Введение к работе
Актуальность темы
По данным статистики, пять процентов взрослого населения планеты страдает хроническими гепатитами различной этиологии (вирусные, аутоиммунные, метаболические), более половины которых заканчиваются циррозом. В свою очередь цирроз печени занимает первое место среди причин смерти от болезней органов пищеварения. И хотя клетки печени обладают чрезвычайно высоким потенциалом к самообновлению, в случаях, когда пролиферация гепатоцитов подавлена вирусной инфекцией или химическими агентами, а также когда повреждение печени носит хронический характер, т.е. происходит перманентный процесс репаративной регенерации, внутритканевые источники регенерации печени могут быть исчерпаны [Wiemann, 2002]. Единственным эффективным методом лечения цирроза на сегодняшний день является трансплантация печени. Однако доступность донорских органов не соответствует реальной потребности, к тому же существует риск отторжения трансплантированного органа, и неизбежная необходимость пожизненного приёма иммуносупрессивных препаратов.
В качестве альтернативы трансплантации печени могут быть разработаны и внедрены методы регенеративной медицины и, в частности, трансплантация стволовых/прогениторных клеток. Возможность образования гепатоцитов из стволовых клеток костного мозга впервые была показана в работе Петерсена и соавторов еще в 1999 году [Petersen, 1999]. В то же время миграция, хоуминг и возможности дифференцировки клеток пуповинной крови в печени ещё не исследованы в полной мере. Безусловно, именно пуповинная кровь может стать перспективным источником стволовых клеток для трансплантации, так как обладает такими преимуществами, как абсолютно нетравматичный и безопасный как для матери, так и для ребенка способ получения, а также высокая способность клеток к пролиферации и их низкая иммуногенность [Crdoso,1994, Rocha, 2000, Barker, 2001]. Большинство исследований, в которых изучалось участие кроветворных клеток в регенерации печени, было выполнено на моделях токсического повреждения органа, работ же, посвященных участию гемопоэтических стволовых клеток в восстановлении печени после частичной гепатэктомии, практически нет.
Механизм образования гепатоцитов из гемопоэтических стволовых клеток до сих пор является предметом бурного обсуждения. Предполагается, что возможна как прямая дифференцировка стволовых клеток [Terai, 2003, Ishikawa, 2006], так и слияние зрелых клеток миелоидной линии с резидентными гепатоцитами [Vassilopoulos, 2003, Wang, 2003, Alvarez-Dolado, 2003]. В результате слияния образуются гибридные клетки, которые экспрессируют специфические печёночные маркеры, но до конца не ясно, обладают ли они полным спектром функциональной активности гепатоцитов.
В клеточной медицине возможно применение как аллогенных, так и аутологичных клеток для лечения ряда заболеваний печени. Однако существуют болезни печени, например наследственные метаболические нарушения, такие как болезнь Вильсона-Коновалова, наследственные гликогенозы, в отношении которых применение аутологичных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетической модификации стволовых и прогениторных клеток и трансплантация «генетически вылеченных» клеток таким больным. В ходе разработки методов трансплантации генетически модифицированных клеток, необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства гемопоэтических стволовых клеток и их способность мигрировать в орган-мишень и дифференцироваться в клетки печени.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования стало изучение хоуминга и дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека при регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
-
Изучить активацию стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации им нативных мононуклеаров пуповинной крови человека.
2. Исследовать миграцию и пути дифференцировки нативных мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных крысам после частичной гепатэктомии.
3. Изучить возможность миофибропластической трансдифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных крысам после частичной гепатэктомии.
-
Определить влияние генетической модификации на жизнеспособность клеток пуповинной крови человека и их способность мигрировать в регенерирующую печень крыс после трансплантации.
-
Изучить возможность участия трансплантированных генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии.
-
Выяснить, являются ли трансплантированные нативные и генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови человека функционально активными в печени крыс.
Объект и методы исследования
Эксперименты проведены на 30-ти белых беспородных крысах-самцах, которым провели операцию частичной гепатэктомии по методике Хиггенса и Андерсона [Higgins, 1931]. Для получения результатов исследования были использованы различные экспериментальные подходы. Генетический метод позволил провести генетическую модификацию клеток пуповинной крови человека для трансплантации. Иммуногистохимический подход позволил с помощью специфических маркеров судить о реакции различных клеточных типов печени, об их пролиферации и активации стволовых клеток в ходе регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека. Морфометрический подход позволил количественно оценить число C-kit-позитивных клеток.
Достоверность полученных данных и их научная новизна
Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного и представительного объёма экспериментальных исследований, конкретной постановкой и решением поставленных задач.
Автор видит новизну полученных результатов в том, что впервые:
показано, что трансплантация мононуклеаров пуповинной крови человека меняет характер активации стволового компартмента в печени: в этом случае не происходит вовлечения в регенерацию синусоидных клеток, необходимых для её паракринной регуляции;
установлено, что после трансплантации клеток пуповинной крови человека в печени крыс, регенерирующей после частичной гепатэктомии, появляются клетки, несущие антигены человека и имеющие фенотип гепатоцитов, холангиоцитов и синусоидных клеток печени;
на основе иммуногистохимического анализа получены доказательства того, что трансплантированные мононуклеары пуповинной крови человека не подвергаются трансдифференцировке в миофибробласты в печени крыс;
показано, что генетическая модификация не влияет на способность мононуклеаров пуповинной крови мигрировать, встраиваться и дифференцироваться в паренхиматозные и непаренхиматозные клеточные типы печени крыс;
установлено, что трансплантированные нативные и генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека являются функционально активными в печени крыс.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты работы позволили по-новому оценить и понять закономерности изменения микроструктуры железы в ходе регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека. Проведенные исследования способствовали выявлению новых фактов как о характере, так и о последовательности клеточных реакций, возникающих в ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии, и участии в этих процессах гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека. Результаты работы изменяют представления о возможной роли трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в развитии фиброза печени. Теоретически значимым является установление способности нативных и генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека замещать различные клеточные типы в регенерирующей печени крыс. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения проблемы регенерации печени и участия гемопоэтических стволовых клеток в этом процессе. Результаты проведенных исследований позволяют на основе разработанных методических подходов создать принципиально новую схему клеточной и гено-клеточной терапии наследственных заболеваний, связанных с нарушением экспрессии генов в печени, когда в качестве материала для трансплантации будут использованы не донорские гепатоциты с ограниченным сроком жизни, а аутологичные генетически «вылеченные» стволовые клетки. В ходе выполнения работы разработаны методические подходы для генетической модификации мононуклеаров пуповинной крови.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. После частичной гепатэктомии и трансплантации фракции мононуклеаров пуповинной крови человека крысам гепатоциты, синусоидные клетки и холангиоциты экспрессируют антигены человека: антиген главного комплекса гистосовместимости человека – свидетельствующий о миграции и встраивании трансплантированных клеток; специфический антиген гепатоцитов человека и альфа-фетопротеин – свидетельствующие об их функциональной активности.
2. Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови человека путем электропорации не влияет на их жизнеспособность и потенцию к слиянию или дифференцировке в клетки протоковых структур, синусоидов и паренхимы печени крыс.
Сведения об апробации результатов диссертации
Результаты исследований доложены и обсуждены на ежегодных Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008-2010), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), 167-м международном симпозиуме Фальк (Mайнц, Германия, 2008), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010), 45-м Ежегодном собрании Европейской Ассоциации Изучения Печени (EASL) (Вена, Австрия, 2010).
Сведения о публикациях по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе три статьи в ведущих научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для опубликования основных результатов диссертаций. Общий объем публикаций – 3,4 условно-печатных листа, в т.ч. авторский вклад –1,7 условно-печатных листа.
Личный вклад соискателя
Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы. Соискателем составлен план, поставлены задачи, определены этапы исследования. Автор провел подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения эксперимента. Автором проведено 30 операций частичной гепатэктомии на белых беспородных крысах-самцах. Им лично проведены забор материала (регенерирующая печень) и его последующая заливка в парафин, нарезаны парафиновые срезы. В ходе исследования соискатель провел 910 иммуногистохимических окрашиваний срезов, с которых им было получено 1098 фотографии. Теоретическое обобщение материалов исследования, оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.
Внедрение результатов работы
Протокол электропорации мононуклеаров пуповинной крови человека включен в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете. Результаты проведенного исследования внедрены в работу ГМУ «Республиканская клиническая больница» (г. Казань), а также включен в дополнительную образовательную программу «Молекулярная и клеточная медицина» и в учебный процесс на кафедре нормальной анатомии и кафедре гистологии Казанского государственного медицинского университета.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132-х страницах машинописного текста, иллюстрирована 7-ю таблицами, 37-ю рисунками. Список использованных источников включает 246 наименований, из которых 20 отечественных и 226 зарубежных источников.
Получение мононуклеаров пуповинной крови человека *1
Пуповинная кровь была забрана специально обученным персоналом роддома по инструкции Банка стволовых клеток Казанского медицинского университета (лицензия №99-01-001961 от 13.10.2005). Сразу после рождения ребенка и отсечения пуповины кровь собирали в стандартную систему для взятия донорской крови. Выделение фракции мононуклеаров из пуповинной крови человека проводили методом седиментации в градиенте плотности фиколла [Hawley, 2004]. Подсчет количества и определение жизнеспособности ядросодержащих клеток осуществляли путем окрашивания трипановым синим. Концентрацию ядросодержащих клеток определяли по формуле (А*250*В/С, где А – число подсчитанных ядросодержащих клеток, В – разведение, С – число подсчитанных квадратов). Процент жизнеспособности рассчитывали как отношение числа жизнеспособных (неокрашенных) клеток к общему количеству ядросодержащих клеток. Во всех полученных образцах количество жизнеспособных клеток было не менее 97%.
Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови *2
Генетическую модификацию мононуклеаров пуповинной крови человека проводили методом электропорации [Von Levetzow G., 2006]. При пропускании электрического разряда через среду, содержащую смесь клеток и ДНК, происходит образование пор в клеточной стенке и транслокация генетического материала [Shigekawa, 1988]. В качестве трейсерной метки был использован усиленный зеленый флуоресцентный белок - ЕGFP. В работе использовали прибор Gene Pulser Xcell Total System (BioRad, USA) с фирменными кюветами с зазором электродов 0,4 см. Полученные результаты выявили наилучший результат электропорации клеток пуповинной крови человека при вольтаже 300 В, ёмкости 1500 мкФ.
Объект исследования и экспериментальная модель
Исследование проведено на 30-ти белых беспородных крысах-самцах весом 180-220 г, находящихся на стандартном рационе вивария. _________________________________________________________
1* Автор выражает благодарность Газизову И.М. и Йылмаз Т.С., совместно с которыми был выполнен данный фрагмент работы.
2* Автор выражает благодарность Ризванову А.А., совместно с которым был выполнен данный фрагмент работы.
Протокол исследования с использованием лабораторных животных соответствует требованиям, предъявляемым Республиканским Комитетом по Этическим вопросам при проведении клинических испытаний-исследований лекарственных средств при МЗ РТ (протокол № 2 от 21.02.06, № 1 от 11.02.2009).
Операция частичной гепатэктомии проведена по методике, описанной Хиггенсом и Андерсоном (Higgins GM, Anderson RM. 1931). Одной опытной группе (9 крыс) проводили классическую гепатэктомию. Другой опытной группе (9 крыс) после удаления долей печени в селезенку вводили по 3 млн. ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в 500 мкл среды RPMI. Третьей группе (9 крыс) после операции частичной гепатэктомии в селезенку вводили по 6х105 ядросодержащих клеток пуповинной крови человека, трансфецированных геном ЕGFP, в 500 мкл среды RPMI. Контрольной группе животных (3 крысы) после операции частичной гепатэктомии в селезенку вводили 500 мкл физиологического раствора. Удаленные во время операции доли печени использовали в качестве контроля. Объем удаленных долей составлял 68% от общей массы печени.
Методы исследования
Животных забивали под эфирным наркозом декапитацией через 2, 5, 7 суток после операции. После забоя извлекали печень для морфологического исследования. Ткань печени фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Окрашивание проводили с антителами к рецептору фактора стволовых клеток (С-kit) (клон T595, “Novocastra”, UK), антигену лейкоцитов человека (HLA-ABC) (клон W6/32, Dako, Denmark), a-гладкомышечному актину (a-ГМА) (клон 1A4, DAKO, Denmark), усиленному зеленому флуоресцентному белку (EGFP) (клон GSN24, Sigma, USA), цитокератину 19 (клон BA17, Dako, Denmark), специфическому антигену гепатоцитов человека (HSA) (клон OCH1E5, Novokastra, UK), альфа-фетопротеину (AFP) (клон С3, Dako, Denmark). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии С-kit и десмина (клон D33, DAKO, Denmark), EGFP и цитокератина 19. Далее гистологические срезы изучали под микроскопом (Leica, Германия) с последующим фотографированием.
Также было проведено морфометрическое исследование числа С-kit-позитивных клеток после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток пуповинной крови человека и без таковой. Морфометрическое исследование было произведено тремя исследователями с помощью морфометрической окулярной сетки на микроскопе Микмед-5 при увеличении х400.*3
