуется в собственной пластинке слизистой оболочки, заметно возрастает доля клеток с сильной степенью дегрануляции (рис. 7). Слизистая оболочка приобретает более выраженный складчатый характер. Базальная мембрана становится неровной, несколько возрастает степень выраженности соединительнотканных сосочков (рис. 8).
После 3 инъекций ЦФ (6-е сут эксперимента) эпителиальный пласт и особенно его роговой слой сильно утолщены. Развивается интерстициальный отёк в зоне расширенных межклеточных пространств, особенно в шиповатом слое и в глубоких отделах зернистого слоя (рис. 9). Контуры базальной мембраны становятся нечёткими, базальные клетки в ряде случаев утрачивают полярность, располагаются неупорядоченно, образуя подобие многорядного пласта. Цитоплазма клеток базального слоя либо проявляет сильную базофи-лию, либо просветлена, вакуолизирована по типу койлоцитоза (рис. 9).
Количество рядов клеток в шиповатом слое возрастает до 4 - 5. Объём их цитоплазмы увеличивается. Клетки глубоких отделов шиповатого слоя сильно уплощаются, их цитоплазма очень интенсивно окрашивается основными красителями (рис. 10, 11). В то же время более поверхностно лежащие клетки шиповатого слоя увеличиваются в объеме, их ядра гипертрофированы и просветлены (рис. 12). В эпителиоцитах зернистого слоя происходит уменьшение количества кератогиалиновых гранул, в то же время размер гранул увеличивается (рис. 13). В шиповатом и зернистом слоях выявляются эпителиоциты с ядрами неправильной формы и инвагинациями ядерной оболочки, в отдельных случаях отмечается кариорексис. В роговом слое часто наблюдаются изменения, свидетельствующие о нарушении процесса ороговения: явления гиперкератоза, разрыхление пласта чешуек. Рельеф в целом часто приобретает зубчатые очертания (рис. 14). Внутриэпителиальные лейкоциты встречаются очень редко. Фигуры митоза единичны, встречаются только в базальном слое эпителия.
В подлежащем соединительнотканном компоненте усиливается отёк, в результате чего значительно возрастает его толщина. Коллагеновые волокна и их мелкие пучки располагаются неравномерно, разделены обширными просветлёнными пространствами. Вблизи базальной мембраны выявляется бесклеточная зона. Существенно уменьшается количество клеток фибробласти-ческого и, особенно, лейкоцитарного ряда по сравнению с контрольными данными (рис. 11). Тучные клетки немногочисленны, расположены они по большей части в глубоких отделах соединительнотканного слоя, проявляя различную степень дегрануляции (рис. 15). В соединительной ткани возрастает количество клеток с тёмными пикнотическими ядрами по сравнению с предыдущими сроками наблюдения. Значительно снижены количество визуально определяемых кровеносных сосудов и степень их кровенаполнения по сравнению с контрольными данными. В отдельных участках неравномерно возрастает выраженность соединительнотканных сосочков.
После 4 инъекций ЦФ (8-е сут эксперимента) эпителиальный пласт, как и в предыдущие сроки наблюдения, утолщён, но толщина рогового слоя несколько уменьшается по сравнению с данными, полученными на 2-е и 6-е сут опыта. Количество фигур митоза в эпителии очень незначительно. Соединительнотканный компонент сильно утолщён по сравнению с таковым у животных контрольной группы, в нём отмечается выраженный отёк. Коли чество тучных клеток, как и в предыдущие сроки эксперимента, уменьшено, присутствуют клетки с разной степенью дегрануляции, локализуются они преимущественно вблизи базальной мембраны эпителия, в поверхностных отделах собственной пластинки (рис. 16). Количество других клеточных элементов соединительной ткани также снижено, особенно агранулоцитов и гра-нулоцитов. Кровеносные сосуды малого диаметра, выявляются в небольшом количестве.
Через 5 сут после отмены цитостатика (10-е сут наблюдения) толщина эпителиального пласта по-прежнему увеличена по сравнению с таковой у животных контрольной группы, при этом роговой слой характеризуется неравномерно выраженным утолщением, в нём чередуются участки с сильно разрыхлёнными чешуйками и зоны их компактного расположения, в которых роговой слой истончён (рис. 17). В базальном слое наблюдается дезорганизация клеток, нарушение их правильного расположения. Базальная мембрана выражена неотчётливо. Цитоплазма клеток базального слоя характеризуется резко выраженной базофилией. Клетки глубоких отделов шиповатого слоя в отдельных участках пласта сильно уплощены, их цитоплазма также интенсивно базофильна, тогда как цитоплазма клеток вышележащих отделов шиповатого слоя значительно просветлена. Межклеточные промежутки в шиповатом слое, как и при введении ЦФ, расширены. Зернистый слой либо вообще не выражен, либо представлен клетками со слабоокрашенной цитоплазмой и малым количеством мелких кератогиалиновых гранул (рис. 18). Наблюдается незначительная инфильтрация эпителия одиночными аграну-лярными лейкоцитами. Фигуры митоза встречаются очень редко, только в базальном слое эпителия. Граница эпителия и соединительной ткани как правило - ровная, но в ряде случаев имеются невысокие сосочки, вдающиеся в эпителий.
Структурно-функциональная характеристика слизистой оболочки пищевода у животных контрольных групп
Группа Кі. В группе контрольных животных продукт выявления PCNA определяется в виде мелкозернистого тёмно-коричневого осадка диамино-бензидина, который равномерно распределён в ядрах некоторых эпителио-цитов базального и шиповатого слоев и не выявляется в цитоплазме. Ядра клеток, не дающих PCNA+- реакции, окрашены метиловым зелёным (рис. 50).
Количество PCNA+-mieTOK в базальном слое эпителия контрольных животных составляет 52,9 ± 3,2%, в шиповатом слое - 31,1 ± 1,8%.
Экспериментальная группа (А). Количество PCNA+-memoK в базальном слое эпителия при введении цитостатика на 2-е сут наблюдения значимо снижается по сравнению с величиной показателя в группе Кі на 27%, достигая минимального значения, а на 6-е сут превышает величину контрольных показателей на 23%. На 20-е сут наблюдения (15 сут после отмены ЦФ) величина показателя превышает контрольные значения уже на 58% (рис. 54, табл. 16), достигая максимума. Кроме того, значение показате ля на 2-е сут на 41% ниже, чем на 6-е сут, и на 54% ниже, чем на 20-е сут опыта. Величина показателя на 20-е сут наблюдения на 28% выше, чем на 6-е сут (рис. 51, 52, 53, 54, табл. 16).
Количество PCNA -клеток в шиповатом слое эпителия на 6-е сут наблюдения превышает величину показателя в группе Кі на 99%, а на 20-е сут - на 71% (рис. 55, табл. 17). Величины показателя на 6-е сут эксперимента, достоверно выше, чем на 2-е и на 20-е сут - на 121% и 16% соответственно. Значения показателя на 20-е сут опыта на 90% выше, чем на 2-е сут (рис.51, 52, 53, 55, табл. 17).
Группа Ki. Клетки Лангерганса на срезах пищевода выявляются благодаря избирательной маркировке белком S-100. Продукт выявления белка S-100 определяется в виде тёмно-серого осадка диаминобензидина, равномерно распределённого в цитоплазме отростчатых клеток Лангерганса в составе эпителиального пласта (рис. 56, 57). На срезах пищевода клетки Лангерганса сравнительно немногочисленны, распределение этих клеток неравномерно по длине и толщине эпителиального пласта, они сконцентрированы преимущественно в области складок слизистой оболочки. Клетки Лангерганса характеризуются утолщённым телом, от которого отходят отростки. На одном срезе обнаруживаются, как правило, отростки 1-2 клеток. У животных контрольной группы тела этих клеток располагаются на уровне шиповатого слоя эпителия. При этом один длинный отросток направляется к поверхности рогового слоя, другой - к базальной мембране, то-есть эти клетки занимают всю толщу эпителиального пласта (рис. 56,57)
Поскольку клетки Лангерганса единичны и распределены неравномерно в различных участках эпителиального пласта, их корректная количественная оценка затруднена. В этой связи содержание клеток Лангерганса оценивалось лишь путём визуального анализа.
Экспериментальная группа (А). Количество клеток Лангерганса в эпителии пищевода, выявляемых по экспрессии белка S-100, на всех сроках наблюдения при введении высоких доз ЦФ резко снижено. На многих срезах клетки Лангерганса полностью отсутствуют. На 20-е сут опыта (15-е сут после введения ЦФ) в эпителиальном пласте отмечено появление одиночных клеток Лангерганса меньшего размера, чем у животных контрольной группы, их тела лежат в шиповатом слое, отростки слабо выражены (рис. 58,59).
Экспериментальная группа (Б). В слизистой оболочке пищевода на 16-е сут введения умеренных доз ЦФ эпителиальный пласт утолщён, преимущественно за счёт рогового слоя, который в отдельных участках разрыхляется (рис. 60). В эпителии отмечается усиление инфильтрации лейкоцитами мононуклеарного ряда по сравнению с животными группы Кг (рис. 61, 62). Количество фигур митоза в базальном слое эпителия увеличено, появляются одиночные фигуры митоза и в шиповатом слое (рис. 63). Толщина соединительнотканного компонента несколько уменьшена по сравнению с контрольными животными, но в нём значительно возрастает количество сосудов и их диаметр, степень кровенаполнения сосудов умеренная или слабая (см. рис. 61). Отмечено некоторое усиление ШИК - реакции в межклеточном веществе соединительной ткани. Количество тучных клеток значительно уменьшено по сравнению с животными группы Кг, они расположены преимущественно в подслизистой основе, преобладают клетки со слабо выраженной степенью дегрануляции (рис. 64).
На 32-е сут эксперимента эпителий слизистой оболочки пищевода в отдельных участках приобретает зубчатый рельеф (рис. 65). В некоторых случаях отмечается истончение всего эпителиального пласта. Эпителиоциты базального слоя лежат в несколько рядов, теряя упорядоченное расположение.
