Введение к работе
Актуальность работы. Для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга активно изучают возможность доставки в область повреждения нейротрофических факторов, молекул адгезии, противоапоптозных молекул, нейтрализаторов естественных ингибиторов роста аксонов и др. В качестве средств доставки потенциальных стимуляторов регенерации исследуют клеточные носители, а также гелевый матрикс в потенциальном пространстве роста аксонов. Клеточная терапия рассматривается как один из перспективных подходов для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга. Исследования последнего десятилетия выявили новый источник клеток для трансплантации при повреждении спинного мозга — клетки обонятельных структур (выстилки и луковицы) (Reier et al., 2004; Marshall et al., 2006). При трансплантации этих клеток отмечены нейропротекторный эффект (Lopez-Vales et al., 2004; Ramer et al., 2004), стимулирование регенерации аксонов (Ramon-Cueto et al., 2000; Lopez-Vales et al., 2006), ремиелинизация (Imaizumi et al., 2000; Sasaki et al., 2000) и частичное восстановление двигательной и чувствительной функций (Verdu et al., 2003; Lopez-Vales et al., 2006). Поддерживающее нейрорегенерацию влияние клеток обонятельной выстилки (КОВ) связывают с их способностью проникать через астроглиальный рубец и интегрироваться в ткань спинного мозга, продуцировать нейротрофические факторы, молекулы адгезии и белки внеклеточного матрикса (Perry et al., 2002; Barnett, Riddell, 2004; Викторов и др., 2006). Интерес к КОВ подкреплён лёгкой доступностью, малой инвазивностью процедуры забора материала и возможностью получения аутологичных клеток, не приводящей к длительному нарушению обоняния (Lanza et al., 1994; Ferron, Jusko, 1998). Несмотря на большое количество экспериментальных работ с использованием КОВ, как материала для трансплантации при травме спинного мозга, на сегодняшний день клеточные механизмы миелинизации регенерирующих аксонов остаются неясными.
Важным критерием отбора стволовых и прогениторных клеток для трансплантации является их низкая онкогенность. Изучению этого вопроса при клеточной терапии экспериментальной травмы спинного мозга уделено внимание только в единичных работах (Kulbatski et al., 2007; Ronsyn et al., 2007). Другим, не менее важным, критерием отбора клеток для трансплантации является минимальная инвазивность процедуры введения клеток. Большинство исследований эффектов трансплантации клеток проведено с их введением непосредственно в область повреждения спинного мозга. При этом дополнительно травмируется ткань, что негативно влияет на процессы регенерации. Инъекции трансплантируемых клеток в сосудистое русло по этой причине более предпочтительны. Однако клетки, вводимые в кровоток, должны направленно мигрировать в область повреждения. Представляется очевидным, что наиболее предпочтительными кандидатами для эффективного применения вводимых через кровь клеток будут клетки мезенхимного происхождения (Dezawa, Ide, 2005; Lundberg, Blanc, 2009). Обоим вышеназванным критериям в наибольшей мере удовлетворяют происходящие из мезенхимы клетки микроглии, которые с точки зрения возможной трансформации кажутся более безопасными (Hartmann, Deimling, 2009). Для клеток микроглии показана активация при инфекции, ишемии и нейродегенеративных заболеваниях, способность мигрировать в область повреждения и экспрессировать цитокины, нейротрофины и иммуномодуляторы (Ekdahl et al., 2009). Несмотря на эти позитивные свойства, в литературе практически отсутствуют сведения о применении микроглии для трансплантации с целью стимулирования регенерации при травме спинного мозга.
Исследования Tsuchiya et al. (2005) открыли возможность получения микроглия-подобных клеток (МПК) путём направленной дифференцировки из эмбриональной стволовой клетки мыши. Представляется актуальным изучение эффективности трансплантации МПК, трансфицированных геном нейротрофина 3 (NT3). Этот нейротрофин регулирует нейрогенез, регенерацию аксонов (Xu et al., 1995) и процесс миелинизации олигодендроцитами in vitro и in vivo (Yan, Wood, 2000; Jean et al., 2003). Выступая в роли хемоаттрактанта, NT3 обеспечивает в спинном мозге восстановление «правильных» синаптических контактов регенерирующих аксонов со своими мишенями (Alto et al., 2009) и наряду с другими нейротрофическими факторами поддерживает выживание клеток (Woodhoo, Sommer, 2008).
Для эффективной посттравматической нейрорегенерации актуальна реконструкция тканевого матрикса в потенциальном пространстве роста аксонов (Schmidt, Leach 2003). Этот подход активно разрабатывается для ЦНС (Novikova et al., 2003; Nomura et al., 2006). Однако в клинике локальное применение фармакологических нейропротекторов и стимуляторов роста нервных волокон, подводимых к месту повреждения при помощи биосовместимых и биодеградируемых материалов, остаётся практически нереализованным. Для подобных задач в эксперименте наиболее исследованы природные биоматериалы, такие как коллаген (Yoshii, Oka, 2001), фибрин (Nakayama et al., 2007) и фибронектин (Phillips et al., 2004). В этом отношении из синтетических материалов интерес представляют полиакрилаты (Zhong, Bellamkonda, 2008), которые образуют высоковязкие кристаллические гидрогели (Осипова, 1999) и хорошо сочетаются с биологически активными веществами (Lomas et al., 2004). В свою очередь, биосовместимый карбомер Carbopol 971P NF, являясь полимером акриловой кислоты, образует гелевую матрицу, пролонгирующую действие фармакологически активных веществ (Hosmani, 2006). Ожидается, что введение композиции аминокислот и микроэлементов, в гидрогелевый матрикс на основе полиакриловой кислоты или карбопола, окажет позитивное влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга.
Цель и задачи исследования. Цель работы — оценить эффективность посттравматической регенерации спинного мозга грызунов при ксенотрансплантации клеток обонятельной выстилки (КОВ) человека, аллотрансплантации микроглия-подобных клеток, трансфицированных геном NT3 (МПК-EGFP-NT3), и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. На модели латеральной гемисекции спинного мозга крысы на уровне Т8 изучить влияние трансплантации клеток обонятельной выстилки (КОВ) человека на восстановление двигательной функции задних конечностей и процессы деструкции и регенерации в прилегающих к месту травмы участках спинного мозга.
2. На модели латеральной гемисекции спинного мозга мыши на уровне Т8 исследовать способность микроглия-подобных клеток (МПК), трансфицированных генами зелёного флюоресцентного белка (EGFP) и NT3 (МПК-EGFP и МПК-EGFP-NT3), к миграции из периферической крови в область травматического повреждения и их выживание в этой области.
3. Оценить структурные и гистохимические изменения в ростральном и каудальном фрагментах спинного мозга мыши, прилегающих к области гемисекции на уровне Т8, при введении в хвостовую вену МПК-EGFP и МПК-EGFP-NT3.
4. На модели полной перерезки спинного мозга мыши на уровне Т9 оценить восстановление двигательной функции задних конечностей в условиях имплантации в разрыв нервной ткани гидрогеля на основе биосовместимых карбомеров – полиакриловой кислоты и карбопола (Carbopol 971P NF).
Научная новизна работы. Впервые при длительном мониторинге описан характер гистологических изменений после гемисекции спинного мозга крысы при трансплантации КОВ. Получены данные о поддерживающем влиянии КОВ человека на выживание олигодендроцитов в прилегающих к месту травмы отделах спинного мозга крысы. Впервые показано, что количество миелиновых волокон и переживающих нейронов после гемисекции спинного мозга может не коррелировать с показателями функционального теста (ВВВ). Впервые произведена генетическая модификация микроглия-подобных клеток (МПК) генами EGFP и NT3. Проведена оценка их способности к миграции и экспрессии гена нейротрофического фактора NT3 in vitro и in vivo. Показано, что введённые через хвостовую вену МПК оказывают стимулирующее влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в уменьшении области повреждения, сохранности белого вещества и выживании астроцитов в эпицентре травмы, а также в прилежащих ростральном и каудальном фрагментах спинного мозга. Впервые установлено, что композиция аминокислот и микроэлементов (M4), введённая в гидрогелевый матрикс на основе карбопола, стимулирует восстановление двигательной функции после полной перерезки спинного мозга мыши.
Научно-практическая значимость работы. В работе получены данные, обосновывающие целесообразность поиска новых клеточных типов, предназначенных для трансплантации с целью стимулирования регенерации в нервной системе. Установленное нами поддерживающее влияние трансплантации КОВ человека на олигодендроциты и потенциально на ремиелинизацию в области травматического повреждения спинного мозга подтверждает целесообразность применения КОВ в клинике. Данные о посттравматическом восстановлении спинного мозга позволяют рекомендовать микроглия-подобные клетки как перспективный клеточный тип для трансплантаций при травме спинного мозга человека. Полученные результаты о действии биосовместимых материалов на посттравматическое восстановление значимы для понимания механизмов пластичности спинного мозга.
Положения, выносимые на защиту:
1. Трансплантация клеток обонятельной выстилки человека в область гемисекции спинного мозга крысы стимулирует его регенерацию путём поддержания популяции олигодендроцитов в области повреждения.
2. Микроглия-подобные клетки, трансфицированные геном нейротрофина 3 (NT3), имеют выраженный миграционный потенциал и стимулируют посттравматическую регенерацию спинного мозга мыши.
3. Композиция из аминокислот и микроэлементов в составе формируемого в разрыве спинного мозга гидрогелевого матрикса на основе карбопола стимулирует посттравматическое восстановление двигательной функции.
Апробация работы. Материалы работы доложены на XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов–2008» (Москва, 2008); ХIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2008); Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008); Всероссийской конференции, посвящённой 85-летию профессора Д.С. Гордон (Чебоксары, 2008); Всероссийской научно–практической конференции молодых учёных "Инновации и актуальные проблемы техники и технологий" (Саратов, 2009); VI Всероссийском съезде АГЭ (Саратов, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК, и 6 статей и тезисов докладов региональных и международных конференций.
Структура и объём работы. Диссертационная работа в объёме 119 страниц машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 32 рисунками и 10 таблицами. Библиография включает 222 источника литературы, из них 216 иностранных и 6 отечественных.
Похожие диссертации на Посттравматическая регенерация спинного мозга грызунов при трансплантации клеток обонятельной выстилки, микроглия-подобных клеток и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами
