Введение к работе
Актуальность исследования.
Взаимодействие клеток между собой, с шкклеточным матриксом и белками крови опосредуется расположенными на поверхности клеток молекулами клеточной адгезии ( МКА). Исследования, проведенные в последние годы показали, что взаимодействия этих молекул с соответствующими лигандами лежат в основе многих физиологических и патологических процессов, таких как воспаление, развитие иммунного отзета, заживление ран, остановка кровотечения, тромбогенез, атерогенез И других (H^nes and Lander, 1992) . Центральная роль в этих процессах часто принадлежит клеткам крови и сосудистой стенки. Эндотелиальные клетки (ЭК) монослоем покрывают внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов и способны зкспрессировать мембранные рецепторы клеточной адгезии, связывающие лиганды на поверхности лейкоцитов (McEver, 1991). Регулируемая локальная экспрессия МКА, последующее взаимодействие белых клеток крови с эндотелием иммиграция в. места воспаления или повреждения, это начальньа и, возможно, ключевые стадии в развитии клеточного ответа на действие разнообразных повреждающих юакі;ров (Albelda і Buck, 199( РоЬег & Cotran, 1990b). Таким образом, детальное изучение рецепторов клеточной адгезии, особенностей их экспрессии и распределения в эядотелиальных клетках, позволит сделать очередной шаг к пониманию механизмов и регуляции таких важных процессов, как воспаление, иммунный ответ, атерогенез и др. В настоящее время известны 5 основных молекул адгезии ЭК : р- и Е-селектины (семейство селектинов), vcak-I, ІСАН-І и РЕСАИ-І (суперсеюйство иммуноглобулинов). Появление селектинов, сначала Р-селектшіа, а
затем Е-селектина, на поверхности эндотелия приводит к замедленшв тока белых клеток крови вдоль сосудистой стенки. Прочная адгезия обеспечивается взаимодействием ІСАИ-І и vcah-I с интегринами на поверхности лейкоцитов ( HcEver, 1989; Bevilacqua, 1989; Rice, 1989). Нцэ одна молекула семейства иммуноглобулинов, РЕСАМ-І, по-видимому, участвует в процессе миграции клеток крови в субэндотелий ( Albelda, 1991).
Для исследования молекул адгезии ЭК и взаимодействия лейкоцитов с эндотелием в качестве стандартной модели широко используют культуру ЭК пупочной вены,. Однако, многие авторы отмечает важные функциональные отличия эндотелиальных клеток, полученных из разных сосудов (Fawcett, 1991; Hauser et al. ,1993). Эндотелиальньв клетки аорты человека представляют собой уникальный объект. Во-первых, это клетки не венозного, а артериального происхождения, во-вторых, это клетки подвергаются в организме воздействию жидкостного потока с высокими скоростями сдвига, в-третъих, они выделены.из сосуда, где часто возникают атеросклеротические поражения. Исследования ЭК аорты в культуре и in situ, проведенные в Институте эксперкшнтальной кардиологии КШ РАМН, показали, что эти клетки характеризуются высокой гетерогенностью, обладают уникальными морфологическими и функциональными особеняостяик (Antonоv et ai., 1Э86; Романов и Антонов, 1991). Тем не менее, исследования молекул клеточной адгезии в этих клетках до настоящего времени практически не проводились.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение экспрессии и распределения юлекул клзточной адгезии в культуре эндотелиальных клеток аорты человека.
В связи с этим были поставлены следующие' задачи:
-
Получить и охарактеризовать моноклональное антитело против Р-селектина - белка клеточной адгезии эндотелиальных клеток и тромбоцитов."
-
Изучить особенности распределения Р-селектина в культуре эндотелиальных клеток аорты человека в различных условиях (активация ЭК, действие видкостного потока, возраст культуры).
-
Изучить базальную и стимулированную цнтокинаш экспрессию индуцируемых молекул клеточной адгезии (Е-селектина, VCAH-2, ІСАК-І) в культуре, эндотелиальных клеток аорты человека.
4) --Изучить особенности распределения молекулы клеточной адгезии
РЕСАМ-І в культуре ЭК аорты человека.
Научная новизна работы Получено и охарактеризовано новое уникальное моноклональное антитело (монАТ) CRC8I, направленное против Р-селектина, рецептора клеточной адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток. CRC8I способно избирательно связываться с активированными. ЭК и тромбоцитагщ. Впервые было исследовано распределение Р-селектина в культуре ЭК аорты человека и были выявлены клетки, - не содержащие р-селектин. Количество таких клеток резко возрастает в результате пассирования культуры эндотелия. Воздействие жидкостного потока на культивируемые ЭК аорты человека приводило к появлению и-селектина на поверхности и увеличению числа Р-селектин-отрицательных клеток.
Впервые обнаружено, что индуцируемая молекула адгезии VCAH-I выявляется в культуре ЭК аорты человека не только после обработки цатокпнами, но и в отсутствие стимуляции. Показано, что ЭК аорты человека способны экспрессировать VCAM-I под действием различных цитокияов (фактдра некроза опухолей (TNF-альфа) и интерлейкина I
(iL-I)), причем эта способность ослабляется в результате пассирования культуры Было выяснено, что присутствие в культуре эндотелия гладкомышечных клеток (МО, усиливает способность ЭК экспрессировать VCAM-I в ответ на воздействие цитокинов з низкой
>
концентрации. В отличие от VCAM-I, Е-селектин выявляется только на поверхности стимулированных ЭК аорты человека, как при действии TNF-альфа, так и IL-L Показано, что ісам-і постоянно присутствует в ЭК аорты, но уровень экспрессии возрастает под действием индукторов (как TNF-альфа, так и іL —І). В культуре эндотелия аорты впервые обнаружены ЭК, неэкспрессирукщие РЕСАМ— I, колекулу клеточной адгезии, ранее считавшуюся дополнительным маркером ЭК Наши данные по экспресии молекул клеточной адгезии ЭК, выделенными из аорты человека, являются оригинальными, так как до сих пор большинство исследователей ограничиваются более доступным материалом, таким как ЭК пупочной вены. ....
Научно-практическая значимость работы Полученное в работе монАТ CRC8I направлено против Р-селектина и способно избирательно связываться с активированными ЭК и тромбоцитами человека и животных. Таким образом, это антитело может быть в перспективе использовано не только в экспериментах in vitro, но и in vivo, например, при юделировании тромбоза, сопровождапцегося локальной активацией тромбоцитов, или процессов, связанных с активацией эндотелия (воспаление, атеросклероз и др.). Антитело монет применяться как для визуализации этих процессов с помощью радиоизотопных методов, так и для направленного транспорта лекарственных препаратов.
Исследования различных МКА в культуре ЭК аорты человека
выявили ряд характеристик, специфических для этих" клеток, главная го которых - высокая гетерогенность экспрессии молекул адгезии. В отличие от ЭК пупочной вены, часть ЭК аорты не содержит такие МКА, как Р-селектин, а часть клеток экспрессирует индуцируемую молекулу vcam-I в-отсутствие стимуляции. Эти результаты 'свидетельствует о специфичности ЭК аорты в отношение экспрессии МКА и их отличии от ЭК, выделенных из других сосудов. В работе было выявлено, что длительное пассирование приводит к резкому изменению экспрессии молекул адгезии ЭК аорты человека: (I) увеличивается количество Р-селектин-отрицательных клеток; (2) исчезают VCAM-I-положителыше клетки; (3) снижается чувствительность клеток к стимуляции экспрессии индуцируемых МКА при действии цитокинов. Эти данные указывают на то, что адекватные исследования МКА в культуре ЭК крупных артериальных сосудов необходима проводить, используя первичную культуру или культуру 1-2 пассажей.
. Апробация работа Результаты работы были представлены на 3 международной конференции по атеросклерозу (1993,'Саратога, Япония), на 15 Европейском симпозиуме по исследованию сердца (1994, Копенгаген, Дания), на 10 Международном симпозиуме по атеросклерозу (1994, Монреаль, Канада). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов (глава 2), изложения результатов собственных исследований (глава 3) и их обсуждения (глава 4), выводов и списка литературы из 215 наименований. В диссертации. /& страниц, включая ^рисунков и _3
