Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 7
1.1. Протеогликаны и фибриллярные белки как основа ВКМ 7
1.2. Структура и классификация протеогликанов 8
1.3. Функции протеогликанов 12
1.4. Участие протеогликанов в регуляции поведения клеток 14
1.4.1. Участие протеогликанов в регуляции адгезии клеток 14
1.4.2. Влияние протеогликанов на пролиферацию и дифференцировку клеток 17
1.5. Роль протеогликанов в миогенезе 20
1.6. Методы вьщеления протеогликанов из биологического материала 24
1.6.1. Экстракция 24
1.6.2. Осаждение из раствора 24
1.6.3. Центрифугирование в градиенте плотности 25
1.6.4. Хроматография 25
1.7. Количественный и качественный анализ протеогликанов 28s,.
1.7.1. Обнаружение с помощью красителей и цветных реакций 28
1.7.2. Обработка специфическими ферментами 30
1.8. Масс-спектрометрическая идентификация протеогликанов 31
2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Реактивы и материалы 34
2.2. Методы 34
2.2.1. Миобласты L6Л и их культивирование 34
2.2.2. Выделение протеогликанов 35
2.2.3. Анализ углеводного состава протеогликанов 37
2.2.4. Электрофоретический анализ коровых белков протеогликанов 37
2.2.5. Масс-спектрометрический анализ протеогликанов 38
2.2.6. Изучение действия протеогликанов на адгезию миобластов 39
2.2.7. Изучение влияния гликозаминогликанов в комбинации с фактором роста фибробластов на пролиферацию миобластов 40
2.2.8. Изучение влияния гликозаминогликанов и протеогликана декорина на диф ференцировку миобластов 41
3. Результаты 45
3.1. Выделение протеогликанов из культуральнои среды, клеток и ВКМ 45
3.1.1. Анализ эффективности процедуры разделения протеогликанов культуральнои среды, клеток и ВКМ 45
3.1.2. Ионообменная хроматография протеогликанов на Q-сефарозе 47
3.2. Анализ углеводного состава протеогликанов 51
3.3. Электрофоретический анализ протеогликанов 51
3.3.1. Электрофоретический анализ фракций протеогликанов миобластов, ВКМ и культуральнои среды, полученных после разделения на Q-сефарозе 52
3.3.2. Оценка эффективности выявления коровых белков протеогликанов на примере декорина 52
3.3.3. Выявление коровых белков выделенных протеогликанов 53
3.4. Масс-спектрометрическая идентификация протеогликанов 57
3.5. Действие протеогликанов на адгезию миобластов 65
3.6. Влияние основного фактора роста фибробластов в комбинации с гликозаминогликанами(хондроитинсульфатом, дерматансульфатом, гепарином) на пролиферацию миобластов 67
3.7. Влияние гликозаминогликанов (хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарина) и протеогликана декорина на дифференцировку миобластов 70
4. Обсуждение результатов 76
5. Выводы 91
6. Список работ, опубликованных по теме диссертации 92
7. Список цитируемой литературы 93
- Участие протеогликанов в регуляции поведения клеток
- Анализ углеводного состава протеогликанов
- Электрофоретический анализ фракций протеогликанов миобластов, ВКМ и культуральнои среды, полученных после разделения на Q-сефарозе
- Влияние основного фактора роста фибробластов в комбинации с гликозаминогликанами(хондроитинсульфатом, дерматансульфатом, гепарином) на пролиферацию миобластов
Введение к работе
Одной из фундаментальных задач клеточной биологии является изучение механизмов взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом (ВКМ), который не только служит структурным каркасом ткани, но и влияет на рост и развитие контактирующих с ним клеток. Интенсивно развивающимся направлением таких исследований является выяснение функциональной роли протеогликанов (ПГ) - большого класса мультифункциональных соединений внеклеточного матрикса, состоящих из корового белка, ковалентно связанного с одной или более полисахаридными цепями -гликозаминогликанами (ГАГ). Эти углеводные цепи в значительной степени сульфатированы и несут большой отрицательный заряд, благодаря которому ПГ сильно гидратированы, что важно для обеспечения механической прочности ткани (Iozzo, Murdoch, 1996). С другой стороны, появляется все больше данных, подтверждающих разнообразные регуляторные функции ПГ (Iozzo, 2000; Kresse, Schonherr, 2001; Cool, Nurcombe, 2006; Evanko et al., 2007). Этим соединениям отводят роль модуляторов активности ростовых факторов (Ruoslahti, Yamaguchi, 1991; Iozzo, Murdoch, 1996; Langsdorf et al., 2007), секретируемых клетками ферментов и их ингибиторов (Bernfield et al., 1999; Iozzo, 2000). С регуляторными молекулами, такими, например, как факторы роста, взаимодействуют углеводные цепи ПГ, усиливая или подавляя действие факторов (Taipale, Keski-Oja, 1996). ПГ влияют на адгезию и миграцию клеток, участвуют в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки (Iozzo, 2000).
Большой интерес ПГ вызывают в связи с развитием и регенерацией мышечной ткани (Velleman et al., 2006; Liu et al., 2006; Droguett et al., 2006). На участие ПГ в миогенезе указывают данные об увеличении их синтеза в скелетных мышцах в условиях регенерации ткани при патологиях (Alvarez et al., 2002) или при повреждении (Caceres et al., 2000; Casar et al., 2004). Показано, что миогенез в ходе эмбрионального развития и при регенерации поврежденной мышцы сопровождается изменением спектра ПГ (Young et al., 1990; Velleman et al., 1999; Casar et al., 2004). Состав ПГ изменяется в ходе миогенеза на фоне динамичных изменений структуры мышечной ткани: происходит активация сателлитных клеток, их пролиферация и слияние с образованием миотуб, из которых формируются мышечные волокна (Charge, Rudnicki, 2004). Эти процессы невозможны без участия компонентов внеклеточного матрикса, в том числе ПГ, которые могут, как влиять на взаимодействие миобластов с ВКМ, так и регулировать действие ростовых факторов (bFGF, HGF и TGF-p), контролирующих пролиферацию и дифференцировку этих клеток (Velleman et al., 1999). Несмотря на значительное количество работ, посвященных выяснению роли ПГ в регуляции процессов миогенеза, конкретные функции ПГ и механизмы их участия в этих событиях остаются в большой степени на уровне предположений.
Цель работы состояла в изучении характеристик ПГ, синтезируемых миобластами L6J1, и исследовании их влияния на адгезию, пролиферацию и дифференцировку этих клеток.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1) выделить ПГ культуры миобластов;
2) определить основные классы ПГ культуры миобластов по составу ГАГ;
3) идентифицировать основные ПГ культуры миобластов;
4) изучить влияние ПГ/ГАГ на адгезию миобластов;
5) исследовать действие ПГ/ГАГ на пролиферацию миобластов;
6) изучить действие ПГ/ГАГ на дифференцировку миобластов.
Работа выполнена при финансовой поддержке СПб НЦ РАН (проекты 2-63-2005, 2-71-2006 и 2-95-2007). Список сокращений ДСН - додецилсульфат натрия ВЬСМ - внеклеточный матрикс ГАГ - гликозаминогликан(ы) ДМС - 1,9-диметилметиленовый синий ПААГ — полиакриламидный гель ПГ - протеогликан(ы) ЭБС - эмбриональная бычья сыворотка ЭДТА - этилендиаминтетрацетат динатрия bFGF - фактор роста фибробластов основной DMEM — модифицированная среда Дальбекко PBS - фосфатный буфер на физиологическом растворе, рН 7.4 TGF-p - фактор роста опухолей
Участие протеогликанов в регуляции поведения клеток
Влияние протеогликанов на пролиферацию клеток In vitro продемонстрировано, что ПГ разных классов могут оказывать как ингибирующее, так и стимулирующее действие на пролиферацию клеток (Iozzo, 2000). Механизмы этого действия ПГ либо не известны, либо авторы ссылаются на способность ПГ модулировать активность факторов роста (Aviezer et al., 1994; Trowbridge et al., 2002). В большинстве случаях наблюдаемое действие ПГ на рост клеток устраняют, удаляя их углеводные цепи (Clayton et al., 2001; Eickelberg et al., 2002). Именно цепи ГАГ взаимодействуют с факторами роста и модулируют их активность (Ruoslahti, Yamaguchi, 1991). Между тем, в литературе встречаются данные, свидетельствующие о том, что рост клеток способны регулировать коровые белки некоторых ПГ. Такое действие наблюдают у модулярных ПГ (например, у версикана), состоящих из доменов, один из которых гомологичен эпидермальному фактору роста и, возможно, отвечает за регулирующее рост клеток действие ПГ (Yang et al., 1999, Tanzer, 2006).
Роль положительных регуляторов пролиферации отводят гепарансульфат ПГ, гепарансульфатам и гепарину (Aviezer et al., 1994; Iozzo, Murdoch, 1996; Qiao et al., 2003; Villena, Brandan, 2004). Трансмембранные гепарансульфат ПГ синдеканы и перлекан рассматривают как рецепторы низкой аффинности для факторов роста (Aviezer et al., 1994; Pacifici et al., 2005), то есть они достаточно прочно связывают фактор, но не могут проводить сигнал - для этого необходимы специфические рецепторы факторов роста. Показано, что перлекан в несколько раз усиливает пролиферацию клеток СНО, трансфецированных геном рецептора bFGF, в присутствии самого фактора (Aviezer et al., 1994). Гепарин оказывает такое же действие, но в большей концентрации. Без фактора гепарин и перлекан не оказывают влияния на пролиферацию клеток. На примере почечных фибробластов показано участие синдеканов в регуляции активности фактора роста bFGF (Clayton et al., 2001). Так, добавление в среду культивирования ингибитора сульфатации ПГ хлората натрия или обработка клеток гепариназой, но не хондроитиназой, подавляет пролиферативную активность клеток, вызванную фактором bFGF. Добавление олигосахаридных фрагментов гепарансульфатов восстанавливает действие фактора.
Дерматансульфат ПГ и сами дерматансульфаты также способны стимулировать пролиферацию клеток (Trowbridge, Gallo, 2002). Показано, что дерматансульфаты составляют основную часть ГАГ раневой жидкости человека (Репс et al., 1998). ГАГ, выделенные из раневой жидкости, стимулировали пролиферацию клеток F32, экспрессирующих рецептор bFGF, в присутствии фактора роста bFGF, причем в отсутствии ГАГ фактор не проявлял своей активности. Смесь ГАГ из раневой жидкости, обработанная хондроитиназой В, разрушающей цепи дерматансульфата, незначительно усиливала пролиферацию клеток F32 в присутствии фактора. В то же время обработка этих ГАГ гепариназой, разрушающей цепи гепарансульфата, практически не меняла рост-стимулирующей активности смеси ГАГ раневой жидкости. Эти данные указывают на то, что дерматансульфат проявляет большую активность в отношении регуляции действия фактора роста bFGF, чем гепарансульфат, и может играть определенную роль в заживлении ран. Усиление пролиферативного ответа кератиноцитов под действием дерматансульфата было обнаружено для другого представителя семейства факторов роста фибробластов — FGF7 (фактор роста кератиноцитов), причем показано, что в отсутствии ГАГ этот фактор не проявляет своей активности (Trowbridge et al., 2002).
Способность стимулировать пролиферацию клеток выявлена и для гиалуроновой кислоты. Так, добавление гиалуроновой кислоты в среду культивирования дермальных фибробластов приводит к увеличению числа клеток на 20 % (Yoneda et al., 1988).
Вместе с тем, ряд публикаций свидетельствует о подавлении роста клеток под действием ПГ или ГАГ. Например, гепарин подавляет пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток миометрия в присутствии 10 % ЭБС, содержащей ростовые факторы, которые может связывать гепарин (Mason et al., 2003). На культуре легочных фибробластов человека показано, что гепарин ингибирует индуцированную фактором PDGF пролиферацию и миграцию клеток (Sasaki et al., 2000). Пока не понятно, оказывает ли гепарин это действие посредством инактивации самого фактора или реализуется другой механизм.
ПГ могут быть эффективны в качестве опухолевых супрессоров. Так, показано, что синдекан-1, добавленный в среду культивирования, подавляет рост некоторых линий раковых клеток, вызывая их апоптоз, и в то же время не оказывает влияния на рост нормальных клеток (Mali et al., 1994). Противоопухолевые свойства отводят представителю семейства "slrps" - декорину (Iozzo, Murdoch, 1996; Xaus et al., 2001). Сверхэкспрессия декорина клетками яичника СНО, трансфецированных геном декорина, подавляет рост этих клеток. Предполагают, что такое действие декорина опосредовано его взаимодействием с TGF-P и ингибированием пролиферативной активности этого фактора (Iozzo, Murdoch, 1996). Показано, что эпителиальные клетки различных опухолей, как правило, не синтезируют декорин. Клетки карциномы, экспрессирующие декориы de novo в результате трансфекции гена декорина, приобретают нормальный фенотип, останавливаются в фазе G1 клеточного цикла и вновь продолжают делиться, когда экспрессию декорина специфически подавляют. Эти данные указывают на прямое супрессирующее влияние декорина на рост клеток, которое не зависит от взаимодействия с фактором TGF-p. Было показано также, что декорин способен подавлять рост нормальных клеток. Так, этот ПГ ингибировал пролиферацию макрофагов, вызванную колоние-стимулирующим фактором макрофагов (M-CSF), но увеличивал их выживаемость после того, как фактор убирали из среды культивирования (Xaus et al., 2001).
Некоторые ПГ могут быть как положительными, так и отрицательными регуляторами роста клеток. Например, бетагликан - трансмембранный гибридный ПГ, содержащий цепи гепарансульфата и хондроитинсульфата, известен как корецептор TGF-Р (Eickelberg et al., 2002). Однако его действие на фактор не однозначно: в некоторых случаях он усиливает проведение сигнала фактора, а в других случаях может подавлять его действие. Например, показано, что растворимая форма бетагликана является антагонистом фактора. Бетагликан, синтезируемый почечными эпителиальными клетками в результате трансфекции его гена, ингибирует проведение сигнала TGF-p. Это заключение было сделано на основании данных по включению [ Щтимидина, синтезу коллагена, экспрессии генов-репортеров и фосфорилированию участников сигнального каскада — Smad2 и Smad3. Было показано, что бетагликан препятствует ассоциации рецепторов TGF-P I и II типа, необходимой для проведения сигнала фактора. Подавление бетагликаном проведения сигнала TGF-P было супрессировано в результате трансфекции клеток геном мутантной формы бетагликана, не содержащей цепи ГАГ.
Анализ углеводного состава протеогликанов
Электрофоретический анализ фракций ПГ миобластов, ВКМ и культуральной среды, полученных после разделения на Q-сефарозе
Для анализа коровых белков ПГ культуры миобластов проводили электрофорез материала, полученного после обработки ферментами хондроитиназой АС и гепариназой III основных фракции ПГ клеток, ВКМ и культуральной среды (фракции III и IV для ВКМ и культуральной среды, фракция III для клеток (см. рис. 15 в разделе «Результаты»)). Лиофилизированные фракции растворяли в воде, измеряли концентрацию белка по Бредфорд и ГАГ с помощью ДМС и готовили по 3 пробы для каждой фракции, из расчета 5 мкг ПГ в пробе: 1) контроль — без добавления фермента; 2) 0.5 ед/мл гепариназы III (37 С); 3) 0.5 ед/мл хондроитиназы АС (37 С). Дополнительно готовили контрольные пробы, содержащие только ферменты в той же концентрации, что и пробы с ПГ.
В пробы 2 и 3 добавляли 4-кратный буферный раствор, содержащий 100 мМ Tris-НС1, рН 7.5, 200 мМ NaCl, 16 мМ СаС12 в случае гепариназы III, и 200 мМ Tris-HCl, рН 7.3, 240 мМ NaOAc в случае хондроитиназы АС (проба : буфер - 3 : 1). Ферментативную обработку проводили в течение 5 ч, после чего фракции ПГ анализировали с помощью электрофореза в 7 %-ном ПААГ по Лэммли (Laemmli, 1970). Электрофорез проводили в восстанавливающих условиях: в пробы добавляли 4-кратный буфер для нанесения, содержащий 100 мМ Tris-HCl, рН 6.8, 40 % глицерина, 4 % SDS, 200 мМ дитиотреитола, 0.01 % бромфенолового синего и кипятили их в течение 2-3 мин.
Гели последовательно окрашивали: 1) 0.1 % Альциановым синим в растворе 50 % этанола и 10 % уксусной кислоты в течение 2 ч, после чего гель отмывали 3 раза по 20 мин тем же раствором без красителя; 2) 0.1 % Кумасси R-250 в растворе 10 % уксусной кислоты и 5 % этанола, после чего гель отмывали тем же раствором без красителя.
Коровые белки ПГ, выявленные с результате ферментативной обработки и электрофореза, анализировали далее с помощью масс-спектрометрии для идентификации индивидуальных ПГ. Метод выявления коровых белков ПГ на примере декорина.
Для модельного опыта по анализу коровых белков ПГ был использован препарат декорина (Sigma, США), обработанного хондроитиназой АС для расщепления углеводных цепей декорина - хондроитинсульфатов (см. рис. 17 в разделе «Результаты»). Были приготовлены 3 пробы: 1-10 мкг декорина без добавления хондроитиназы АС; 2—10 мкг декорина, 0.5 ед/мл хондроитиназы АС; 3 — 0.5 ед/мл хондроитиназы АС.
Ферментативную обработку проводили при 37 С в течение 5 ч. Перед проведением электрофореза в пробы добавляли 4-кратный буфер для нанесения и кипятили 2-3 мин. Электрофорез и окрашивание геля Альциановым синим и Кумасси R-250 проводили аналогично протоколу, описанному выше.
Идентификацию индивидуальных ПГ проводили с помощью масс-спектрометрии MALDIOF в НИИ Физико-химической медицины МЗ РФ (Москва), а также в AG
Bioanalytic (Лейпциг, Германия). Для этого анализировали коровые белки ПГ, выявленные в результате их обработки специфическими ферментами и последующего электрофореза. Фрагменты геля с включенными белками, выбранные для анализа, промывали 40 % ацетонитрилом в 0.1 М NH4HCO3 для удаления красителя. После удаления ацетонитрила гель обрабатывали 15 мкг/мл модифицированного трипсина (Promega) в 0.05 MNH4HCO3. Гидролиз проводили в течение 18 ч при 37 С, затем в пробу вносили 8 мкл 10 % водного раствора ацетонитрила, содержащего 0.5 % ТФУ. Надгелевый раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров. Для этого 1 мкл раствора смешивали с 0.3 мкл 20 % водного раствора ацетонитрила, содержащего 10 мг/мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich) и 0.5 % ТФУ. Полученную смесь высушивали на воздухе.
Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.005 %.
Полученные масс-спектры анализировали при помощи программы Mascot. Поиск по «пептидному фингерпринту» проводился в базе данных NCBI среди белков млекопитающих с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом.
В экспериментах по адгезии, наряду с ВКМ и ВКМ(-), использовали препарат ПГ ВКМ, составленный из фракций III и IV ПГ ВКМ, исходя из их соотношения на графике элюции (см. рис. 15 в разделе «Результаты»). Препарат ПГ культуральной среды (КС), также использованный в экспериментах, представлен фракцией IV, содержащей подавляющее количество ПГ КС.
В лунки 24-луночного планшета вносили по 20 мкг/мл ВКМ, ВКМ(-), ПГ КС, декорина, белка ВКМ фибронектина в 0.5 мл PBS. Кроме того, адгезию миобластов анализировали при использовании следующих комбинаций препаратов: 1) 20 мкг/мл ВКМ(-) и 1 или 10 мкг/мл ПГ ВКМ (фракции 3 и 4), 2) фибронектина (20 мкг/мл) и декорин (20 и 100 мкг/мл) или ПГ КС (20 и 100 мкг/мл). Планшет выдерживали 8 ч при 4-6 С. Затем убирали жидкую фазу, лунки трижды промывали PBS и в каждую ячеііку вносили 0.5 мл суспензии миобластов L6J1 в DMEM, содержащей 2 х 104 клеток. Через 2, 4 и б ч состояние клеток анализировали под микроскопом (ув. 100х).
Суспензию миобластов получали, снимая клетки с пластикового флакона (75 см ) обычным способом - выдерживали 2-3 мин в 500 мкл раствора трипсин/версен (1:3), открепившиеся клетки смывали 5 мл 10 % ЭБС в DMEM. Далее клетки отмывали от трипсина и ЭБС: миобласты осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, а осадок суспендировали в 5 мл DMEM и снова центрифугировали. После повторной промывки и осаждения миобласты суспендировали в 1 мл DMEM, подсчитывали количество клеток в камере Горяева, разводили клеточную суспензию до концентрации 4 х 10 клеток/мл и использовали в опыте.
При изучении влияния на адгезию миобластов полисахаридных цепей ПГ клетки вносили в лунки после обработки иммобилизованного субстрата (смесь фибронектина с ПГ в концентрации 100 мкг/мл) хондроитиназой АС. При проведении ферментативной обработки после промывки PBS в лунки планшета вносили 0.025 ед. хондроитиназы АС в 0.5 мл 50 мМ Tris-буфера, рН 7.3, 60 мМ NaOAc, и планшет выдерживали 3 ч при 37 С. Затем фермент 3 раза отмывали PBS и в лунки вносили суспензию клеток.
Электрофоретический анализ фракций протеогликанов миобластов, ВКМ и культуральнои среды, полученных после разделения на Q-сефарозе
Выделение ПГ из 3-х фракций культуры трансформированных миобластов L6J1 (культуральной среды, клеток и ВКМ) было проведено из материала, собранного после выращивания 109 миобластов, согласно схеме, описанной в разделе «Методы» (рис. 8)., Использование сильноосновного ионообменного сорбента Q-сефароза для извлечения ПГ из 3-х экстрактов указанных фракций позволило отделить ПГ, несущие сильный отрицательный заряд, от большей части белков. Эффективность этого способа концентрирования ПГ и очистки ПГ от белка отражены на рис. 14, на котором представлено содержание белка и ГАГ, входящих в состав ПГ, на всех этапах очистки -сорбция ПГ Q-сефарозой, промывка сорбента, элюция ПГ в градиенте концентрации NaCl. Концентрацию белка анализировали по Бредфорд, а ПГ - по реакции с красителем ДМС. Оказалось, что после сорбции отрицательно заряженных компонентов ВКМ, клеток и культуральной среды на Q-сефарозе и осаждения сорбента в супернатанте осталась подавляющая часть белка (рис. 14, А). Предварительная промывка Q-сефарозы буфером привела к снятию большей части сорбированного белка (рис. 14, Д В). Увеличение ионной силы элюирующего раствора вызвало элюцию ПГ, которые только на этом этапе выделения удалось определить с помощью специфического красителя ДМС (рис. 14, Г). Количество ГАГ, измеренное на стадии элюции, позволило судить о приблизительном содержании ПГ в исходных экстрактах, а содержание белка, определенное на каждом этапе очистке, в сумме дало общее количество белка во фракциях культуры миобластов.
Углеводная часть ПГ - ГАГ - как правило, преобладает над белковой, а коровый белок ПГ, как правило, составляет не более 50 % массы молекулы ПГ, то есть концентрация ПГ в исходных фракциях того же порядка, что и концентрация ГАГ. Проведенные расчеты свидетельствуют о ничтожно малой концентрации ПГ по сравнению с концентрацией белка во всех фракциях культуры миобластов (табл. 1): количество ПГ составило тысячные доли от количества белка. Концентрирование ПГ с помощью Q-сефарозы позволило повысить соотношение ГАГ : белок на стадии элюции в десятки раз (табл. 2). Большую часть этого белка также удалось отделить с помощью градиента концентрации NaCl и фракционировать сами ПГ, что продемонстрировано на графиках элюции ПГ с Q-сефарозы (рис. 15). Электрофоретический анализ фракций протеогликанов миобластов, ВКМ и культуральной среды, полученных после разделения на Q-сефарозе Объединенные фракции ПГ (I-IV) ВКМ, миобластов и культуральной среды, полученные в результате ионообменной хроматографии (рис. 15), анализировали с помощью электрофореза в 7 %-ном ПААГ (рис. 16). Для окраски белков в геле использовали Кумасси G-250 (фиолетовая окраска), а для окраски отрицательно заряженных гликозамииоглнканов - альциановый синий (синия окраска). Результаты электрофоретического анализа этих фракций ПГ полностью согласуются с графиками элюции ПГ с Q-сефарозы. Исключение составила фракция II ПГ миобластов, которая дала синее окрашивание в ПААГ (рис. 16, Клетки), но на графике элюции окраски этой фракции ДМС не было получено (рис. \5, Клетки).
Оценка эффективности выявления коровых белков ПГ на примере декорина Коровые белки ПГ выявляли методом ферментативной обработки с последующим электрофорезом. Особенности применения этого метода для анализа коровых белков ПГ были изучены на примере хондроитинсульфат ПГ - декорина (Sigma, США). При обработке этого ПГ ферментом хондроитиназа АС разрушаются цепи ГАГ, а коровый белок выявляется при электрофорезе. На рис. 17 представлен электрофорез декорина до, и после обработки ферментом (дорожки 1 и 2). Проиллюстрирована последовательная окраска одного и того же геля сначала альциановым синим, затем Кумасси R-250 (а и б). Альциановый синий позволил обнаружить факт наличия декорина в контроле без ферментативной обработки (рис. 17а, дорожка 1), а отсутствие окрашивания пробы после действия фермента свидетельствовало о том, что ферменативная реакция прошла (рис. 17а, дорожка 2). Последующая окраска Кумасси R-250 выявила новые банды в препарате С. AC I 67кДа-40кДа после ферментативной обработки, которых нет в контроле (рис. 176, дорожка 2). Сам фермент, который содержит БСА для стабилизации, также окрасился Кумасси R-250 (рис. 176, дорожка С.АС). Исключение полос фермента из пробы декорина после ферментативной обработки позволило выявить новый белок, мол. масса которого соответствует коровому белку декорина ( 40 кДа) (рис. 176, дорожка 2).
Коровые белки выделенных 111 выявляли аналогичным способом при сопоставлении электрофореграмм фракций ПГ до, и после обработки ферментами. Для анализа были взяты фракции, которые содержали максимальное количество ПГ по результатам ионообменной хроматографии (рис. 15): фракция Ш ПГ миобластов, фракции III и IV ПГ ВКМ, фракция IV культуральной среды. Согласно данным, приведенным в табл. 3, ПГ миобластов, ВКМ и культуральной среды состоят преимущественно из хондроитин/дерматансульфатов, а также содержат небольшое количество гепарансульфатов. Обработка этих фракций хондроитиназами ABC и АС и гепариназой III позволила выявить коровые белки ПГ при электрофорезе. На рисунках 18-22 приведены данные электрофоретического анализа ПГ ВКМ, миобластов и культуральной среды после ферментативной обработки. Электрофорез фракций III и IV ПГ ВКМ (рис. 18) показал, что ПГ обеих фракций - высокомолекулярные соединения, которые не входят в 7 %-ный ПААГ и задерживаются на старте (дорожки I и 4 соответственно). В результате обработки фракций Ш и IV хондроитиназой АС, специфичной в отношении хондроитинсульфатов, появляются новые белковые полосы (дорожки 2 и 5). При сопоставлении этих полос с картиной, которую дает сам фермент (дорожка 7), к коровым белкам ПГ могут быть отнесены полоса с мол. массой около 230 кДа, обнаруженная во фракции III, и полосы в области мол. масс 140-165 кДа, которые слабо выявляются во фракции III (дорожка 2) и становятся более отчетливыми во фракции IV (дорожка 5). Полосы, выявляющиеся в контроле на фермент (дорожка 7), можно объяснить
Влияние основного фактора роста фибробластов в комбинации с гликозаминогликанами(хондроитинсульфатом, дерматансульфатом, гепарином) на пролиферацию миобластов
Ингибирование адгезии миобластов хондроитинсульфат ПГ ВКМ(КС), выявленное нами in vitro, может иметь определенное значение в жизнедеятельности миобластов -регулируя адгезию клеток, ПГ могут влиять на их миграцию. Например, с помощью иммунолокализации показано, что такие подвижные клетки как фибробласты синтезируют хондроитинсульфат ПГ, которые встраиваются в матрикс по ходу движения клеток (Avnur, Geiger, 1984). Авторы выявили хондроитинсульфат ПГ в миграционном следе, оставленном фибробластами спустя 2 ч после рассева клеток. Этот факт, а также ингибирование адгезии миобластов хондроитинсульфат ПГ, обнаруженное нами, уїсазьівают на возможность участия хондроитинсульфат ПГ в механизме открепления заднего края клетки в процессе миграции. Существуют данные, свидетельствующие о том, что именно этот класс ПГ необходим для миграции миобластов. Так, обработка хондроитиназой ABC мышиных миобластов С2С12 полностью подавляла их миграцию, в то время как действие гепариназы III на миобласты снижало количество мигрировавших клеток только на 40 % (Villena, Brandan, 2004). Косвенным свидетельством в пользу необходимости хондроиинсульфат ПГ для миграции миобластов является увеличение экспрессии хондроитинсульфат ПГ версикана и бигликана при регенерации мышечной ткани, когда происходит активная пролиферация и миграция миобластов (Iozzo, 2000).
Таким образом, наряду с данными литературы результаты нашей работы указывают на участие протеогликанов ВКМ в регуляции адгезивных свойств ВКМ. Механизм этой регуляции может быть основан на изменении, как содержания, так и соотношения различных классов ПГ ВКМ. При этом хондроитинсульфат ПГ могут играть роль отрицательного регулятора, снижая адгезивность ВКМ.
Пролиферация. Пролиферация клеток - процесс, происходящий с участием факторов роста. Известно, что bFGF - один из важнейших регуляторов пролиферативной активности миобластов (Charge, Rudnicki 2004). С другой стороны, известно также, что ПГ способны связывать этот фактор, причем связывание происходит по углеводным цепям ПГ (Iozzo 2000). Основываясь на этих данных, bFGF был выбран для проведения экспериментов, в которых мы изучали возможное значение ПГ в модуляции способности bFGF стимулировать рост миобластов. В качестве добавок, влияющих на активность фактора, использовали такие ГАГ, как гепарин, хондроитинсульфат, дерматансульфат. Гепарин, хотя и не входит в состав ПГ, но имеет одинаковую структуру с гепарансульфатами, отличаясь от них степенью сульфатирования. Гепарансульфаты в свою очередь широко распространены в виде гепарансульфат ПГ в различных тканях (Gallagher, 2001). Использование гепарина служит обычным приемом, применяемым при исследовании роли гепарансульфат ПГ в регуляции клеточных процессов (Aviezer et al., 1994; Villena, Brandan, 2004). In vivo источником гепарина в тканях могут быть тучные клетки, которые, участвуя в воспалительном процессе, выбрасывают гепарин и другие биологически активные вещества в окружающую ткань (Lindstedt, Kovanen, 2006).
При исследовании способности ГАГ модулировать пролиферативную активность bFGF (рис. 36) было обнаружено, что гепарин и дерматансульфат вызывают достоверное увеличение включения клетками [ЗН]тимидина по сравнению с действием самого фактора. При этом дерматансульфат стимулировал пролиферативную активность фактора эффективнее, чем гепарин: прирост включения метки в присутствии дерматансульфата составил около 20 %. Добавление хондроитинсульфата привело к некоторому снижению рост-стимулирующего действия bFGF.
Цепи дерматансульфата в мышечной ткани могут содержать два ПГ - декорин и бигликан (Villena, Brandan, 2004). Экспрессия этих ПГ повышена при миодистрофии у мышей mdx, патология которых не приводит к летальному исходу вследствие повышенного уровня регенерации мышечной ткани (Bowe et al., 2000; Caceres et al., 2000). Показано также, что в процессе регенерации скелетных мышц после экспериментального повреждения хлоридом бария увеличивается экспрессия бигликана (Casar et al., 2004). Эти факты свидетельствуют об определенном вкладе, который могут вносить декорин и бигликан в регуляцию пролиферативной активности миобластов.
Известно, что уровень экспрессии таких гепарансульфат ПГ, как перлекан, синдеканы (1, 3, 4), глипиканы повышен во время регенерации мышечной ткани (Brandan, Larrain, 1998). Обнаружено взаимодействие этих ПГ через углеводные цепи гепарансульфата с bFGF (Iozzo, 2000). Причем на культуре клеток показано усиление проведение сигнала фактора в присутствии перлекана (Aviezer et al., 1994). Эти факты можно рассматривать как косвенные аргументы в пользу предположения о вовлечении гепарансульфат ПГ в регуляцию пролиферации миобластов.
Основным хондроитинсульфат ПГ мышечной ткани является версикан (Velleman, 2002). Показано, что эскпрессия этого ПГ также увеличивается в процессе регенерации скелетных мышц (Carrino et al., 1999). Однако, данные наших экспериментов указывают на отсутствие существенного модулирующего влияния хондроитинсульфата на рост-стимулирующую активность фактора bFGF. Основываясь на этом, можно предположить, что версикан не участвует в проведении сигнала фактора, и он, вероятно, необходим для обеспечения других клеточных процессов, которые сопровождают регенерацию, например, для обеспечения миграции миобластов.
Дифференцировка. Факторы роста, стимулирующие пролиферацию миобластов, в то же время ингибируют дифференцировку этих клеток. Так, факторы HGF/SF и bFGF, необходимые для пролиферации миобластов, поддерживают эти клетки в недифференцированном состоянии, в основном за счет ингибирования экспрессии миогенных регуляторных факторов, подобных MyoD (Wagers, Conboy, 2005; Christ, Brand-Saberi, 2002). К факторам роста, стимулирующим дифференцировку миобластов, относят IGF-I и IGF-II (Christ, Brand-Saberi, 2002). Эти факторы секретируют сами мышечные волокна. Все перечисленные факторы роста, как и bFGF, взаимодействуют с ПГ через их полисахаридные цепи, что указывает на возможность участия ГАГ или самих ПГ в регуляции дифференцировки миобластов, наряду с регуляцией пролиферации миобластов.
В последней части нашего исследования было изучено действие гепарина, хондроитинсульфата, дерматансульфата и ПГ декорина на дифференцировку миобластов (рис. 37-39). Маркером дифференцировки миобластов является экспрессия миогенных транскрипционных факторов таких, как миогенин, Mrf4, MEF2, а также тяжелых цепей миозина и мышечной креатинкиназы (Hawke, Garry, 2000). Кроме того, надежным признаком дифференцировки миобластов in vitro может быть слияние миобластов с образованием миотуб.
