Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Белки внеклеточного матрикса млекопитающих 10
2.2. Внеклеточный матрикс беспозвоночных 13
2.3. Внеклеточный матрикс кожи человека 15
2.3.1. Структура и состав кожи человека 15
2.4. Матриксные металлопротеиназы 18
2.5. Матриксные металлопротеиназы кожи человека 27
2.6. Раневой экссудат как естественное окружение клеток в ране 30
2.7. Действие матриксных металлопротеиназ на другие субстраты .33
2.8. Целомоциты беспозвоночных и их функции 34
3. Материалы и методы 39
3.1. Клетки и клеточные культуры 39
3.1.1. Фибробласты линии balb/3t3 clone a31 39
3.1.2. Клетки линии nctc clone 929 39
3.1.3. Кератиноциты человека 39
3.1.4. Эмбриональные фибробласты легкого человека 40
3.1.5. Целомоциты морской звезды asteriasrubens 40
3.2. Антитела 40
3.3. Белки внеклеточного матрикса 40
3.3.1. Ламинин-1 41
3.3.2. Ламинин-2/4 41
3.3.3. Фибронектин 41
3.4. Отбор проб раневого экссудата 42
3.5. Электрофорез 43
3.6. Зимография 43
3.7. Ингибирование ферментативного расщепления желатина при определении типа протеаз 43
3.8. Определение функциональной активности клеток в присутствии экссудата или фракций целомическои жидкости 44
3.8.1. Пролиферация 44
3.8.2. Контракция монослоя клеток 44
3.8.3. Миграционная способность клеток 44
3.9. Колориметрическое определение количества клеток с помощью мтт 45
3.10. Расщепление белков внеклеточного матрикса протеазами экссудатов 45
3.11. Получение целомической жидкости и целомоцитов морских беспозвоночных 45
3.12. Моделирование раны на морских беспозвоночных и изучение изменения состава целомической жидкости и целомоцитов после нанесения раны 46
3.13. Фракционирование белков целомической жидкости морской звезды 46
3.14. Биологическое действие белковых фракций целомической жидкости 47
3.15.иммуноблоттинг 47
3.16. Количественное определение фибронектина методом иммуноблоттинга 48
3.17. Определение матриксных металлопротеиназ в целомоцитах способом иммунофлуоресценции 48
3.18. Определение фибронектина в целомоцитах способом иммунофлуоресценции 49
3.19. Выделение фибронектино-подобного белка методом аффинной хроматографии 49
3.20. Программное обеспечение 49
4. Результаты 50
4.1. Методика отбора раневого и ожогового экссудатов 50
4.2. Выявление протеолитическои активности и определение типа протеаз в раневых экссудатах 50
4.3. Изучение протеолитическои активности раневого экссудата из острых хирургических ран 53
4.4. Изучение протеолитическои активности ожогового экссудата 54
4.5. Действие экссудата на белки внеклеточного матрикса 55
4.6. Динамика содержания белка в ожоговом экссудате 57
4.7. Содержание фибронектина в раневом экссудате 59
4.8. Влияние экссудата на функциональную активность клеток 60
4.8.1. Пролиферация 61
4.8.2. Контракция монослоя клеток линии зтз/вalb 64
4.8.3. Кератиноциты человека 67
4.8.4. Миграционная способность клеток 68
4.8.5. Изменение миграционной активности клеток под действием экссудатов, взятых на разных сроках после повреждения ткани (1-е, 3-й и 5-е сутки) 73
4.9. Изменение состава целомическои жидкости и целомоцитов морских звезд при повреждении тканей 76
4.10. Изменение протеолитической активности целомическои жидкости при повреждении ткани 77
4.11. Фракционирование белков целомическои жидкости морской звезды 78
4.12. Биологическая активность фракций целомическои жидкости морской звезды 81
4.13. Получение фибронектино-подобного белка из целомическои жидкости способом аффинной хроматографии и изучение адгезивных свойств этого белка 83
4.14. Фракции целомическои жидкости, обладающие желатинолитической активностью 84
4.15. Действие белковых фракций целомическои жидкости морской звезды на клетки линии l-929 85
4.16. Изменение миграционной активности клеток линии l-929
под действием получені 1ых фракций целомическои жидкости 89
4.17. Определение матриксных металлопротеиназ в целомоцитах интактных и травмированных морских звезд 91
4.18. Определение фибронектина в целомоцитах интактных и травмированных морских звезд 93
Обсуждение 95
Выводы 114
Список литературы 115
- Внеклеточный матрикс беспозвоночных
- Белки внеклеточного матрикса
- Колориметрическое определение количества клеток с помощью мтт
- Количественное определение фибронектина методом иммуноблоттинга
Введение к работе
Способность восстанавливать целостность тканей после ранения или утраты ткани является фундаментальным свойством живых организмов. Эта способность в той или иной степени может быть найдена практически у представителей всех животных, от простейших до высших млекопитающих. Восстановление эпителия также характерно для всех животных. Регенерация может быть определена как восстановление различных тканей и органов, от клеток до крупных частей тела, после естественного изнашивания или случайной утраты.
Традиционно регенерация разделяется на физиологическую и репаративную. Физиологическая регенерация - замещение клеток или тканей организма после их утраты при нормальном функционировании организма. Классические примеры — нормальная замена утраченных эпителиальных клеток кожи или эпителия кишечника, или поддержание нормальных уровней клеток крови в процессе кровотворення. Репаративная регенерация - восстановление клеток, тканей или органов, которые утрачиваются при травме или различных патологических процессах. Многие ткани или части органов большинства видов могут принимать участие в репаративной регенерации, но степень восстановления исходной структуры или функции в разных случаях различна. Примером репаративной регенерации может служить заживление ран. Одним из органов человека, которые способны к постоянной регенерации, как физиологический, так и репаративной, является кожа. Поэтому изучать процессы репаративной регенерации можно на примере кожных ран.
Процесс регенерации ткани при заживлении раны сложен, состоит из многих последовательных этапов, в которых принимают участие различные типы клеток, а также растворимые и нерастворимые компоненты, составляющие микроокружение клеток в ткани. Хотя эти этапы не могут быть строго разделены, в настоящее время принято выделять следующие необходимые стадии заживления: остановку кровотечения с образованием сгустка, воспаление, пролиферацию и миграцию клеток эпидермиса, образование грануляционной ткани и эпителизацию. Считают, что все эти стадии заживления раны регулируются тремя основными группами белков: факторами роста, цитокинами и матриксными металлопротеиназами (Kirsner, Eaglstein, 1993; Rothe, Falanga, 1992).
Эти факторы находятся в микроокружении клеток, участвующих в процессе регенерации. Такое микроокружение составляют нерастворимые компоненты -белки внеклеточного матрикса (ВКМ) - и растворимые - различные цитокины и ферменты, синтезируемые самими клетками. Состав его изменяется в процессе заживления раны. Все эти компоненты находятся в жидкости, окружающей клетки в ране - раневом экссудате, который присутствует в ране до 'ее окончательного заживления. Экссудат является удобным источником материала для изучения клеточного микроокружения в ходе заживления раны, его можно отбирать, не повреждая ткани, и следить за его изменением, отражающим изменение состояния ткани.
Принципы организации ткани общи для всех животных. И у позвоночных, и у беспозвоночных в тканях присутствуют волокнообразующие полимеры, такие как коллагены, и различные не образующие волокна компоненты, У животных основными волокнообразующими элементами являются коллагены, связанные с протеогликанами. Следовательно, должны существовать ферменты, аналогичные коллагеназам позвоночных, расщепляющие эти белки. Беспозвоночные составляют почти 95% видов животных, хотя большинство исследований, посвященных изучению регенерации тканей, ремоделированию внеклеточного матрикса и участвующих в этих процессах специфических протеаз, проводится на позвоночных. Преимуществом использования беспозвоночных при таких исследованиях является способгюсть многих видов этих животных восстанавливать практически все органы и ткани. Так как скорость регенерации у них высока, то, по-видимому, и изменения микроокружения клеток происходят также с большей скоростью, чем у позвоночных. Такие изменения могут происходить за счет изменения внеклеточного матрикса, окружающего их, а также за счет синтеза самими клетками веществ, посредством которых они сообщаются между собой или воздействуют на внеклеточный матрикс. Все эти вещества будут находиться в среде, окружающей клетки в ткани - межклеточной жидкости, в ране - экссудате, а в случае беспозвоночных - в целомической жидкости.
В процессе регенерации, восстановления ткани в равной мере участвуют две стороны - клетки, используемые для пересадки и трансплантируемые в рану, и
различные растворимые и нерастворимые факторы, составляющие то микроокружение клеток, которое уже существует в ране. Состав этого микроокружения важен для хода регенерации, так как он содержит биоактивные молекулы, действие которых влияет на ткани раны и на трансплантируемый материал. Если процессы дифференцировки клеток активно изучаются, то гораздо меньше известно о том, что происходит в ране во время заживления.
Нерастворимыми факторами являются белки внеклеточного матрикса, окружающего клетки, а растворимыми - ростовые факторы, ферменты и другие биологически активные молекулы. В результате исследований ряда авторов и наших собственных работ установлено, что белки ВКМ играют ключевую роль в процессах заживления ран и восстановления ткани. Следовательно, представляет насущный интерес установить, что может изменять ВКМ, какие ферменты синтезируются клетками в условиях заживления раны или регенерации ткани. Имеющихся данных пока недостаточно.
При регенерации тканей наиболее активными участниками этого процесса становятся ферменты, модулирующие структуру внеклеточного матрикса -матриксные металлопротеиназы (ММП). Хотя в ранее опубликованных работах исследовалось участие различных элементов внеклеточного матрикса на разных этапах раневого заживления, но до сих пор не предпринималось попыток определить, на какие именно аспекты функциональной активности клеток влияет присутствие ММП. Поэтому представляет интерес изучить действие ММП на клетки, которые при естественной регенерации ткани находятся в среде, содержащей эти ферменты.
При изучении процессов репаративной регенерации работа ведется в двух направлениях: первое - изучение регенерации кожи человека для целей восстановительной терапии при ранах различного происхождения. Кожа человека является органом, способным к постоянной регенерации, поэтому изучать процессы репаративной регенерации можно на примере кожных ран. Кожная рана удобна для исследования, ее легче наблюдать, при повреждении кожи затронуто только определенное число тканей, экссудат, находящийся в кожной ране, представляет пример микроокружения клеток, которое может быть исследовано в течение всего процесса заживления раны без травмирования раны (в отличие от того же материала
при полостных ранах, где участвует множество видов тканей и существуют трудности с получением материала).
Вторым направлением является изучение процесса регенерации у морских беспозвоночных. Эти животные отличаются высокой эффективностью регенерации тканей и возможностью восстановления практически любых тканей. Эта способность отличает их от высших организмов, у которых способность к регенерации многих органов утеряна в процессе эволюции. Поскольку они очень эффективно восстанавливают различные ткани и органы по сравнению с высшими позвоночными, интересно было сравнить биоактивные вещества, присутствующие в микроокружении клеток в обоих случаях. Возможно, эти вещества могут быть выделены для изучения, а впоследствии использованы для стимулирования процессов регенерации у позвоночных. Поэтому работа была посвящена сравнительному изучению факторов, управляющих ключевыми процессами восстановления тканей. Задачей данной работы было установить сходство этих процессов для млекопитающих и морских беспозвоночных. В ранах присутствуют экссудаты, то есть объекты, в которых могут накапливаться биоактивные вещества. В наших случаях это могут быть экссудаты человека и целомическая жидкость морских беспозвоночных. Эти животные отличаются высокой скоростью регенерации тканей, а соответственно выше и динамика изменений белкового состава и реакций клеток.
Если присутствие белков ВКМ в тканях беспозвоночных уже подтверждено, у различных представителей морских беспозвоночных найдены белки, подобные белкам ВКМ позвоночных, то процессы ремоделирования матрикса при заживлении ран практически не изучены. Несмотря на то, что процесс регенерации тканей у беспозвоночных изучается уже давно, наличие ММП, а тем более их участие в этом процессе у беспозвоночных до сих пор практически не изучалось. В связи с этим в представленной работе была предпринята попытка сравнительного изучения состава и функциональной активности этих ферментов у беспозвоночных и млекопитающих, в частности, человека.
Причины образования раны могут быть различными, например это может быть травма или хирургическая операция, рана также может образоваться в результате
нарушения функций организма. Если повреждение кожи неглубокое, то рана заживает самостоятельно. Если рана слишком обширна и клетки не способны закрывать ее при миграции,, то для ускорения регенерации ткани может быть необходимо внесение клеточных трансплантатов для обеспечения достаточного количества клеток. При очень глубоких повреждениях, захватывающих дерму, необходимо образование ткани дермы, что может быть затруднительно из-за отсутствия в ране клеток, синтезирующих белки ВКМ. В этих случаях также необходимо внесение в рану дополнительных белков ВКМ, входящих в состав дермы и/или клеток, синтезирующих эти белки. В более ранних работах рассматривалось внесение в раневое окружение белков ВКМ и влияние, оказываемое этими белками на процесс регенерации ткани (Блинова и др., 1995; 1996; Горелик, 1996). Изучалось также внесение в рану клеток для обеспечения более эффективной регенерации ткани (Блинова и др., 1997). При этом практически не изучалось изменение состояния белков ВКМ и клеток в этом окружении.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. БЕЛКИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА МЛЕКОПИТАЮЩИХ
ВКМ состоит из нескольких различных типов белков, осуществляющих многие функции. Некоторые белки, такие как эластин и многие типы коллагена, находятся в виде больших нерастворимых, устойчивых к протеазам молекул и придают жесткость и стабильность тканям. Некоторые гликопротеины матрикса, такие как ламинины, фибронектин, тромбоспондины, фибриллины, энтактин и другие, образуют агрегаты с различной степенью сложности, обеспечивая субстрат для адгезии клеток и они важны для многочисленных белок-белковых взаимодействий. Протеогликаны участвуют в гидратации ткани. К тому же молекулы ВКМ могут быть организованы в специализированные структуры, такие как базальные мембраны, то есть матрикс, на котором располагаются эпителиальные и эндотелиальные клетки. Почти все белки матрикса играют определенную роль в изменении функций и поведения клеток.
Коллагены составляют семейство гликопротеинов с тройной спиралью. Существует три основных класса коллагенов, составляющих ВКМ: фибриллярные коллагены (типы I, II, III, V, XI), обладающие непрерьшной спиралью; коллагены базальной мембраны (типа IV); фибриллярные коллагены с дискретной спиралью (типы VI, VII); и не-фибриллярные коллагены (типы VIII - XVIII). Основной характеристикой фибриллярных коллагенов является способность мономерных молекул полимеризоваться и образовывать длинные волокна (Вirk et al, 1990). Эти фибриллярные коллагены составляют основу соединительной ткани, нормальная кожа содержит 80-90% коллагена типа I и 10-20% коллагена типа III (Hopkinson, 1992).
При репарации ткани на месте повреждения во время образования матрикса грануляционной ткани происходит повышение уровня синтеза коллагенов типа III, V, VI относительно коллагена I типа. Новообразованный коллаген детектируется в заживающих ранах уже на первые сутки после повреждения ткани (Alvarez, 1983), синтез коллагена типа III начинает повышаться уже через 10 часов после повреждения и продолжается в течение приблизительно 72 часов (Clone et al, 1979; Gay et al, 1978), а синтез коллагена типа I затем увеличивается через 72 часа и остается повышенным в течение длительного времени, до тех пор, пока уровень
коллагена типа ПІ не снизится до фоновых значений (Williams, 1988). В грануляционной ткани и позднее в рубцовой ткани, имеющей многочисленные капилляры, отмечено присутствие коллагена типа V (Ehrlich, White, 1981). Коллаген типа VI также найден в тканях кожных ран и его максимум наблюдается приблизительно через неделю после повреждения ткани. Агрегация макромолекул коллагена в фибриллярные пучки повышает прочность ткани и натяжение раны (Trelstad, Sliver, 1981). Эти изменения вызываются ремоделированием и «выстраиванием» волокон коллагена в большие пучки волокон (Romer et al, 1996), а также образованием межмолекулярных сшивок (Bailey et al, 1975). Во время ремоделирования волокна становятся более упорядоченными, ткань приобретает структуру неповрежденной ткани (Willams et al, 1995).
Кроме поддержания структуры ткани, коллаген также имеет и другие функции, в частности, считают, что он работает как хемоаттрактант для фибробластов (Postlethwaite et al, 1978), смена типов коллагена может индуцировать ремоделирование матрикса посредством снижения пролиферации клеток и синтеза коллагена (Grinnell, 1994), а также индуцировать синтез проколлагеназы фибробластами (Unemore, Werb, 1986) и экспрессии агЬі интегрина (Klein et al, 1991). Таким образом, матрикс может влиять на функции клеток, которые, в свою очередь, способны изменять матрикс. Ремоделирование коллагена зависит от результата одновременных процессов синтеза и расщепления коллагена. Это расщепление контролируется рядом ферментов, синтезируемых гранулоцитами, макрофагами, эпидермальными клетками и фибробластами (Stncklin et al, 1993). Ряд факторов роста, включающих IL-1, PDGF, IGF-1, стимулируют продуцирование коллагеназы фибробластами (Cotran et al, 1994). Например, TGF-b может стимулировать синтез коллагена, а также ингибировать протеолитическое расщепление новообразованных белков матрикса, включая коллаген (Sporn et al, 1987). Прекращение коллагенолитической активности в коже зависит от действия естественных ингибиторов, присутствующих в соединительных тканях, таких как тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП) (Brenner et al, 1989).
Ламиннны — высокомолекулярные многодоменные гликопротеины внеклеточного матрикса, образующие базальную мембрану вместе с протеогликанами и коллагеном типа IV. Они появляются в числе первых
компонентов ВКМ в эмбриогенезе и регулируют как нормальные, так и патологические процессы (Martin, Timpl, 1987; Malinda, Kleinman, 1996). В настоящее время известно 12 изоформ ламинина, различающихся составом цепей гетеротримерных молекул. В коже к настоящему моменту обнаружены по меньше мере четыре изоформы ламинина: ламинин 2/4 (Sollberg et al, 1992; Sewry et al, 1996), ламинин 5 (Rousselle et al, 1990), ламинин 6 (Marinkovich et al, 1991) и ламинин 10 (Miner et al, 1997). Наиболее хорошо охарактеризован ламинин-1, выделенный из Engelbreth-Holm-Swarm саркомы мыши (Timpl et al, 1979). В организме человека цепь ламинина альфа-1 экспрессируется в тканях мозга, почек, нервов и яичек (Vuolteenaho et al, 1994). Ламинин 2/4 был выделен из плаценты человека (Paulsson, Saladin, 1989) и позже обнаружен в скелетных, сердечной мышцах, клетках Шванна и в коже (Vuolteenaho et al, 1994). Ламинин 2/4 участвует в регенерации периферических нервов, вызывая рост аксонов и миграцию клеток Шванна (Anton et al, 1994). Поддерживает миграцию многих типов клеток, включая нервные, мышечные (Goodman et al, 1989), остеокласты (Colucci et al, 1996). Ламинин-5 входит в состав полудесмосом и служит для стабилизации клеточного пласта (Rousselle et al, 1991), при повреждении кожи ламинин-5 синтезируется кератиноцитами на краю раны и инициирует их миграцию (Zhang, Kramer, 1996). Несмотря на то, что ламинин 1 отсутствует в дифференцированной базальной мембране, он присутствует во время регенерации или при культивировании кератиноцитов (Smola et al, 1998). Ламинин 1 является слабым субстратом для адгезии кератиноцитов (Adams, Watt, 1991), он может ингибировать миграцию кератиноцитов на фибронектине и коллагене типа IV (Woodley et al, 1988). Ламинин 2/4 найден в базальной мембране кожи, но его влияние на поведение кератиноцитов in vivo и in vitro еще не изучено полностью.
Фибронектин, один из преимущественных белков кожи, продуцируется фибробластами и кератиноцитами, а также другими многочисленными типами клеток кожи и других тканей (Hynes, Yamada, 1982). Он существует в растворимой форме в микромолярных концентрациях в плазме крови и в нерастворимой форме во внеклеточном матриксе (Mosher, 1989; Hynes, 1990). В отличие от коллагенов, ламинина и других белков, фибронектин полимеризуется только на клеточной поверхности (Peters, Mosher, 1987). Чаще всего фибронектин встречается во
внеклеточном матриксе эмбриональных и регенерирующих или поврежденных тканей, хотя он присутствует и в большинстве ВКМ, включая базальную мембрану. В составе ВКМ могут присутствовать и плазменный, и клеточный фибронектин (Allio, McKeown-Longo, 1988). Фибронектин взаимодействует с клетками через интегрины.
Сборка фибронектинового матрикса представляет собой процесс, проходящий в несколько стадий. Сначала растворимый фибронектин связывается с поверхностью клеток через N-конец молекулы белка. Эта стадия обратима и насыщаема (McKeown-Longo, Mosher, 1983). На следующей стадии связанный с клетками фибронектин превращается в мультимеры с помощью взаимодействия между молекулами фибронектина (McKeown-Longo, Mosher, 1984; Chen, Mosher, 1996). На конечной стадии регенерируется сайт связывания на клеточной поверхности. Различные типы клеток, такие как фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, способны секретировать, связывать и собирать фибронектин в фибриллы во внеклеточном матриксе (Colvin, 1989). В его состав могут включаться и клеточный, и плазменный фибронектины (Allio, McKeown, 1988).
При повреждении ткани фибронектин в месте раны расщепляется на фрагменты с помощью ферментов, участвующих в образовании сгустка и заживления раны. Фрагменты фибронектина обладают биологической активностью, отличной от активности интактного белка. Например, 120-кДа фрагмент фибронектина индуцирует секрецию коллагеназы и стромелизина, а также сериновой протеиназы и 20 кДа ингибитора протеиназ в клетках периодонтального лигамента. Интактный же белок индуцирует экспрессию только 92 кДа желатиназы и 20 кДа ингибитора (Kapila et al, 1996). Фрагмент PHSRN фибронектина ускоряет заживление ран у мышей-диабетиков, улучшая инвазию кератиноцитов и фибробластов в рану (Livant et al, 2000).
2.2. ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
Коллаген является наиболее широко изученным белком ВКМ у
беспозвоночных, на его примере изучали некоторые аспекты молекулярной
эволюции (Наг-Е1, Tanzer, 1993). Другие молекулы ВКМ изучены меньше и в
основном на примере позвоночных, но известны и работы по установлению
соответствия между ВКМ млекопитающих и морских беспозвоночных. Например, у морских ежей были найдены две формы коллагена, подобные волокнообразующим коллагенам (Shimuzu et al, 1990; D'Alessio et al, 1989).
Ламинин найден у многих позвоночных и беспозвоночных организмов. Его структура близка у всех видов и изучаются его биологические функции в составе внеклеточного матрикса. Этот белок хорошо изучен на примере дрозофилы (Fessler, Feselr, 1989; Kushe-Guillberg et al, 1992). Клонированы полная Рцепь и частично а-цепь ламинина гидры (Zhang et al, 2002). Ламинин гидры отличается тем, что в нем отсутствует аминокислотная последовательность YIGSR, а вместо нее на этом месте существует последовательность FTGTQ. Эта последовательность, также как и пептид ламинина позвоночных, принимает участие в адгезии клеток и их миграции (Sarras et al, 1994). Ламинин найден также у морских ежей Spherechinous granulans, пиявки Hirudo medecinalis и антомедузы Podocoryne carnea (Beck et al, 1989, Schmid et al, 1991).
Фибронектин дрозофилы Drosophila melanogaster был найден в 1988 году (Gratecos et al, 1988). Позже нашли этот белок у морского ежа (Iwata et al, 1981). Фибронектин найден также у туникатов (Akiyama, Johnson, 1983), морских ежей (De Simone et al, 1985; Fink, McClay, 1985; Katow et al, 1982; Spiegel et al, 1980; Wessel et al, 1984), у моллюсков (Akiyama, Johnson, 1983), губок (Akiyama, Johnson, 1983; Labat-Robert et al, 1981), во всех случаях он участвует в адгезии и дифференцировке клеток. Выделен фибронектин из медуз Podocoryne carnea и Aequorea victoria (Schlage, 1988).
При миграции клетки ткани у позвоночных синтезируют ММП для расщепления внеклеточного матрикса. У беспозвоночных существуют такие же белки ВКМ, следовательно, должны присутствовать протеазы, функционально аналогичные ММП позвоночных.
В литературе очень мало сведений о существовании протеаз, синтезируемых при миграции клеток или регенерации ткани у беспозвоночных. Недавно был опубликован ряд статей, в которых рассматривался морфогенез и процесс регенерации головы у гидры. Авторы указывают на участие специфических протеаз в этом процессе, в частности о функционировании ММП у Hydra (Yan et al, 2000a, 2000b; Leontovich et al, 2000). Известна также работа, посвященная участию ММП и
ремоделированию матрикса при регенерации кишечника у голотурии, животного, известного своей высокой способностью к регенерации (Quinones et al, 2002). До сих пор еще количество работ, посвященных матриксным металлопротеиназам беспозвоночных, недостаточно, особенно посвященных участию ММП в регенерации их тканей. Известно, что пресноводные планарии обладают высокими регенеративными способностями (Baguna et al, 1994). Недавно была опубликована очень интересная работа, посвященная присутствию расщепляющих ВКМ ферментов в поврежденных тканях планарии. В ней показано присутствие коллагенолитических ферментов в тканях при повреждениях. Полученный фермент был назван коллагеназой планарии (Sawada et al, 1999). Также известна работа, посвященная ремоделированию внеклеточного матрикса при регенерации кишечника у голотурий и участии ММП в этом процессе (Quinones et а, 2002). Авторы показали, что на ранних стадиях регенерации тканей происходят существенные изменения таких компонентов ВКМ, как коллаген, ламинин и фибронектин. Эти изменения коррелируют с присутствием протеолитической активности в тканях и они ингибируются 1,10-фенантролином, специфическим ингибитором ММП. Больше работ, посвященных действию ММП у морских беспозвоночных, в частности, у иглокожих, нам найти в настоящее время не удалось.
Внеклеточный матрикс беспозвоночных
Коллаген является наиболее широко изученным белком ВКМ у беспозвоночных, на его примере изучали некоторые аспекты молекулярной эволюции (Наг-Е1, Tanzer, 1993). Другие молекулы ВКМ изучены меньше и в основном на примере позвоночных, но известны и работы по установлению соответствия между ВКМ млекопитающих и морских беспозвоночных. Например, у морских ежей были найдены две формы коллагена, подобные волокнообразующим коллагенам (Shimuzu et al, 1990; D Alessio et al, 1989). Ламинин найден у многих позвоночных и беспозвоночных организмов. Его структура близка у всех видов и изучаются его биологические функции в составе внеклеточного матрикса. Этот белок хорошо изучен на примере дрозофилы (Fessler, Feselr, 1989; Kushe-Guillberg et al, 1992). Клонированы полная Рцепь и частично а-цепь ламинина гидры (Zhang et al, 2002). Ламинин гидры отличается тем, что в нем отсутствует аминокислотная последовательность YIGSR, а вместо нее на этом месте существует последовательность FTGTQ.
Эта последовательность, также как и пептид ламинина позвоночных, принимает участие в адгезии клеток и их миграции (Sarras et al, 1994). Ламинин найден также у морских ежей Spherechinous granulans, пиявки Hirudo medecinalis и антомедузы Podocoryne carnea (Beck et al, 1989, Schmid et al, 1991). Фибронектин дрозофилы Drosophila melanogaster был найден в 1988 году (Gratecos et al, 1988). Позже нашли этот белок у морского ежа (Iwata et al, 1981). Фибронектин найден также у туникатов (Akiyama, Johnson, 1983), морских ежей (De Simone et al, 1985; Fink, McClay, 1985; Katow et al, 1982; Spiegel et al, 1980; Wessel et al, 1984), у моллюсков (Akiyama, Johnson, 1983), губок (Akiyama, Johnson, 1983; Labat-Robert et al, 1981), во всех случаях он участвует в адгезии и дифференцировке клеток. Выделен фибронектин из медуз Podocoryne carnea и Aequorea victoria (Schlage, 1988). При миграции клетки ткани у позвоночных синтезируют ММП для расщепления внеклеточного матрикса. У беспозвоночных существуют такие же белки ВКМ, следовательно, должны присутствовать протеазы, функционально аналогичные ММП позвоночных. В литературе очень мало сведений о существовании протеаз, синтезируемых при миграции клеток или регенерации ткани у беспозвоночных. Недавно был опубликован ряд статей, в которых рассматривался морфогенез и процесс регенерации головы у гидры. Авторы указывают на участие специфических протеаз в этом процессе, в частности о функционировании ММП у Hydra (Yan et al, 2000a, 2000b; Leontovich et al, 2000).
Известна также работа, посвященная участию ММП и ремоделированию матрикса при регенерации кишечника у голотурии, животного, известного своей высокой способностью к регенерации (Quinones et al, 2002). До сих пор еще количество работ, посвященных матриксным металлопротеиназам беспозвоночных, недостаточно, особенно посвященных участию ММП в регенерации их тканей. Известно, что пресноводные планарии обладают высокими регенеративными способностями (Baguna et al, 1994). Недавно была опубликована очень интересная работа, посвященная присутствию расщепляющих ВКМ ферментов в поврежденных тканях планарии. В ней показано присутствие коллагенолитических ферментов в тканях при повреждениях. Полученный фермент был назван коллагеназой планарии (Sawada et al, 1999). Также известна работа, посвященная ремоделированию внеклеточного матрикса при регенерации кишечника у голотурий и участии ММП в этом процессе (Quinones et а, 2002). Авторы показали, что на ранних стадиях регенерации тканей происходят существенные изменения таких компонентов ВКМ, как коллаген, ламинин и фибронектин. Эти изменения коррелируют с присутствием протеолитической активности в тканях и они ингибируются 1,10-фенантролином, специфическим ингибитором ММП. Больше работ, посвященных действию ММП у морских беспозвоночных, в частности, у иглокожих, нам найти в настоящее время не удалось. Кожа человека - сложный орган, состоящий из нескольких слоев. Основными составляющими кожи являются эпидермис, дерма и разделяющая их базальная мембрана (Рис. 1.) Эпидермис - многослойный эпителий, состоящий в основном из кератиноцитов. Самый глубокий из внутренних слоев, базальный, образован базальными клетками, способными к делению. Над базальными клетками находятся несколько слоев более крупных шиповатых клеток, обладающих многочисленными десмосомами. Выше шиповатых лежит слой зернистых клеток, образующий границу между метаболически активной зоной и наружным слоем, состоящим из мертвых клеток. Наружные клетки редуцированы до чешуек, заполненных кератином.
Под слоем эпидермиса расположена дерма - соединительная ткань, образованная мембрану, в настоящее время считают коллаген IV типа, ламинин, протеогликаны и энтактни/нидоген (Альберте и др., 1994) (Рис. 2). Компоненты базальной мембраны синтезируются кератиноцитами, не считая нидогена, который синтезируется фибробластами дермы (Fleischmajer et al, 1995). Дермальные фибробласты также продуцируют компоненты базальной мембраны (Amano et al, 1999). Для образования базальной мембраны кожи необходима синхронизация продуцирования этих белков кератиноцитами и фибробластами. Дерма состоит из плотной массы соединительной ткани, содержащей сеть эластиновых волокон, кровеносные капилляры, лимфатические сосуды, мышечные волокна, сенсорные клетки, пигментные клетки, потовые железы и волосяные фолликулы. Большая часть клеток дермы имеет мезодермальное происхождение. В ней находятся фибробласты, меланоциты, клетки Лангерганса. Под дермой лежит подкожная клетчатка, содержащая жировые клетки. Если повреждение кожи неглубокое, базальная мембрана не повреждена, то рана заживает самостоятельно, кератиноциты от краев раны мигрируют на ее
Белки внеклеточного матрикса
Ламинин-1 получали из Engelbreth-Holm-Swarm саркомы мыши по модифицированному нами методу Палма и Фурча (Palm, Furcht, 1983). Ткань трижды гомогенизировали в 3,4 М NaCl, 0,05 Трис-НС1, рН 7,4, при 4 С с последующим осаждением центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин при 4 С. Осадок дважды экстрагировали в течение ночи в 0,15 М NaCl, 01 мМ ЭДТА, 0,05 М трис-HCl, рН 7,4, при 4С с последующим осаждением при 5000 g, 30 мин, 4 С. Все процедуры выполняли в присутствии ингибиторов протеаз N- этилмалеимида (ICN) и фенилметансульфонилфторида (PMSF, ICN). Примеси других белков из супернатанта удаляли путем высаливания при повышении концентрации NaCl до 2 М и осаждением при 10000 g в течение 30 мин при 4 С. После этого концентрацию NaCl в супернатанте повышали до 4 М и преципитат осаждали при 15000 g в течение 30 мин при 4 С. Полученный осадок растворяли в буферном растворе, содержащем 0,15 М NaCl, 0,05 М Трис-HCl, рН 7,4 и наносили на колонку (1,6 х 90 см) с Сефакрилом S-300, уравновешенную тем же раствором. Ламинин получали в свободном объеме колонки. Полученный белок замораживали и хранили при —70 С. 33.2. Ламинин-2/4 получали аналогично ламинину-1 по модифицированному нами методу Палма и Фурча (Palm, Furcht, 1983) из плаценты человека. Полученный белок хранили при —70 С. 3.3.3. Фибронектин получали из плазмы крови человека с помощью аффинной хроматографии на колонке с желатин-Сефарозой. В 25 мл буфера для связывания (0,5 М NaCl, 0,1 М NaHCCb) растворяли 50 мг желатина (Serva, желатин I типа из свиной кожи) при нагревании до 50-60С. Раствор желатина охлаждали до 20-30 С, а затем смешивали с 5 г CNBr-активированной Сефарозы (Sigma), которую предварительно подготавливали так, как указано изготовителем.
Полученную смесь перемешивали в течение ночи на мешалке при 4С. Несвязанный белок удаляли промыванием геля чистым буфером для связывания на пористом фильтре. Сефарозу затем инкубировали в течение I часа при комнатной температуре в растворе 1М этаноламина-HCl, рН 8,0 для блокирования остающихся активных групп. После промывания PBS, несколькими объемами 8М мочевины и PBS, гель использовали для наполнения колонки. Хранили адсорбент при 4С в буфере, содержащем 0,02% NaN3. 50 мл свежеполученной плазмы крови человека центрифугировали при 15000 g в течение 10 минут. Затем супернатант разбавляли в три раза чистым PBS и наносили на колонку с желатин- Сефарозой. Колонку промывали несколькими объемами PBS, двумя объемами Ш NaCl и опять PBS. Элюцию проводили раствором 4М мочевины в 0,05М Трис-HCl, рН 7,5. За элюцией фибронектина следили, измеряя оптическую плотность раствора при 280 нм. Егвопш для 1% раствора фибронектина для расчетов принимали равным 13 (Ruoslahti et al, 1982). Полученный фибронектин хранили в растворе мочевины при -20 С. Перед использованием раствор диализовали против трис-буфера. Образцы раневого экссудата собирали у пациентов Центра по лечению хирургических инфекций (Санкт-Петербург) после мастэктомии, у пациентов ожогового отделения Института скорой помощи им. Джанелидзе и у пациентов отделения термических поражений
Военно-Медицинской академии во время перевязок. Отбор экссудата проводили с помощью стерилизованного тампона из поролона, который накладывали на рану при перевязке на 15 минут, а затем центрифугировали для получения экссудата. Раневой экссудат стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм (Millipore). У пациентов с ожогами различной степени экссудат собирали стерильным шприцом из ожоговых пузырей для получения стерильного материала. Полученный экссудат центрифугировали для удаления клеток и кусочков тканей, после чего супернатант немедленно использовали для приготовления проб для зимографии. При необходимости аликвоты супернатанта замораживали в жидком азоте и хранили до дальнейшего использования. Образцы раневого экссудата были взяты у 15 пациентов после мастэктомии и у 5 пациентов с осложненными хирургическими ранами на разных сроках заживления после операции. Также были взяты образцы ожогового экссудата у 25 пациентов с ожогами разных степеней и у девяти пациентов с ожогами, обработанными способом «влажной камеры». «Влажная камера» представляет собой влагоудерживающее покрытие, обеспечивающее стерильность ожоговой поверхности, накладываемое на конечность пациента.
Экссудат, отделяемый с поверхности ожога, накапливается в этой камере и может быть стерильно взят для исследования. Образцы экссудата брали во время перевязок, начиная с первых суток после операции до прекращения экссудации. При нормальном ходе заживления отбор экссудата проводили до 6-7 суток. Раневой экссудат стерилизовали фильтрование через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore). 3.5. При проведении электрофореза белки разделяли в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 0,1% SDS по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Гели окрашивали 0,25% раствором Coomassie G-250 (Serva) в фиксирующем растворе (метанол:вода:ледяная уксусная кислота в соотношении 4:5:1) и избыток красителя отмывали этим же раствором без красителя. Для проведения зимографии пробы раневого экссудата готовили, смешивая с буфером для проб по Laemmli (Laemmli, 1970), не содержащим меркаптоэтанола, без нагревания, и инкубируя смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. Гель для проведения электрофореза (10% акриламида) полимеризовали вместе с раствором желатина, взятым в таком количестве, чтобы полученный гель содержал 1 мг/мл желатина.
Далее пробы наносили на гель в количестве, соответствующем 20 мкг белка на дорожку, и разделяли с помощью электрофореза. После промывания геля в течение 2 х 15 мин в 2,5% растворе Тритона Х-100 его инкубировали в течение 12 часов в буферном растворе 50 mM Tris-HCl, 5 тМ СаСЬ, рН 7,4. Затем гель окрашивали Coomassie Brilliant Blue. Присутствие металлопротеиназ, расщепляющих желатин, определяли по наличию неокрашенных полос на геле (Oliver et al, 1999). Для проведения количественного анализа содержания ММП-2 и ММП-9 высушенные гели сканировали и полученные изображения обрабатывали с помощью программ QuantiScan и Prizm 3.0. Протеолитическую активность выражали в процентах от активности ММП в плазме крови пациента. Для выявления положения зон, соответствующих металлопротеиназам ММП-2 и ММП-9, при зимографии использовали среду, кондиционированную фибробластами линии НТ-1080, которая содержит про-формы и активные формы ММП-2 и ММП-9 (Oliver et al, 1999). Количество белка в пробе определяли по Брэдфорду.
Колориметрическое определение количества клеток с помощью мтт
При изучении расщепления белков под действием экссудатов ламинин 1 и ламинин 2/4 в конечной концентрации 0,2 мг/мл инкубировали в 2% растворе экссудата в трис-буфере при 37С в течение 3, 6, 12 и 24 часов. После инкубации реакцию останавливали добавлением 3-х-кратного раствора для проб и готовили пробы для электрофореза. Электрофоретический анализ проводили на 10% ПАА геле с последующей окраской серебром. Для количественного анализа высушенный гель сканировали, а изображение обрабатывали с помощью программы QuantiScan. За расщеплением белка следили по изменению интенсивности специфических полос белка на электрофореграмме. Результаты выражали в процентах от первоначального количества белка в растворе. Интенсивность специфических полос интактного белка до расщепления принимали за 100%.
Работу с морскими звездами Asterias rubens проводили на Беломорской биостанции Зоологического института РАН (Кандалакшский залив Белого моря, губа Чупа, мыс Картеш). Морских звезд собирали сачком на небольшой глубине в районе острова Феттах и использовали в течение 3 часов после сбора. При длительных экспериментах животных содержали в большом объеме воды в термостатируемой комнате при температуре +8С с аэрацией. Собранных морских звезд непосредственно перед отбором целомической жидкости помещали на 15 минут в морскую воду, разбавленную наполовину пресной водой. Отбор целомической жидкости у морских звезд проводили, отрезая кончик луча и собирая вытекающую целомическую жидкость вместе с целомоцитами. После отбора целомическую жидкость центрифугировали для отделения целомоцитов. Из целомической жидкости немедленно готовили пробы для электрофореза и зимографии. Для хроматографического разделения бесклеточную целомическую жидкость концентрировали так, как описано ниже. Количество белка в супернатанте определяли методом Брэдфорда. Для получения целомоцитов целомическую жидкость собирали непосредственно в буфер CMFSS с добавлением ЭДТА для предотвращения агрегации клеток. После центрифугирования клетки переносили в буфер CMFSS или в раствор, используемый при дальнейшей работе.
Изучение состава целомической жидкости и целомоцитов проводили, создавая стандартные экспериментальные раны. Для этого у морских звезд один луч надрезали скальпелем. Пробы целомической жидкости отбирали у одного и того же животного через 30 и 60 минут для определения изменения состава через короткие сроки после нанесения раны. При определении изменения состава через более долгие сроки пробы отбирали через 6, 12 и 24 часа после повреждения ткани. За контроль принимали целомическую жидкость, взятую перед нанесением раны. Сразу после отбора готовили пробы для электрофореза и зимографии. После сбора целомическую жидкость центрифугировали (1000 g х 10 мин) для отделения целомоцитов и к супернатанту добавляли кристаллический сульфат аммония до 70% насыщения. Полученный раствор оставляли на ночь при 4С для формирования осадка и центрифугировали (4000 g х 30 мин). Собранный белковый осадок перерастворяли в растворе CMFSS и диализовали против него же. Количество белка в супернатанте определяли методом Брэдфорда. Для хроматографического разделения полученный концентрат белков целомической жидкости в CMFSS наносили на колонку для гель-фильтрации с Сефакрилом S-300, уравновешенную CMFSS и элюировали этим же раствором. Полученные фракции (3 мл) анализировали методами электрофореза и зимографии.
Биологическое действие фракций целомической жидкости оценивали по их влиянию на морфологию, пролиферацию и выживаемость соматических клеток линии L-929 через 24 часа после введения фракций. Клетки высевали на 24-х луночную плату за 2 сут до эксперимента. Плотность посева составляла 3 х 10 клеток/мл. В каждую лунку вносили по 1 мл суспензии клеток. За 1 сутки перед внесением белковых фракций среду меняли на бессывороточную. В качестве контролей в каждой серии опытов были взяты бессьшороточная среда и бессывороточная среда с добавлением CMFSS. Для уравнивания количества вводимого материала к вводимому объему фракции добавляли соответствующий объем CMFSS (в целом в лунку вводили 100 мкл добавок на 1 мл среды). Через сутки после введения добавок клетки снимали смесью трипсина с версеном (3:7), окрашивали трипановым синим и подсчитывали общую концентрацию клеток и процентное содержание живых. Количество клеток определяли колориметрическим методом с помощью МТТ. Изменение морфологии клеток наблюдали под микроскопом Opton (Германия). При подсчете клеток их условно разделяли на три группы: нормальные, измененные (вакуолизированные, с измененной формой) и мертвые клетки.проводили по методу Hoefer (Protein
Electrophoresis. Application Guide. Hoefer, USA, 1994). Для идентификации матриксных металлопротеиназ после проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Gelman) в буфере переноса по Таубину (Towbin, 1979) (25 мМ триса, 192 мМ глицина, 20% метанола и 0,1% додецилсульфата натрия) в течение 3 часов при 30 мА, 300 В. После переноса неспецифическое связывание блокировали при инкубировании в растворе 2% молока в Т-буфере (100 мМ трис-NC1, 150 мМ NaCl, рН 7,5). Избыток молока отмывали Т-буфером и мембрану инкубировали в растворе первых антител (моноклональные антитела, разведение 1:1000) в течение ночи при 4С. Несвязавшиеся антитела отмывали Т-буфером с добавлением 0,05% Tween-20 (Sigma, USA). После промывания раствором Т-буфера мембрану инкубировали в растворе вторых антител (Sigma, USA) в течение 60 мин. Несвязавшиеся антитела отмывали Т-буфером с добавлением 0,05% Tween-20 и белки окрашивали раствором соответствующего субстрата. В качестве первых антител использовали моноклональные мышиные антитела против ММП-2 и ММП-9 человека (Suomen Bioanalytikka Oy, Finland), в качестве вторых антител — антитела кролика против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (Sigma, USA).
Количественное определение фибронектина методом иммуноблоттинга
Свежеполученные целомоциты морской звезды в буфере CMFSS наносили на предметные стекла, покрытые фибронектином. После распластывания клеток в течение 20 минут при 16С клетки фиксировали формальдегидом (3% раствор в CMFSS), обрабатывали Тритоном Х-100 (0,1% раствор в CMFSS) и окрашивали первыми антителами (антитела мыши против ММП-2 и ММП-9 человека (SB-2210 и SB-2211 соответственно, Suomen Bioanalytikka Оу, Finland)). В качестве вторых антител использовали анти-мышиные антитела козы, меченые FITC (Sigma). Распределение окраски наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа Anxioscop (Германия).
Свежеполученные целомоциты морской звезды в буфере CMFSS наносили на предметные стекла. После распластывания клеток в течение 20 минут при температуре 16С клетки фиксировали формальдегидом (3% раствор в CMFSS) и окрашивали кроличьими антителами к фибронектину человека, любезно предоставленными В.Н. Морозовым (Институт Цитологии). В качестве вторых антител использовали антикроличьи антитела козы, меченые FITC (Sigma). Окраску наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа Anxioscop (Германия). Выделение белка из целомической жидкости проводили по схеме аффинного получения фибронектина из плазмы крови человека (Schlage, 1988). Фракции целомической жидкости, содержащие белки с молекулярной массой более 100 кДа, в трис-буфере (50 мМ трис-НС1, 0,15 М NaCl, рН 7,4) наносили на колонку с желатин-сефарозой, которую промывали этим же буфером, и элюировали этим же буфером, дополнительно содержащим 4 М мочевину (ICN). Присутствие белка в элюате контролировали по оптической плотности при 280 нм. 3.20. В работе было использовано следующее программное обеспечение: MicrosoftExcel 97; QuantiScan (version 2.1, 1999); Scion Image (Scion Corporation, 1998); Statistica (version 5,0, 1998, Statsoft). Статистическую обработку данных проводили при помощи программ СТАТИСТИКА (Боровиков, 2001) и Excel 97. Для получения раневого и ожогового экссудатов была разработана методика их отбора у пациентов.
Для получения образцов раневого экссудата при перевязках на поверхность раны накладывали стерильный тампон, смоченный физиологическим раствором, и оставляли его на 15 минут, после чего его центрифугировали для отделения экссудата. В ходе предварительных экспериментов было установлено, что количество белка, возможно остающееся на тампоне после центрифугирования, очень мало и практически не выявляется при окраске электрофоретического геля Кумасси. Для избежания ошибок соблюдались длительность наложения тампона и длительность центрифугирования. Супернатант немедленно использовали для приготовления проб или разделяли на аликвоты и замораживали при температуре жидкого азота. Перед использованием экссудат стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм (Millipore). При отборе ожогового экссудата его собирали, прокалывая ожоговый пузырь и отсасывая его содержимое в стерильный шприц. Полученный таким образом экссудат был стерильным.
Ожоговый экссудат центрифугировали и супернатант также немедленно использовали для приготовления проб для электрофореза и зимографии или замораживали. Ожоговый экссудат получали также из "влажной камеры". Такой экссудат также отбирали стерильным шприцом и далее поступали с ним так, как описано вьппе. Экссудат из "влажной камеры" также получали стерильно. В процессе предварительного исследования было установлено, что протеолитическая активность экссудатов сохраняется только при немедленном использовании образцов для анализа или при их замораживании при температуре жидкого азота и хранении при температуре не выше -70С. Для того, чтобы изучить протеолитическую активность раневых экссудатов, необходимо было установить, протеазы какого типа действуют при заживлении раны. Нас интересовали протеазы, обеспечивающие расщепление белков ВКМ. Присутствие протеаз в экссудате определяли методом зимографии (Heussen, Dowdle, 1980). При зимографии в процессе электрофореза теряют активность практически все протеазы, присутствующие в образцах. При ренатурации белков активность восстанавливается только для металлопротеиназ, поэтому с помощью выбранного нами метода зимографии можно было определять присутствие именно интересующих нас металлопротеиназ. Так как нас интересовали протеазы, расщепляющие основные белки ВКМ, то в качестве субстрата при зимографии был выбран желатин, как пример одного из основных белков матрикса ткани - коллагена.
