Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема взаимосвязи пролифератишюй активности клеток и морфологии интерфазного ядрышкового аппарата постоянно привлекает большое внимание исследователей.
Ядрышко является морфологическим выражением деятельности ядрышкового организатора - района ДНК, где локализованы гены, кодирующие основные классы рибосомной РНК. В интерфазных ядрах ядрышкообразующим районам хромосом (ЯОР) соответствуют элекг-рокнопрозрачные образования, именуемые фибриллярными центрами, которые окружены плотными фибриллярными и гранулярными компонентами. Фибриллярные центры (ФЦ) содержат расплетенную ДНК, а гранулярный компонент ядрышка представлен созревающими прерибосомамн.
Число и размеры фибриллярных центров в клетках существенно варьируют в зависимости от интенсивности транскрипции рРНК. Интенсивность синтеза рРНК различается у клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, но особенно большие различия наблюдаются между пролн-ферирующими и непролнферирующими популяциями клеток. Следовательно, морфология ядрышка достаточно тесным образом связана с клеточной лролиферацией, изучение морфологии ядрышка может быть использовано для оценки клеточной пролиферации.
Особый интерес исследователей к проблеме взаимосвязи морфологии ядрышка и процессов клеточной пролиферации связан с развитием и последние годы способа окрашивания ядрышкообразующих районов хромосом в интерфазном ядре с использованием нитрата серебра, который избирательно связывается в ядрышке с определенным классом кислых протеинов, имеющих непосредственное отношение к транскрипции и процессингу рибосомной РНК.
К моменту начала нашей работы в литературе имелось лишь небольшое число публикаций, посвященных взаимосвязи состояния ядрышкообра ту-ющих районов хромосом и кинетики клеточных популяций, выполненных на культурах клеток человека (см. обзор Derenzini, Trere, 1991). В частости, было показано, что среднее число гранул серебра в интерфазных ядрах исследованных клеточных линий обратно пропорционально времени удвоения (Derenzini el al., 1989). Авторы подчеркивали существование корреляции между средней іі.тошаді.ю окрашивания ЯОР жиратом сереора. чиє шм гранул серебра м жперфазном ядре и группой нпк.пате.тсп акгиіяюсіи кле-
і очной пролиферации, долей клеток в S фазе клеточного цикла, интенсивностью сшпеза ДНК в клеточной популяции, долей клеток, несущих "антигены пролиферации" (Derenzini et al., 1990, Derenzini, Trere, 1991).
Однако, в этих работах не было изучено распределение клеток по содержанию гранул серебра в зависимости от положения их в клеточном цикле. Оставатись неизвестной степень корреляции между долей клеток і S-фазе клеточного цикла и числом ядрышек, их площадью, показателями, характеризующими положение ядрышек в ядре.
Кроме того, не были изучены некоторые методологические аспекты использования нитрата серебра для оценки состояния ядрышкообразующш районов хромосом, влияние условий гипотонической обработки клеток и обработки клеток препаратом ДРБ (5,6-дихлоро-1Ь-В-рибофуранозилбенз-имидазолом) на результаты окрашивания.
Цели и задачи исследования.
-
Исследовать взаимосвязь доли клеток, включающих радиоактивный тимидин в культуре - индекса мечения (ИМ), и ряда морфологических параметров, характеризующих активность ЯОР интерфазных ядер: числа ядрышек в ядре, площади ядрышек, числа периферических ядрышек (ПЯ) -показателя, характеризующего положение ядрышек в ядре и числа гранул серебра в ядрышке при окрашивании клеток нитратом серебра. ~
-
Изучить зависимость числа гранул серебра в интерфазном ядре со положения клетки в различных фазах клеточного Цикла.
-
Выяснить степень зависимости среднего числа гранул серебра в интерфазном ядре от времени удвоения для различных культур клеток,
-
Определить зависимость числа гранул серебра в интерфазном ядре от условий приготовления препаратов - тоничности используемого гипотонического раствора и длительности инкубации клеток в присутствии препарата ДРБ.
Научная новизна. В результате проведенного исследования изучена зависимость различных морфологических показателей состояния интерфазного ядра исследованных клеточных линий, и показателей интенсивности ю пролиферации.
Результаты работ, проведенных с использованием трансформированные культур клеток и эмбриональных фнбробластов человека, показали, чтс существует корреляция между долей клеток, включающих радиоактивны! тимиЛг1Н,н числом гранул серебра в. ядре, площадью ядрышек, числом пе рііфернчеікнх ядрышек (ПЯ). Впервые обнаружено, что наиболее сильна;
корреляция наблюдается между индексом мечения клеток тимидином (ИМ) и числом ПЯ (т = 0,96), меньшая между ИМ и числом гранул серебра, ИМ и площадью ядрышек. Подавление пролиферации как способом контактного торможения, так и культивированием на среде со сниженным содержанием сыворотки, приводит практически к одинаковым изменениям исследованных морфологических показателен. Показано, что число гранул серебра в ядре и площадь ядрышек в клетках изменяются с разной скоростью при торможении и стимуляции пролиферации клеток: число гранул серебра и площадь ядрышек при прекращении пролиферации, вследствие сывороточного голодания культур, медленно снижаются в течение 10 сут, а увеличение названных показателей при стимуляции пролиферации происходит быстро,в течение 16 ч.
Разработан способ определения числа гранул серебра и содержания ДНК в одном и том же интерфазном ядре. Он использован для изучения распределения клеток Н1-60 по числу гранул серебра в ядре в зависимости от положения клетки в клеточном цикле.
Показано, что наблюдается обратно пропорциональная зависимость времени удвоения популяции и среднего числа гранул серебра в интерфазном ядре для суспензионных культур клеток лейкозного происхождения Hl-60, К-562, U-937.
Отмечено, что использование гипотонической обработки клеток перед приготовлением препаратов приводит к диссоциации ядрышка и увеличению вследствие этого выявляемого числа гранул серебра в ядре. Число гранул серебра увеличивается также при использовании для гипотонической обработки клеток растворов меньшей тонпчности.
Показано, что применение препарата ДРБ (5,6-дихлоро-1Ь-0— рибофура-нозилбензимидазола), вызывающего модификацию ядрышка, облегчает подсчет гранул серебра вследствие уменьшения взаимных наложений гранул и повышения контраста в окраске гранул по сравнению с фоном. Максимальное число гранул серебра наблюдается при обработке клеток этим препаратом в течение 1ч ЗОмин.
Практическая ценность. Данные о взаимосвязи интенсивности пролиферации клеток и морфологических показателе!) состояния ядрышка дают возможность использовать эти морфологически* показатели ч диагностической патологии, и особенно н онкологии. Результаты настоящей работы подтверждают наличие корреляции пролиферапшнон активное ги клеток ч числа гранул серебра в ядре, площади ядрышек, числа ПЯ при окр.і.чіпча-нии ядер азотнокислым серіЧїром. При лом обнаружено, что нзиоилына*
-4-корреляция набчкУпаетси между ИМ и числом ПЯ, что делает последний показатель наиболее перспективным для оценки пролиферативных процессов в клеточных популяциях.
Анализ влияния условий приготовления препаратов на результаты окрашивания ядер нитратом серебра позволяет рекомендовать, с целью облегчения ггодсчста числа грянул серебра в интерфазном ядре, гипотоническую обработку клеток 0,055 М раствором КС1 вместо традиционно используемого 0,075 М раствора, а также инкубацию клеток в присутствии 25 мкг/мл ДРБ в течение 1,5ч.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (С. Петербург, 1991), на совещании "Биология клетки в культуре" (С.-Петербург, 1992), на XI симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (С: Петербург, 1993) и межлабораторных семинарах в Институте цитологии РАН.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 9-ти работах, список которых приведен в конце автореферата.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных глав, выводов и списка литературы. Общий объем диссертации составляет 109 страниц, из них 99 страниц машинописного текста, 9 рисунков, 6 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 156 работ.
