Введение к работе
Актуальность проблемы
Витамин А и его производные являются естественными регуляторами гистогенеза эпителиальных тканей, а синтетические производные витамина А - ретиноиды применяются для лечения кожных заболеваний, протекающих с нарушением морфогенетических процессов в эпидермисе. Всвязи с этим было решено использовать в качестве модификатора морфогенеза 13-цис-ретиноевую кислоту (ІЗцРК), которая образуется в организме из ретинола (Ю И Афанасьев, В.И. Ноздрин, Ю.Т Волков, 1990, G Siegenthaler, JH. Saurat, М Ропес, 1990, М. Maden, М Hind, 2003)
К настоящему времени исследования, посвященные изучению воздействия ретиноидов на гистоструктуру эпидермиса, относительно немногочисленны. В России в последние три десятилетия наиболее последовательно в этой области работали на кафедре гистологии Московской медицинской академии им. И М Сеченова (Ю.И Афанасьев, В И. Ноздрин, 1983 и др.), а позднее - на фармацевтическом научно-производственном предприятии "Ретиноиды" (К С Гузев, В И Ноздрин, 2003, В.И Ноздрин, В.М Земсков, Ю Т Волков, 2004; В И. Ноздрин, В И Альбанова, Л Н Сазыкина, 2005, В.И Ноздрин, Т А Белоусова, В И. Альбанова, О И Лаврик, 2006 и др ) Следует отметить, что аналогичные зарубежные исследования посвящены в основном изучению воздействия на эпидермис полностью транс-ретиноевой кислоты, хотя в последние годы наметилось активное изучение свойств и ІЗцРК Полученные авторами данные (К A Tadini, L R. Gaspar, Р М. Maia Campos, 2006; М Schroeder, С С. Zouboulis, 2007) вполне согласуются с результатами отечественных исследований. Для объективизации морфологических аспектов дерматотропной фармакологической активности ретиноидов применяются морфометрические методы исследований с использованием компьютерных технологий Так, были выявлены определенные закономерности реакции эпидермиса на аппликации препаратов, содержащих ІЗцРК, в виде увеличения толщины кожного эпителия, снижения уровня кератинизации, тенденции к «омоложению» клеточной популяции при непродолжительном (ежедневном в течение двух недель) нанесении (В И. Ноздрин, А.С Кинзирский, Т А Белоусова и др., 2004) Но механизмы возникновения данных изменений оставались неясными В более ранних экспериментах, выполненных с использованием тимидиновой метки, подсчетом митотического индекса, определением плоидности и применением гистохимических методик, показано, что в условиях воздействия ретиноидов на кожу увеличивается пролиферативная актив-
ность кератиноцитов, изменяется плоидность их ядер и содержание в цитоплазме сульфгидрильных групп и гликозаминогликанов (В.И. Ноздрин, М.З. Бахшинян, Н.Я. Артюхина, 1977, 1982; Е.М. Каралова, А.В Петросян и др., 1988). Однако трактовка этих данных носила в значительной степени предположительный характер. Кроме того, не проводилось изучение длительности существования полученных эффектов после окончания нанесения препаратов Знание особенностей изменения гистоструктуры и морфометрических параметров эпидермиса в условиях воздействия ретиноидов определяет необходимость объективной, более информативной, выполненной с применением иммуноморфологических методов исследований оценки дерматотропной активности ретиноидов в отношении пролиферации дифференцировки.
До настоящего времени влияние ретиноидов на пролиферативную активность и дифференцировку клеток нормального эпидермиса изучалось, главным образом, в условиях культуры ткани (G.J. Fisher и J J Voorhees, 1996, A. Lokshin, Н. Zhang et al., 1999). Результаты этих исследований не отражают в полной мере процессы, происходящие в тканях, так как в клеточных культурах отсутствуют регуляторные влияния со стороны нервной, эндокринной, иммунной и др. систем. В литературе мы не встретили исследований, посвященных влиянию ретиноидов на клеточную популяцию кератиноцитов здоровых животных in vivo в свете оценки их цитогенеза, в том числе, выполненных с использованием иммуноморфологических методик. Также не удалось найти исследований по изучению состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после окончания нанесения препаратов, содержащих ІЗцРК
В связи с этим, изучение морфогенетических процессов в эпидермисе в норме и при воздействии на кожу биологически активных форм витамина А представляется актуальным. Учитывая, что многослойный плоский ороговевающий эпителий кожи является полидифферонной тканью, ведущая роль в которой принадлежит дифферону кератиноцитов (основному компоненту эпидермальной пролиферативной единицы), изучение гистогенетических процессов внутри этой клеточной популяции является целесообразным, так как может послужить более глубокому пониманию процессов, лежащих в основе регенерации эпидермиса, а также механизмов местного действия ретиноидов.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось изучение пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у крыс при накожном нанесении растворов 13-цис-ретиноевой кислоты.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи
Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у интактных крыс-самцов.
Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при накожном нанесении 13-цис-ретиноевой кислоты в виде растворов разных концентраций
Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после прекращения нанесения растворов 13-цис-ретиноевой кислоты
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1 Клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных крыс-самцов имеет суточные колебания Днем (в 12-13 ч) доля покоящихся клеток (Go -период) составляет 30,56±0,46%, делящихся - 14,71 ±0,46%, полиплоидизирующихся - 54,73±0,47%. В предутренние часы (3-4 ч) покоящихся кератиноцитов - 52,93±0,46%, делящихся - 26,66±0,63%, полиплоидизирующихся - 21,41 ±0,47%.
2. Аппликации растворов ІЗцРК приводят к увеличению количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся (Go) и полиплоидных клеток, что способствует накоплению в эпидермисе низко-дифференцированных кератиноцитов Наряду с кератолитическим действием ІЗцРК это обусловливает «омоложение» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса
3 Этот эффект сохраняется на протяжении 2 недель после отмены ІЗцРК, его снижение было отмечено только через 5 недель.
Научная новизна
Впервые разработан способ оценки пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса с использованием моноклональных антител
Впервые с помощью иммуноморфологических методов охарактеризованы суточные ритмы в эпидермисе крыс с использованием объективных параметров, индексов PCNA, Кі-67, индекса полиплоидизации
Впервые с помощью моноклональных антител проанализировано состояние популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при местном воздействии ІЗцРК В условиях ежедневных накожных аппликаций растворов ІЗцРК происходит активация пролиферативных процессов, проявляющаяся в увеличении количества делящихся клеток,
что, на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток, приводит к накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератино-цитов
Охарактеризована динамика структурных, морфометрических и иммуноморфологических показателей популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса в различные сроки после окончания накожных аппликаций ІЗцРК и установлено, что эффект от воздействия ІЗцРК является устойчивым, сохраняясь на протяжении 5 недель после окончания аппликаций.
Теоретическая и практическая ценность работы
В результате проведенных исследований выявлены основные характеристики цитогенеза кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у крыс-самцов Вистар в норме, изученные с помощью иммуноморфологических методик с использованием моноклональных антител (МКА) к Ki-67, PCNA (proliferation cell nuclear antigen - ядерный антиген пролиферирующих клеток), цитокератину 10. Установлено, что клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса крыс-самцов имеет суточные колебания. Определено процентное соотношение покоящихся (Go), делящихся и полиплоидных кератиноцитов в дневное и ночное время. Установлено что в предутренние часы (3-4 ч) в популяции кератиноцитов больше делящихся и покоящихся клеток и меньше клеток полиплоидных
Установлены структурные и иммуноморфологические проявления воздействия ІЗцРК на популяцию кератиноцитов Ежедневные, в течение двух недель аппликации растворов ІЗцРК вызывают утолщение клеточного эпидермиса, увеличение доли делящихся клеток, снижение представительства клеток покоящихся и полиплоидных и накопление в эпидермисе низкодифференцированных клеток. Обнаруженный эффект в сочетании с известным кератолитическим действием ІЗцРК приводит к «омоложению» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса
При экспериментальном исследовании состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после отмены препаратов, содержащих ІЗцРК, было установлено, что эффект от применения ІЗцРК (усиление пролиферативной активности, снижение количества покоящихся и полиплоидных клеток) носит пролонгированный характер, снижаясь только через 5 недель после окончания нанесения растворов ІЗцРК. Темпы возвращения пролиферативной активности кератиноцитов к показателям интактных животных оказались более медленными при использовании раствора с меньшей концентрацией ІЗцРК (0,025%), что
объясняется, по-видимому, большей сохранностью в этих условиях камбиального резерва кератиноцитов.
Полученные данные расширяют представление о механизме действия ІЗцРК на интерфолликулярный эпидермис. Они учтены при выборе концентрации действующего вещества в составе лекарственных форм и в обосновании терапии кожных заболеваний растворами, содержащими ІЗцРК.
Количественные критерии оценки процессов пролиферации и диф-ференцировки применительно к эпидермису, полученные с применением иммуноморфологических методов, могут оказаться полезным «инструментом» для объективной оценки состояния кожного эпителия.
Внедрение
Результаты исследований использованы при составлении нормативно-технической документации на новое лекарственное средство с ІЗцРК - Ретасол (раздел «Специфическая активность»); номер государственной регистрации № 001836/01- 2002 Препарат разрешен для наружного применения и выпускается на производственных мощностях ЗАО "Ретиноиды" Получен патент на изобретение № 2197235 «Раствор для лечения заболеваний кожи, способ его получения и способ лечения заболеваний кожи» с приоритетом от 05.04.2002 г
Апробация работы
Основные материалы работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (С-Петербург, апрель 2001 г.), на «Первом российском конгрессе дерматовенерологов» (С-Петербург, сентябрь 2003 г ), на Всероссийской конференции «Новые лекарственные препараты в дерматовенерологической практике» (Москва, ноябрь 2003 г ), на трех Всероссийских конференциях «Бабухинские чтения в Орле» (июнь 2005, июнь 2006, март 2007 гг ), на Всероссийском научном совещании анатомов, гистологов и эмбриологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (С-Петербург, апрель 2006 г), на VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, сентябрь 2006 г), на трех Всероссийских съездах «Человек и лекарство» (апрель 2003, апрель 2006, апрель 2007 гг)
Публикации
По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них в журналах по списку ВАК — 4.
Объем и структура диссертации
