Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Современные представления о структуре и функциях тимуса ...И
1.1.1. Морфо-функциональная характеристика тимуса 11
1.1.2. Источники развития тимуса 13
1.1.3. Гормональная регуляция функций тимуса 14
1.1.4. Возрастная инволюция тимуса 14
1.1.5. Акцидентальная инволюция тимуса 15
1.1.6. Клеточный состав дольки тимуса 17
1.1.6.1. Эпителиальные клетки тимуса 17
1.1.6.2. Структурно-функциональные зоны дольки тимуса 19
1.1.6.3. Лимфоциты тимуса, их дифференцировка и селекция 22
1.2. Гуморальные факторы тимуса « .25
1.2.1. Гормоны тимуса 25
1.2.2. Цитокины 26
1.2.3. Нейропептиды 27
1.2.4. Простагландины 28
1.2.5. Монооксид азота (N0) 29
1.3. Влияние антигенной стимуляции иммунной системы на тимус 33
Глава 2. Материал и методы исследования 36
Глава 3. Результаты собственных исследований 41
3.1. Морфология тимуса крыс в норме и после введения бактериального ЛПС 41
3.2. Интенсивность апоптоза в тимусе крыс в норме и после введения бактериального ЛПС 45
3.3. Экспрессия молекул МНС класса І в тимусе крыс в норме и после введения ЛПС 50
3.4. Уровень экспрессии нейрональной и индуцибельной изоформ нитроксидсинтазы в тимусе крыс в норме и после введения ЛПС 54
3.5. Экспрессия мРНК циклооксигеназы-2 в клетках тимуса крыс в норме и после введения ЛПС 59
3.6. Экспрессия мРНК кортикотропин-рилизинг гормона клетками тимуса крыс в норме и после введения ЛПС 63
3.7. Состояние НПУ-иммунопозитивных структур и синтеза мРНК нейропептида Y в тимусе крыс в норме и после введения ЛПС 64
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 68
4.1. Апоптоз тимоцитов - механизм центральной негативной селекции 68
4.2. Увеличение авидности связи тимоцит - антигенпрезентирующая клетка как ключевой фактор негативной селекции тимоцитов 71
4.3. Костимуляторы негативной селекции 76
4.3.1. Монооксид азота 77
4.3.2. Простагландины 81
4.3.3. Нейропептиды 82
4.3.3.1. Кортикотропин - рилизинг гормон 82
4.3.3.2. Нейропептид Y 84
Заключение 85
Выводы 87
Список литературы 88
- Структурно-функциональные зоны дольки тимуса
- Интенсивность апоптоза в тимусе крыс в норме и после введения бактериального ЛПС
- Экспрессия мРНК циклооксигеназы-2 в клетках тимуса крыс в норме и после введения ЛПС
- Увеличение авидности связи тимоцит - антигенпрезентирующая клетка как ключевой фактор негативной селекции тимоцитов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Способность отличать «свое» от «чужого» является фундаментальной особенностью иммунной системы. Иммунные реакции, направленные на элиминацию чужеродных антигенов, равно как и поддержание состояния ареактивности иммунной системы к собственным антигенам (аутотолерантность) обеспечиваются механизмами, в которых ключевая роль отводится Т-лимфоцитам.
Т - клеточная толерантность формируется на двух уровнях: в тимусе, в ходе ранней дифференцировки тимоцитов (центральная толерантность) и вторичных лимфоидных тканях после заселения их экспортированными из тимуса лимфоцитами, избежавшими негативной селекции (периферическая толерантность) (Sprent J., Webb S.R., 1995).
Исследования последнего времени позволили сформулировать гипотезу о том, что ключевым фактором в негативном отборе потенциально аутореактивных тимоцитов в тимусе может служить прочность связи их рецепторов с презентированными на клетках тимусной стромы аутоантигенами в составе молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС). Созревающие дубльпозитивные CD4+CD8+ Т-клетки, экспрессирующие высокоафинные рецепторы к аутоантигенам, подвергаются клональной делеции посредством программируемой клеточной гибели (апоптоза). Тимоциты, чьи рецепторы обладают умеренной аффинностью к аутоантигенам, избегают элиминации и дифференцируются в одиночно позитивные CD4+ или CD8+ Т-лимфоциты (Sprent J. et al., 1988; Schwartz R. H., 1989).
В процесс негативной селекции вовлечен также целый ряд костимуляторных паракринных факторов, секретируемых клетками тимусного микроокружения. Результаты недавних исследований позволяют предположить, что к числу таких регуляторов могут относиться синтезируемые клетками стромы тимуса нейропептиды (Geenen et al., 1989;
6 Geenen et al., 1998), простагландины (Mastino A. et al., 1992; Pica F. et al., 1996) и растворимый свободнорадикальный газ NO (Tai X.-G. et al., 1997; Aiello S. et al., 2000). Следует признать, однако, что к настоящему времени не получено достаточно полных экспериментальных данных, которые позволили бы сформировать целостное представление о роли этих медиаторов в центральных механизмах негативной селекции.
Одной из актуальных проблем как теоретической, так и клинической иммунологии остается вопрос о внутритимусных клеточных взаимодействиях, которые могут модулировать интенсивность процесса негативной селекции и, таким образом, оказывать влияние на эффективность аутоиммунных реакций организма. Одним из перспективных подходов к решению этой проблемы может быть исследование клеточных и молекулярных механизмов малоизученного феномена интенсификации процесса негативной селекции в тимусе в ответ на попадание в организм чужеродных антигенов (Zhang Y.H. et al., 1993). Выявление тонких механизмов этой реакции может стать основанием для нового взгляда на устоявшееся представление о тимусе как области антигеннезависимой дифференцировки Т-лимфоцитов.
В основу предпринятого исследования, посвященного их изучению, легла рабочая гипотеза о том, что вышеперечисленные внутритимусные факторы в той или иной мере могут быть вовлечены в модуляцию негативной селекции потенциально аутореактивных Т-клеток в условиях антигенной активации иммунной системы.
Недостаточность сведений о молекулярных и клеточных механизмах реагирования тимуса на введение в организм чужеродных антигенов послужило основанием для постановки цели и определения задач диссертационного исследования.
Цель исследования: выявить закономерности реактивных изменений тимуса крыс при введении бактериального липополисахарида.
Задачи исследования:
Изучить интраорганную локализацию и интенсивность процесса апоптоза тимоцитов в норме и после интраперитонеального введения бактериального липополисахарида.
Оценить влияние периферического введения липополисахарида на распределение и интенсивность экспрессии молекул главного комплекса гистосо
Выявить локализацию и исследовать интенсивность синтеза циклооксигеназы - 2, участвующей в синтезе простагландинов, и нейропептидов (кортикотропин-рилизинг гормон, нейропептид Y) в клетках тимуса крыс в норме и после введения липополисахарида.
Определить топографию клеток тимуса, экспрессирующих нейрональную и индуцибельную изоформы NO-синтазы и сравнить интенсивность экспрессии этих ферментов до и после введения бактериального эндотоксина.
Научная новизна
Проведенное с помощью методов иммуногистохимии и гибридизации in situ исследование позволило выявить новые аспекты морфо-функциональной организации тимуса в условиях нормы и в ответ на введение в организм бактериального эндотоксина. Итоги предпринятого исследования дали новую информацию по следующим вопросам:
Впервые установлен факт экспрессии нейрональной изоформы NO-синтазы стромальными клетками мозгового вещества тимуса крыс.
Впервые обнаружен разнонаправленный характер экспрессии индуцибельной и нейрональной изоформ NO-синтаз нитроксидэргическими клеточными популяциями тимуса крыс в ответ на поступление в организм антигена.
Впервые описан феномен повышения экспрессии молекул МНС класса I на клетках стромы тимуса после интраперитонеального введения бактериального эндотоксина.
Впервые изучена динамика апоптоза тимоцитов на ранних этапах формирования иммунного ответа.
В тимусе обнаружена ЛПС-индуцируемая экспрессия мРНК циклооксигеназы-2 и прослежена связь интенсивности процесса апоптоза тимоцитов с уровнем синтеза простагландинов в определенных зонах тимуса крыс.
Представлена оригинальная схема механизма негативной селекции тимоцитов, учитывающая роль синтезируемых в тимусе кофакторов селекции и обнаруженный феномен «лабильной» авидности связи тимоцит - антигенпрезентирующая клетка. Научно-практическая значимость
Результаты предпринятого исследования расширяют представление о морфологии и функциях тимуса, как в норме, так и в условиях антигенной стимуляции иммунной системы. Новые сведения, представленные в работе, могут быть интересны в плане дальнейшей расшифровки механизмов регуляции тимоцитопоэза, анализа взаимодействия структурных компонентов тимусного микроокружения и развивающихся лимфоцитов.
Практическая значимость исследования этих вопросов определяется тем фактом, что проблема патогенеза аутоиммунных расстройств остается открытой. Данные о том, что в основе целого ряда иммунопатологии, таких как аутоиммунные и иммунодефицитные заболевания, лежат нарушения в регуляции процесса апоптоза созревающих Т-клеток в тимусе (Такеока Y. et al., 1999; Hayashi Т., Faustman D.L., 2003), определяет необходимость исследований в этой области. Изучение факторов, модулирующих развитие апоптоза, может стать основой для разработки подходов к фармакологической коррекции процессов программируемой клеточной смерти и, как следствие, предотвращению развития многих' иммунных нарушений.
Материалы диссертационного исследования могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах гистологии, физиологии, иммунологии медицинских ВУЗов и биологических факультетов университетов. Полученные данные и выводы нашли отражение в лекциях по курсу гистологии для студентов Ижевской государственной медицинской академии, Удмуртского государственного университета, Ижевской сельскохозяйственной академии.
Основные положения, выносимые на защиту
Авидность взаимодействия тимоцитов с антигенпрезентирующими клетками кортико-медуллярной и субкапсулярной зон тимуса определяет интенсивность процесса негативной селекции. Введение в организм бактериального антигена увеличивает экспрессию молекул МНС класса I на антигенпрезентирующих клетках и авидность их связи с тимоцитами, что приводит к усилению негативной селекции последних в виде апоптоза.
Негативная селекция протекает под контролем множественных костимуляторных сигналов со стороны антигенпрезентирующих клеток тимуса. Усиление апоптоза тимоцитов после введения в организм бактериального эндотоксина протекает на фоне повышенной секреции проапоптогенных молекул монооксида азота и простагландинов в областях негативной селекции.
В мозговом веществе тимуса локализуются две различные популяции стромальных клеток, экспрессирующие индуцибельную или нервную изоформы фермента нитроксидсинтазы и демонстрирующие разнонаправленное изменение экспрессии фермента после введения бактериального липополисахарида. В процессы негативной селекции вовлечены дендритные клетки кортико-медуллярной области, синтезирующие индуцибельную изоформу нитроксидсинтазы.
Структура и объем диссертации
Диссертация объемом 120 страниц машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 3 таблицами, 30 микрофотографиями. Список литературы включает 322 отечественных и зарубежных источника.
Структурно-функциональные зоны дольки тимуса
В отношении гистотопографии отдельных зон дольки тимуса до настоящего времени нет единого мнения. Разные авторы выделяют различные структурно-функциональные зоны в коре и мозговом веществе вилочковой железы, что создает сложность в использовании какой-либо одной классификации строения этого органа. По данным одних авторов, каждая долька состоит из 3 зон: корковой, кортикомедуллярной и мозговой (медуллярной) (Зуфаров К.А., Тухтаев К.Р., 1987; Duijvestijn A.M., Hoefsmit Е.С.М., 1981). Другие исследователи выделяют 5 зон: подкапсулярную, центральную зону коркового вещества, зону, пограничную с мозговым веществом, центральную зону мозгового вещества и зону, пограничную с « корковым веществом (Сапин М.Р., 1996; Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 2000).
Предложено также подразделение долек тимуса на 4 зоны: 1) субкапсулярную 2) внутреннюю кортикальную 3) медуллярную (мозговое вещество), 4) внутридольковые периваскулярные пространства (Харченко В.П., 1998; Clark S., 1963).
Субкапсулярная зона расположена непосредственно под базальной мембраной долек и занимает примерно ХА часть ширины коры. Она представлена сетью светлых эпителиальных клеток, в ячейках которой расположены лимфоидные клетки, представленные пре-Т-лимфоцитами, а также немногочисленные макрофаги. При ультраструктурном исследовании в субкапсулярной зоне обнаружены клетки 1,2 и 3 типа по классификации Г.А. Галил-Оглы и соавт. (1988). Первый тип клеток формирует непрерывный слой, лежащий на базальной мембране и являющийся компонентом гемато-тимического барьера. Клетки 2 типа являются клетками-«няньками», которые впервые были выделены из коры тимуса мыши и описаны Н. Wekerle, V. Ketelson (Wekerle Н., Ketelson V., 1980). Позднее они были обнаружены и в вилочковой железе человека (Ritter М. et al., 1981; Brelinska R., Warchol J.B., 1997). Клетки-«няньки» экспрессируют молекулы МНС I и II классов, секретируют окситоцин и вазопрессин, содержат в инвагинациях цитоплазмы от нескольких до 200 кортизончувствительных незрелых тимоцитов. Эти комплексы, по-видимому, образуются с целью создания наиболее подходящих условий для межклеточных взаимодействий (de Waal Malefijt R. et al., 1986). В субкапсулярной зоне находятся также макрофаги, способные осуществлять фагоцитоз. Макрофаги могут выделять интерлейкин-1 (ИЛ-1) и простагландины (Janossy G., 1986). Сосудистый компонент субкапсулярной зоны представлен капиллярами с толстой базальной мембраной и узкими перикапиллярными пространствами с единичными зрелыми Т-лимфоцитами, В-лимфоцитами, макрофагами, тучными клетками. Роль субкапсулярной зоны заключается в создании условий для пролиферации и начальных этапов созревания лимфоцитов.
Эпителиальный остов внутренней кортикальной зоны образован клетками, по своей ультраструктуре соответствующими 3 и 4 типу по Г.А. Галил-Оглы. Клетки-«няньки» в этой зоне отсутствуют. Во внутренней кортикальной зоне содержится до 60-80% всех лимфоцитов вилочковой железы. Важной особенностью дифференцировки лимфоцитов в этой зоне является формирование у них Т-клеточного рецептора к антигену. Полагают, что здесь происходит отбор и элиминация аутоагрессивных Т-лимфоцитов (Белецкая Л.В., Гнездицкая Э.В., 1975; Webb S.R., Sprent J., 1990). Созревшие аутотолерантные лимфоциты либо мигрируют из тимуса в области кортико-медуллярной границы, либо переходят в медуллярную зону. Макрофаги внутренней кортикальной зоны аналогичны субкапсулярным. Примерно 50% их имеют признаки активации, в частности экспрессируют продукты генов МНС II класса, выделяют цитокины - ИЛ-1 и 6, ФНОа, служащие кофакторами роста тимоцитов. Преимущественно в кортико-медуллярном сочленении локализуются дендритные клетки (ДК). Количество дендритных клеток велико, электронномикроскопически они отличаются крупным ядром с неправильными контурами, широкой цитоплазмой с длинными отростками, небольшим числом органелл, в них обнаруживаются гранулы Бирбека (Kendall M.D., 1991). Дендритные клетки обладают высокой активностью в качестве антигенпрезентирующих (благодаря высокой степени экспрессии молекул МНС) клеток. Они секретируют ИЛ-1, простагландины Е2, F2 и другие. Вокруг них нередко можно видеть розетки из Т-лимфоцитов (Kyewski В. et al., 1986). Макрофаги и особенно дендритные клетки играют роль факторов микроокружения при выбраковке потенциально аутоагрессивных клонов. Эти функции реализуются при условии формирования прямых межклеточных контактов. Ключевую роль при этом играют взаимодействия мембранных комплексов МНС-пептид, представленных на дендритных клетках, с рецепторами для антигенов тимоцитов, а также взаимодействие /32-интегринов с молекулами ICAM-1, при этом адгезивные взаимодействия играют вспомогательную роль в качестве факторов, усиливающих основной сигнал (Sprent J. et al., 1990; Arudchelvan Y. et al., 2002).
В коре тимуса S.Clark (1963) выделил структурную единицу, представленную ячейкой сети эпителиальных клеток, содержащей лимфоциты и макрофаги с прилегающим кровеносным сосудом (Clark S., 1963).
Мозговое вещество долек состоит из густой сети крупных эпителиальных клеток. Основная масса клеток, образующих сеть медуллярной зоны, представлена клетками, ультраструктура которых соответствует 5, 6, 7 и 8 типу по Г.А. Галил-Оглы. В медуллярной зоне расположены тельца вилочковой железы (тельца Гассаля). Помимо эпителиальных клеток в мозговом веществе обнаружены миоэпителиальные клетки (Itoh Т. et al., 1969). Медуллярная зоЪа отличается большим числом клеток мезенхимального происхождения - дендритных клеток и макрофагов.
Лимфоциты тимуса, их дифференцировка и селекция Лимфоидные клетки составляют подавляющее большинство клеток тимуса. В костном мозге формируются (по-видимому, из общего лимфоидного предшественника) ранние предшественники Т-лимфоцитов. Они лишь частично детерминированы к развитию в направлении Т лимфоцитов, сохраняя способность при соответствующих условиях развиваться в направлении В-лимфоцитов, дендритных клеток, естественных киллеров (Shortman К., Wu L., 1996). Механизмы миграции предшественников Т-лимфоцитов в тимус изучены недостаточно. Предполагают, что в основе этого процесса лежат закономерности, свойственные хомингу лимфоцитов, т.е. направленной миграции лимфоцитов в органы иммунной системы. Роль проводников в тимус выполняют адгезивные молекулы CD44 (распознают производные гиалуроновой кислоты, адрессины эндотелиальных клеток, компонент межклеточного матрикса фибронектин), интегрины VLA-6 и 4 (распознают молекулу эндотелия VCAM-1, фибронектин и ламинин), L-селектин распознает углеводные остатки мембранных белков клеток гематотимического барьера. Инвазивность протимоцитов проявляется в расплавлении мембранных структур благодаря выделению гиалуронидазы и коллагеназы. Важную роль в миграции клеток-предшественников в тимус играют хемотаксические сигналы, роль которых, как полагают, выполняют хемокины (Ярилин А.А. и соавт., 1991; Jalkonen S. et al., 1986).
Интенсивность апоптоза в тимусе крыс в норме и после введения бактериального ЛПС
Иммунопозитивные к молекулам главного комплекса гистосовместимости класса I клетки стромы тимуса контрольной группы животных выявлялись в виде немногочисленных светящихся клеток в субкапсулярной зоне и в мозговом веществе, причем большая часть выявленных клеток находилась вблизи кортико-медуллярной границы. Единичные иммунореактивные клетки встречались и в корковом веществе. Клетки кортико-медуллярной области, меченные антителами к молекулам МНС I, располагались в виде широкой сети и могли залегать в поверхностных слоях мозгового вещества (рис. 3.6). Иммунореактивный продукт часто выявлялся в виде мелких окрашенных пятен на поверхности клеток и по внешнему виду напоминал картину, характерную для кластеров молекул МНС, несущих антигенный пептид, на поверхности антигенпредставляющей клетки при формировании зоны контакта с рецепторами Т-лимфоцита. Предполагается, что такая структура позволяет достичь необходимого уровня сродства Т-клеточных рецепторов и комплексов пептид/МНС, а благодаря периферическому кольцу, образованному молекулами адгезии, стабилизировать взаимодействие (Ярилин А.А. 2000; Ярилин А.А., 2001).
Как известно, все типы клеток, за редким исключением, экспрессируют на своей поверхности молекулы главного комплекса гистосовместимости класса І. В нашем эксперименте меченой оказалась лишь малая часть клеток стромы тимуса. Возможно, непрямой иммуногистохимический метод обладает недостаточной чувствительностью и позволяет выявить клетки с очень высокой экспрессией молекул МНС I. Однако не исключено, что наблюдаемая картина отражает органную специфичность, выражающуюся в низких уровнях экспрессии МНС на клетках тимуса в норме. В пользу этого свидетельствуют и данные Rouse R.V. et al. (1979), проводивших окрашивание срезов тимуса мыши с помощью антител, специфичных к молекулам МНС I, при этом мечеными оказались только клетки мозгового вещества, в то время как в корковом веществе продукты иммуногистохимической реакции не были выявлены (Rouse R.V., 1979).
Цитотопография и морфология меченых клеток в субкапсулярной зоне позволяет предположить их принадлежность к группе так называемых клеток-«нянек». Как было подтверждено исследованиями ряда авторов (Wekerle Н. et al., 1980; Brelinska R. et al., 1997), данный клеточный тип действительно экспрессирует на своей поверхности высокие уровни молекул главного комплекса гистосовместимости. Это представляется целесообразным, если принять во внимание свидетельства участия клеток-«нянек» в селекции тимоцитов, в основе которой лежит взаимодействие рецепторов тимоцитов с молекулами МНС (Kyevski В., 1996; Penninger J. et al., 1992).
Большая часть клеток, иммунопозитивных к белкам МНС I обнаруживается на кортико-медуллярной границе. Имеются данные о том, что на клетках этой зоны тимуса уровень поверхностных молекул МНС I примерно в 10 раз выше, чем на эпителиальных клетках коркового вещества (Delaney J. R. et al., 1998). Такое положение может быть обусловлено тем, что в кортико-медуллярной зоне локализуются дендритные клетки, отличающиеся высокой экспрессией молекул МНС и ответственные за реализацию негативной селекции тимоцитов.
Через 4 часа после введения бактериального эндотоксина значительно возрастало число клеток, иммунореактивных к молекулам МНС І в субкапсулярной зоне (+148,1±8,2%; Р 0,01) и кортико-медуллярной области (+167,1±6,8%; Р 0,01), а также повышалась интенсивность их свечения (+37,7±3,2%; Р 0,05) и (+46,9±4,0%; Р 0,05) соответственно, по сравнению с контрольными животными (табл.3.2; рис. 3.6).
Можно предположить, что наблюдаемое в эксперименте усиление экспрессии гликопротеинов МНС I на клетках стромы тимуса приводит к повышению авидности их взаимодействия с тимоцитами. Авидность характеризует силу взаимодействия тимоцита и антигенпредставляющей клетки и зависит как от уровня экспрессии комплекса МНС-пептид на антигенпрезентирующей клетке, так и от аффинности и концентрации на поверхности Т-клеток антигенраспознающих рецепторов (ТКР) и корецепторных молекул. В настоящее время авидность взаимодействия ТКР и комплексов МНС-пептид рассматривается как ведущий фактор, определяющий судьбу созревающих тимоцитов. Предполагается, что в ходе негативной селекции тимоциты, демонстрирующие высокую авидность связи с дендритными клетками и макрофагами кортико-медуллярной зоны и мозгового вещества тимуса, погибают посредством апоптоза (Ashton-Rickardt P. et al., 1994; Janeway С.А., 1994; Girao С. et al., 1997; Ober B.T. et al., 2000). Таким образом, рост экспрессии молекул МНС I на клетках этих областей, и соответствующее повышение авидности взаимодействия тимоцитов и тимуснои стромы может стимулировать процесс отрицательной селекции тимоцитов.
Экспрессия мРНК циклооксигеназы-2 в клетках тимуса крыс в норме и после введения ЛПС
Апоптоз или «программированная гибель» в процессе развития клеток иммунной системы выступает как в роли регулятора общей численности клеточных популяций, так и в качестве фактора отбора (Woronitz J.D. et al., 1994; WuM.X. etal., 1995).
Еще в 60-х годах был установлен факт гибели большей части (до 98%) развивающихся клеток Т-ряда внутри тимуса (Koller В.Н. et al., 1990; Shortman К. et al., 1991) и эта гибель позже была квалифицирована как проявление апоптоза (Ярилин А.А., 1999; Murphy К.М. et al., 1990). Между тем, в нашем исследовании тимуса крыс контрольной группы, тимоциты в состоянии апоптоза обнаруживались лишь в субкапсулярной области и на кортико-медуллярной границе, причем, в незначительном числе (0,7% и 5%, соответственно, от общего числа тимоцитов на срезе). Исследователи, ранее столкнувшиеся с трудностью выявления апоптозных Т-клеток в тимусе, объясняли этот феномен быстрым фагоцитозом клеток, вступивших в стадию программируемой клеточной смерти (Surch CD., Sprent J., 1994). Однако такое объяснение не вносит ясности в наблюдаемую нами картину присутствия апоптозных клеток в вышеназванных областях тимуса.
В поисках возможной интерпретации этого феномена уместно вспомнить, что в соответствии с современными представлениями апоптоз -явление неоднородное. Так, в зависимости от факторов, индуцирующих апоптоз, различают несколько его вариантов, которые можно дифференцировать по биохимическим проявлениям.
Выявлены, по меньшей мере, две формы апоптоза тимоцитов, одна из которых обусловлена действием глюкокортикоидов (Cohen G.M. et al., 1994), а другая - связыванием рецепторного комплекса TCR-CD3 с антигенами или иными лигандами (Green D.R. et al., 1992). Первый тип апоптоза имеет отношение к процессу положительной селекции: его «жертвами» становятся клетки, не поддерживаемые отбором, т.е. клоны тимоцитов, рецептор которых не распознает аутологичные молекулы главного комплекса гистосовместимости классов II и I (Von Boehmer Н., 1997). Активационный апоптоз, обусловленный связыванием рецептора для антигена, служит основой отрицательной селекции, приводящей к делеции аутореактивных клонов (клеток, распознающих комплекс аутологичного пептида с аутологичными молекулами МНС) (Nossal G.J.V., 1994; Sprent J., Webb S.R., 1995).
В корковой области, где, как известно, происходит интенсивная гибель тимоцитов, не прошедших положительную селекцию, мы не обнаруживали клеток в состоянии апоптоза, выявляемых с помощью ферментативного присоединения меченых нуклеотидов к фрагментированным хромосомам. Между тем принято считать, что одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК (Willias J.R. et al., 1974; Wu M.X. et al., 1995). Полагают, что именно этот начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после осуществления которого процесс становится необратимым (Cohen G.M. et al., 1993). Отсутствие в нашем эксперименте TUNEL-метки, выявляющей фрагментированную ДНК в ядрах клеток корковой области тимуса, позволяет сделать предположение о том, что процессы клеточной деструкции в этом регионе имеют специфические особенности, отличные от картины «классического» апоптоза.
В пользу этого предположения могут свидетельствовать данные о том, что в некоторых случаях in vivo не удается выявить расщепление ДНК на межнуклеосомные фрагменты, хотя наблюдаются другие признаки апоптоза (Мельнов СБ. и соавт, 1998; Заботина Т.Н. и соавт, 2003; Вогпег С, Моппеу L., 1999; Chautan М. et al., 1999; Kitanaka С, Kuchino Y., 1999).
Нельзя исключать и других объяснений видимого отсутствия тимоцитов с поврежденными хромосомами в корковой области тимуса. Известно, что выраженные биохимические процессы, связанные с апоптозом, могут регистрироваться в клетках даже раньше, чем деградация хроматина в ядре. В частности, они выражаются в изменении характера упаковки фосфолипидов, а также в устранении асимметрии фосфолипидов цитоплазматической мембраны. Так, фосфатидилсерин, сосредоточенный во внутренней части мембраны, оказывается экспрессированным на наружной поверхности (Fadok V.A. et.al., 1992). Фосфатидилсерин является одним из мембранных маркеров апоптозных клеток, который распознается макрофагами, что обусловливает исключительно высокую эффективность фагоцитоза «меченных» таким образом клеток. Исходя из этого, можно сделать предположение о том, что специфической особенностью биохимии корковых тимоцитов, не прошедших положительного отбора, может быть манифестация «обреченными» клетками ранних биохимических маркеров апоптоза. Вероятно, их экспрессия приводит к тому, что эти клетки подвергаются фагоцитозу уже на начальной стадии программируемой смерти, когда процессы деградации ядерного хроматина могут быть еще не выражены достаточно ярко.
Сопоставление полученных нами результатов относительно локализации в субкапсулярной области и на кортико-медуллярной границе тимуса крыс контрольной группы тимоцитов в состоянии апоптоза с данными литературы о том, что в этих же областях протекают процессы негативной селекции, позволяет предположить, что наблюдаемое распределение апоптозных клеток есть специфическое отражение процесса негативной селекции аутореактивных Т-клеток.
Возможная связь отрицательной селекции с апоптозом была ранее продемонстрирована в опытах с индукцией апоптоза С04+СБ8+-тимоцитов моноклональными антителами к CD3 in vitro (Smith С.A. et al., 1989) и in vivo (Jenkinson E.J. et al., 1989). Важно отметить, что процесс негативной селекции наблюдается на поздней стадии дифференцировки тимоцитов, а именно, на стадии дубльпозитивных (CD4+CD8+) Т-клеток (Fowlkes B.J. et al., 1988; Kisielow P. et al., 1988; Murphy K.M. et al., 1990; Vasquez N.J. et al., 1992; Hogquist K.A. et al., 1994; Sebzda E. et al., 1994).
В основе молекулярных механизмов, ведущих к негативной селекции дубльпозитивных тимоцитов, лежит активация цистеиновых протеаз, называемых каспазами. Доказано, что активация каспаз является признаком смерти от апоптоза (Nalin СМ., 1995; Henkart Р.А., 1996). Обнаружено, что связь Т-клеточных рецепторов с комплексом пептид/МНС за время меньшее, чем 2 часа активирует прокаспазы в дубльпозитивных тимоцитах, а уже через 4 часа вызывает значительное повышение числа тимоцитов в состоянии программируемой смерти. (Clayton L.K. et al., 1997).
Увеличение авидности связи тимоцит - антигенпрезентирующая клетка как ключевой фактор негативной селекции тимоцитов
Полученные в нашей работе результаты свидетельствуют о том, что интраперитонеальное введение бактериального эндотоксина уже через 4 часа приводит к значительному увеличению числа апоптозных тимоцитов в областях тимуса, традиционно ассоциируемых с процессами негативной селекции потенциально аутореактивных Т-клеток. Выраженное усиление апоптоза в тимусе после периферического введения липополисахарида свидетельствует о лабильности процесса негативной селекции, т.е. зависимости ее проявления от наличия в организме чужеродных антигенов. Вероятно, наблюдаемое повышение гибели тимоцитов в случае появления в организме чужеродных антигенов осуществляется за счет вовлечения в процессы негативного отбора тех клеток, которые в нормальных условиях минуют негативный контроль и дифференцируются в зрелые Т-лимфоциты.
Такой вывод вступает в противоречие с еще недавно доминировавшим в иммунологии взглядом на толерантность, который предполагает, что в тимусе устраняются все созревающие аутореактивные клоны лимфоцитов (Burnet F.M., 1957; Lederberg J., 1959). Толерантность, согласно этим представлениям, определяется как состояние организма с отсутствием аутореактивности, а аутоиммунные реакции рассматриваются как результат активации одиночных Т-клеточных клонов, избежавших негативной селекции в тимусе вследствие нарушения механизмов внутритимусного контроля.
Однако к настоящему времени накоплен значительный объем экспериментальных и клинических данных, свидетельствующий о том, что умеренная аутореактивность не только частое событие у здоровых организмов, но, более того, она является необходимым условием функционирования иммунной системы. Эти наблюдения нашли объяснение в сетевой (идиотип-антиидиотипической) теории регуляции иммунитета (Jerne N.K., 1974). В соответствии с одним из постулатов этой теории, иммунная система здорового организма нуждается в функциональных Т-клетках и антителах к любым антигенным компонентам собственного организма.
Предполагается, что взаимодействующие идиотип антиидиотипические Т-клетки и антитела образуют «буферные» системы, супрессирующие активность тех Т-лимфоцитов, которые способны дифференцироваться в агрессивные эффекторные клетки. Иными словами, умеренная аутореактивность необходима для индукции и формирования состояния естественной толерантности к органам и тканям (Полетаев А.Б. и соавт., 2002).
За последние десятилетия получены прямые экспериментальные подтверждения присутствия в кровотоке здоровых лиц сотен видов естественных аутоантител разной специфичности, направленных против гормонов и рецепторов, компонентов межклеточного матрикса и белков цитоскелета, ДНК и гистонов, многих ферментов и других эндогенных соединений (Полетаев А.Б., 1995).
Предложено несколько объяснений наблюдаемому феномену. Согласно гипотезе «иммунологического гомункулуса», молекулярная специфичность каждого зрелого организма отражается, как в зеркале, в наборах специфичных аутореактивных рецепторов Т-лимфоцитов (Cohen I.R., Young D.B., 1991). Однако аутореактивные Т-лимфоциты не просто пассивно «отражают» молекулярные особенности индивидуума, но и активно участвуют в общеорганизменных адаптивных процессах (Полетаев А.Б. и соавт., 2002).
Таким образом, современный взгляд на механизмы естественной толерантности предполагает сочетание центральных механизмов тимическои делеции как способа регуляции числа аутореактивных клеток и механизмов периферической супрессии или регуляции активности аутореактивных клеток, избежавших элиминации в тимусе.
Считается общепринятым, что образуемые в тимусе зрелые Т- клетки гетерогенны не только по функции и фенотипическим характеристикам, но и по специфичности рецепторов к распознаваемым антигенам. Если первый тип гетерогенности проявляется в существовании нескольких популяций Т-лимфоцитов, то различие по признаку антигенраспознающей специфичности выражается в клональной структуре популяции Т- клеток. Первый тип гетерогенности ответственен за разнообразие функций Т- лимфоцитов при иммунном ответе, второй - за избирательное включение в ответ клонов, имеющих рецепторы, специфичные для иммуногена.
Однако даже клоны Т-лимфоцитов с одинаковыми функциями и рецепторной специфичностью, могут, в свою очередь, отличаться прочностью связи (аффинностью) Т-клеточных рецепторов с презентированным антигеном. Следует помнить, что биологическое значение имеет не аффинность отдельного рецептора, а авидность, которая характеризует суммарную силу взаимодействий всех Т-клеточных рецепторов с соответствующими комплексами аутоанти ген/МНС на антигенпрезентирующей клетке. Авидность этих взаимодействий зависит как от уровня экспрессии комплекса МНС-пептид на антигенпрезентирующих клетках, так и от аффиности и концентрации на поверхности Т-клеток рецепторов и корецепторных молекул (CD4+ и CD8+). Чем выше авидность связи тимоцит - антигенпрезентирующая клетка, тем более интенсивный внутриклеточный сигнал получает созревающий Т-лимфоцит и тем выше вероятность его гибели (Grassi F. et al., 1994; Alam S.M. et al., 1996). Тимоциты, экспрессирующие Т-клеточные рецепторы с высокой авидностью к комплексу аутоантиген/МНС, подвергаются апоптозу. Тимоциты, несущие рецепторы с низкой или умеренной авидностью к такому комплексу, избегают гибели и дифференцируются в зрелые клетки (Kruisbeek A.M., 1999; SebzdaE. etal., 1999).
Результаты нашей работы продемонстрировали рост числа апоптозных тимоцитов после введения ЛПС в субкапсулярной и кортико-медуллярной областях, где также обнаруживается многократное усиление экспрессии стромальными клетками молекул МНС класса І. В свете вышеприведенных данных можно сделать вывод о том, что введение ЛПС повышает авидность связывания клеток, экспрессирующих МНС, с тимоцитами, что приводит к усилению процессов негативной селекции (Рис. 4.1).
Кортико-медуллярная зона содержит клетки стромы костномозгового происхождения (в первую очередь дендритные клетки). На сегодняшний день получены убедительные доказательства того, что дендритные клетки ответственны за Т-клеточную негативную селекцию (Ardavin С, 1997; Broecker Т. et al., 1997). Дендритные клетки представляют уникальную клеточную популяцию тимуса, которая экспрессирует молекулы МНС класса I и II в высоких концентрациях (Crowley М. et al., 1989; Vremec D. et al., 1992; Bancherau J., Steinman R.M., 1998). Эти клетки обладают способностью захватывать, процессировать и презентировать ауто- и аллогенные антигены в контексте молекул МНС (Mazda О. et al., 1991; Ardavin С, 1997; Ingulli, Е. et al., 1997). Кроме того, дендритные клетки продуцируют дополнительные сигналы, решающие в конечном итоге, подвергнется ли клетка клональной делеции или продолжит созревание (Amsen D., Kruisbeek A.M., 1998).
