Введение к работе
Актуальность. Центральной проблемой современной гепатологии является идентификация региональной стволовой клетки печени. Необходимость решения этой проблемы продиктована значительной распространённостью хронических диффузных заболеваний печени, недостаточной эффективностью существующих методов их лечения, и, как следствие, – высокой частотой развития фиброза и цирроза печени в исходе этих заболеваний. В этом случае единственным методом лечения становится трансплантация печени. Однако существующий дефицит донорских органов, большие листы ожидания, высокая стоимость трансплантации и необходимость последующей иммуносупрессивной терапии (Lorenzini, Andreone, 2007) диктуют необходимость поиска новых подходов к терапии данной группы заболеваний. Идентификация стволовой клетки печени позволила бы перейти к разработке принципиально новых методов лечения хронических диффузных заболеваний печени, основанных на стимуляции собственных стволовых клеток в печени больного и применении клеточной терапии, в том числе и генетически модифицированными стволовыми клетками.
Изучению проблемы поиска региональной стволовой клетки печени посвящено значительное число исследований, выполняемых, как правило, на разнообразных моделях регенерации печени у животных (Evarts et al., 1990; Fausto, 1990; Sell, 1990; Фактор, Радаева, 1991; Sigal et al., 1992; Dabeva, Shafritz, 1993; Factor et al., 1994; Sarraf et al., 1994; Урываева, 1997; Braun, Sandgren, 2000) или путём культивирования различных популяций клеток, изолированных из печени животных и человека (Yin et al., 2002; Herrera et al., 2006). При этом из печени выделяют клетки, несущие те или иные маркёрные признаки стволовых клеток, или подобные признаки были выявлены или индуцированы у каких-либо клеток печени в процессе культивирования (Wang et al., 2003; Herrera et al., 2006). Однако, как это ни странно, вопрос о принадлежности этих стволовых клеток к какой-либо из описанных ныне клеточных популяций печени практически не обсуждается, и причина этого кроется, по-видимому, в самом подходе – клетки изучаются «сами по себе», вне связей с органом, из которого они были извлечены. Очевидно также, что если клетки были лишены своего привычного микроокружения, их свойства существенно отличаются от тех, которые они проявляют, находясь в естественной среде. Только исследования, проведённые in vivo, в условиях естественного микроокружения и взаимодействия клеток и межклеточного вещества, могут приблизить нас к идентификации региональной стволовой клетки печени. При этом основное внимание должно быть уделено, с одной стороны, изучению процессов внутриутробного развития органа, когда происходит первичная дифференцировка его клеток и закладка стволового компартмента, а с другой стороны – изучению фенотипа клеток во время репаративной регенерации органа, когда происходит активация его стволовых клеток.
Долгие годы одной из наиболее распространённых была теория, рассматривающая в качестве стволовых клеток печени так называемые овальные клетки, предположительно располагающиеся в начальных отделах желчевыводящих путей – канальцах Геринга (Theise et al., 1999). Однако в последнее десятилетие опубликовано значительное количество работ, посвященных идентификации и/или изоляции других популяций стволовых клеток из взрослой печени, которые, как и эмбриональные, способны к многократным делениям и являются бипотентными (Wang et al., 2003). Особый интерес в этой связи вызывают данные, свидетельствующие о возможности развития как гепатобластов/гепатоцитов, так и холангиоцитов из кроветворных (Lagasse et al., 2000; Theise et al., 2000; Schwartz et al., 2002; Fiegel et al., 2003; Zhan et al., 2006) и мезенхимных (Schwartz et al., 2002; Sato et al., 2005; Lange et al., 2006; Talens-Visconti et al., 2006; Sgodda et al., 2007) стволовых клеток, что также не укладывается в традиционные представления о развитии эпителиальных клеток печени исключительно из энтодермального эпителия передней кишки (Wells, Melton, 1999), а значит, оставляет открытым вопрос о клеточных источниках развития печени как органа, и, в первую очередь, её паренхиматозных клеток и клеток внутрипечёночных желчных протоков.
Самым интригующим, безусловно, является факт развития гепатоцитов из стволовой кроветворной клетки, т.е. клетки мезенхимной, а не энтодермальной. Также накапливается все больше сведений о ключевом влиянии на развитие печени окружающей ее мезенхимы (Le Douarin, 1975; Fukuda-Taira, 1981; Jung et al., 1999). В связи с этим возникает вопрос, могут ли постоянно присутствующие в печени мезенхимные синусоидные клетки быть источником образования гепатоцитов в ходе развития и регенерации, и какие именно клетки в составе окружающей печень мезенхимы являются главными для формирования её микроокружения. Для ответа на эти вопросы необходимы комплексные морфологические исследования эмбрионов и плодов человека и крысы различных сроков гестации с использованием иммуногистохимического выявления белков, специфических для определённых клеточных популяций печени и стволовых клеток. Особое внимание предполагается уделить изучению фенотипа мезенхимных синусоидных клеток печени и их взаимоотношений с эпителиальными клетками на ранних этапах развития печени человека, что позволит установить, какие из синусоидных клеток в наибольшей степени обладают признаками стволовых клеток и могут быть источником развития гепатоцитов. Наиболее перспективным кандидатом на эту роль может стать популяция звёздчатых клеток печени, поскольку именно они находятся в зрелой печени в непосредственном контакте с гепатоцитами, вырабатывают важнейшие факторы, регулирующие пролиферацию и дифференцировку клеток (Bachem et al., 1992; Schirmacher et al., 1992; Maxwell et al., 1994; Eckardt, 1996; Asahina et al., 2002; Friedman, 2008), и могут быть получены из кроветворной стволовой клетки (Baba et al., 2004). В этой связи исследования по изучению стволовых потенций данной клеточной популяции как в онтогенезе, так и при репаративной регенерации, а также в условиях in vitro, представляются весьма актуальными. Однако вопрос о клеточных источниках развития самих звёздчатых клеток до сих пор нерешён. Помимо мезенхимного, в литературе обсуждается как энтодермальное (Vassy et al., 1993; Suskind, Muench, 2004), так и нейральное (Geerts, 2001; Friedman, 2008) происхождение этих клеток. Детальное изучение фенотипа звёздчатых клеток печени в пренатальном онтогенезе позволит прояснить накопившиеся противоречия.
Еще один чрезвычайно важный вопрос, на который и сегодня нет однозначного ответа, – это вопрос о развитии внутрипечёночных желчных протоков. Причиной этого, по сути, является нерешённость проблемы, связанной с клеточными источниками развития холангиоцитов. Для её решения требуется детальный сравнительный анализ фенотипов предполагаемых клеток-предшественниц на разных этапах пренатального онтогенеза человека. Кроме того, поскольку желчные протоки являются важнейшим, но не единственным компонентом портальной системы печени, очевидно, что их развитие вряд ли может происходить независимо от развития кровеносных сосудов портальных трактов – воротной вены и печёночной артерии. Однако до сих пор взаимодействия портальных структур друг с другом в процессе развития исследованы крайне недостаточно (Shiojiri, Nagai, 1992; Libbrecht et al., 2002; Lemaigre, 2003; Roskams, Desmet, 2008). Поэтому весьма актуальным представляется изучение формирования внутрипечёночных желчных протоков во взаимосвязи с развитием кровеносных сосудов портальных трактов. Понимание источников и закономерностей формирования внутрипечёночного билиарного русла позволит прояснить механизмы развития врождённых атрезий и мальформаций желчных протоков, а изучение развития и регенерации печени с позиций поиска её стволовой клетки откроет наиболее перспективные направления разработки принципиально новых методов терапии хронических диффузных заболеваний печени с использованием клеточных технологий.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (госконтракт 16.512.11.2101), РФФИ (гранты 04-04-49164-а; 09-04-97013-р_поволжье_а) и фонда НИОКР РТ (грант 03-3.1-6/2006 (Г)).
Цель исследования:
Установить закономерности дифференцировки основных клеточных типов печени (гепатоцитов, холангиоцитов и синусоидных клеток), выяснить возможные клеточные источники их развития и значение в этом процессе мезенхимных клеток, а также ключевые этапы формирования сосудистых систем печени в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.
Задачи исследования:
-
Выяснить основные фенотипические характеристики эпителиальных и мезенхимных клеток человека, участвующих в первичной и вторичной печёночной индукции, и установить сроки мезенхимально-эпителиальных взаимодействий в процессе вторичной печёночной индукции.
-
Установить, какие типы синусоидных клеток печени человека могут развиваться из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка.
-
На основании иммуногистохимического анализа экспрессии белков, специфичных для мезенхимных и эпителиальных клеточных типов печени человека, установить, проявляют ли какие-либо из мезенхимных клеток признаки дифференцировки в эпителий в пренатальном онтогенезе. Установить возможность дифференцировки выявленных клеточных популяций, изолированных из печени крысы, в гепатоциты in vitro.
-
Установить, какие клеточные типы способны экспрессировать маркёры стволовых клеток в процессе пренатального и раннего постнатального развития печени человека и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.
-
Выяснить, какие клеточные типы образуют микроокружение для дифференцирующихся эпителиальных клеток и клеток кроветворных островков в пренатальном гистогенезе печени человека.
-
Охарактеризовать фенотипы дифференцирующихся и зрелых эпителиальных клеток печени человека (гепатобластов/гепатоцитов, холангиобластов/холангиоцитов) и сроки приобретения ими дефинитивного фенотипа в пренатальном онтогенезе.
-
Установить участие процессов пролиферации, апоптоза и миграции клеток при формировании протоковой пластинки и внутрипечёночных желчных протоков в пренатальном онтогенезе человека и в ходе репаративной регенерации печени человека и крысы.
-
Изучить с помощью специфических маркёров сроки появления эндотелиальных клеток в печени эмбрионов и плодов человека и проследить динамику изменений фенотипа данных клеток в пренатальном онтогенезе.
-
Установить этапы дифференцировки внутрипечёночных кровеносных сосудов (воротной и центральной вен, печёночной артерии) путём изучения экспрессии маркёров эндотелиальных и гладкомышечных клеток и провести анализ взаимодействий между развивающимися кровеносными сосудами и желчными протоками в пренатальном онтогенезе человека.
Научная новизна. В работе установлены новые данные о динамике экспрессии маркёров отдельных клеточных популяций в печени человека в ходе пренатального онтогенеза, которые позволили охарактеризовать закономерности формирования дефинитивного фенотипа эпителиальных и синусоидных клеток печени и возможные клеточные источники их развития. Результаты исследования показали, что в развивающейся печени человека все клетки могут быть разделены на группы в зависимости от продолжительности их дифференцировки: 1) клетки, приобретающие дефинитивный фенотип быстро, в течение 1-4 недель (эпителий желчного пузыря, эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов); 2) клетки, приобретающие дефинитивный фенотип в течение длительного срока (8-10 недель) и в ряде случаев экспрессирующие в процессе дифференцировки белки, нехарактерные для них в зрелом состоянии (гепатоциты, холангиоциты, звёздчатые клетки печени, мезотелиальные клетки капсулы печени).
Впервые установлено, что эмбриональные гепатобласты человека имеют общие фенотипические признаки как с окружающими печень мезенхимными клетками и звёздчатыми клетками печени (десмин, цитокератины (cytokeratin, СК) 18 и 19), так и с энтодермальными эпителиальными клетками передней кишки (СК18 и СК19, эпителиальный специфический антиген (ESA)), что может указывать на возможность развития эпителиальных клеток печени (гепатоцитов и холангиоцитов) из двух источников – энтодермы и мезодермы. Кроме того, было продемонстрировано, что клетки мезенхимы вентральной брыжейки и звёздчатые клетки печени имеют практически идентичный фенотип, что позволяет говорить о происхождении последних именно из мезенхимы, а не из других источников. Сами же звёздчатые клетки печени – единственный клеточный тип, имеющий сходные с эмбриональными гепатобластами фенотипические признаки (десмин, СК18 и СК19) и экспрессирующий маркёры стволовых/прогениторных клеток в пренатальном периоде (Bcl-2) и в процессе репаративной регенерации (C-kit).
Данный факт, наряду с впервые установленной нами возможностью дифференцировки десмин-позитивных звёздчатых клеток крысы в гепатобласты/гепатоциты in vitro, позволяет рассматривать именно этот клеточный тип в качестве основного кандидата на роль региональной стволовой клетки печени. Принципиально новым является то, что основным фактором, определяющим возможность дифференцировки звёздчатых клеток в гепатоциты в культуре, является образование монослоя, то есть установление плотных межклеточных контактов между клетками. Стволовые потенции звёздчатых клеток крысы подтверждают и полученные нами экспериментальные данные, демонстрирующие способность этих клеток экспрессировать рецептор к фактору стволовых клеток C-kit в ходе регенерации печени, вызванной токсическим воздействием нитрата свинца или частичной гепатэктомией.
В работе впервые показано, что популяция эпителиальных клеток печени человека с самых ранних этапов эмбрионального развития неоднородна по форме, размерам и способности экспрессировать СК18 и СК19, что свидетельствует о раннем разделении путей дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов. Установлены последовательность, основные этапы и сроки формирования дефинитивного фенотипа гепатоцитов и клеток внутрипечёночных желчных протоков. Критическим для развития гепатоцитов является период с 3-й до 8-й недели гестации (НГ), когда они, выселяясь из передней кишки, утрачивают способность экспрессировать характерный для кишечного эпителия эпителиальный мембранный антиген (ЕМА) и транзиторно экспрессируют ряд маркёров, которые отсутствуют в зрелых гепатоцитах (десмин, C-met, C-kit, ESA). После 8-й НГ экспрессия этих маркёров в большинстве гепатобластов существенно снижается, тогда как экспрессия специфических для гепатоцитов гепатоцитарного специфического антигена (HSA) и CD66a интенсивно нарастает. Несомненно, к новым следует отнести данные о центрах дифференцировки гепатоцитов в течение различных периодов онтогенеза. Так, если на ранних этапах ключевым фактором для запуска дифференцировки гепатоцитов является взаимодействие между гепатобластами и десмин-позитивными клетками мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки желудка, а затем звёздчатыми клетками печени, и этот процесс наиболее активно происходит на периферии печени, то в последующем центры дифференцировки гепатоцитов смещаются к кровеносным сосудам.
Впервые показано, что критическим для дифференцировки холангиоцитов человека является период с 5-й по 13-ю НГ, когда эти клетки, расположенные среди гепатобластов, впервые можно отличить от последних по морфологии и набору выявляемых маркёров. Так, для них, в отличие от гепатобластов, не характерно присутствие десмина, C-met, HSA и CD66a. Установлено, что первые дифференцированные холангиоциты, экспрессирующие ЕМА и СК7, появляются при образовании просвета протоков на 12-13-й НГ, что на 2 месяца раньше, чем считалось ранее (Van Eyken et al., 1988). Впервые показано, что микроокружение для дифференцирующихся холангиобластов у человека образуют десмин-позитивные звёздчатые клетки, а не миофибробласты портальных трактов. Становление системы внутрипечёночных желчных протоков связано с формированием кровеносных сосудов портального тракта. Так, формирование протоковой пластинки начинается сразу после появления фенотипических отличий между афферентными и эфферентными венами внутри печени на фоне формирования системы воротной вены, а ремоделирование протоковой пластинки и образование первых желчных протоков неразрывно связано с предшествующим этому появлением в печени артериальных сосудов и формированием портальных трактов.
В проведённом исследовании впервые установлено, какие клеточные типы в развивающейся печени человека проявляют признаки стволовых клеток. Оказалось, что на разных этапах развитиях такие свойства можно выявить у весьма широкого круга клеток. Однако только звёздчатые клетки печени и сами гепатоциты сохраняют такую способность практически на всем протяжении пренатального развития, и именно эти клетки проявляют свойства прогениторных в ходе репаративной регенерации печени у человека и у крысы, экспрессируя C-kit, что позволяет говорить о возможности существования в печени как минимум двух типов региональных стволовых клеток – гепатоцитов и звёздчатых клеток.
Важнейшим фактом, установленным в результате исследования, стало то, что микроокружение кроветворных островков в первую очередь представлено десмин-позитивными звёздчатыми клетками печени.
Теоретическая и практическая значимость. Проведённые исследования позволили получить новые факты, которые раскрывают закономерности гистогенеза и межклеточных взаимодействий между эпителиальными и мезенхимными клетками печени в ходе пренатального развития печени человека. Фенотипическая характеристика дифференцирующихся и зрелых клеток развивающейся печени будет иметь несомненное значение для изучения процессов регенерации и канцерогенеза печени человека, а так же при проведении экспериментов in vitro, поскольку позволит выявлять и отличать клетки, имеющие разную степень дифференцированности. Данные сведения имеют и практическое значение для диагностики заболеваний печени и прогнозирования возможности развития первичного рака печени и/или степени его злокачественности.
Полученные в ходе исследования факты, указывающие на возможность развития эпителиальных клеток печени человека как из эпителия передней кишки, так и из мезенхимных клеток поперечной перегородки и вентральной брыжейки, позволяют внести коррективы в устоявшуюся теорию развития печени, рассматривающую в качестве клеточного источника развития гепатоцитов только эпителий кишки. Кроме того, и наиболее распространённая теория развития внутрипечёночных желчных протоков – теория трансформации – также нуждается в коррекции. С учётом полученных фактов сегодня вряд ли можно говорить о трансформации гепатобластов в холангиоциты. Более вероятным представляется другая последовательность событий: энтодермальная эпителиальная клетка-предшественница из передней кишки на самых ранних этапах развития печени (не позднее 4-й-5-й НГ) даёт начало двум популяциям: клеткам-предшественницам гепатоцитов (гепатобластам) и клеткам-предшественницам холангиоцитов (холангиобластам, сначала образующим протоковую пластинку, а затем – собственно желчные протоки). Кроме того, проведённый анализ развития внутрипечёночных желчных протоков и кровеносных сосудов свидетельствует о необходимости афферентного кровотока для формирования холангиоцитов и желчных протоков, что позволяет по-новому взглянуть на механизмы развития билиарной системы печени и приблизиться к пониманию причин развития атрезий внутрипечёночных желчных протоков.
Чрезвычайно важными как с теоретической, так и с практической точки зрения являются результаты комплексных исследований по выявлению клеточных популяций печени, обладающих свойствами стволовых клеток, которые позволили выделить звёздчатые клетки печени в качестве главных претендентов на роль региональной стволовой клетки печени. Совокупность полученных данных о значении звёздчатых клеток для дифференцировки гепатоцитов, холангиоцитов и кроветворных клеток позволяет по-другому взглянуть на биологию этой популяции синусоидных клеток и рассматривать их не только как депо ретиноидов и основной источник компонентов межклеточного матрикса, но, в первую очередь, как ключевой элемент в морфогенезе и регенерации печени. Имеющиеся на сегодняшний день данные о морфологии и физиологии звёздчатых клеток печени позволяют перейти к экспериментам по моделированию применения данного клеточного типа в качестве стволовых клеток для терапии различных заболеваний и повреждений печени.
Внедрение результатов исследования. Полученные данные о закономерностях экспрессии фенотипических и линейных маркёров различными клеточными типами печени человека используются в качестве диагностических и прогностических критериев в работе гастроэнтерологического отделения Республиканской клинической больницы МЗ РТ и отделения вирусных гепатитов Республиканской клинической инфекционной больницы МЗ РТ в морфологической диагностике хронических заболеваний печени. В ходе проведения данного исследования был модифицирован ряд методов иммуногистохимического выявления антигенов, и эти модификации внедрены в исследовательскую работу кафедры нормальной анатомии и кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета, а также в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете.
Материалы диссертации включены в лекционные курсы для студентов кафедр гистологии, нормальной анатомии, инфекционных болезней и детских инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета, слушателей цикла повышения квалификации «Молекулярная и клеточная медицина» Казанского государственного медицинского университета и курсантов кафедры инфекционных болезней Казанской государственной медицинской академии.
Апробация работы состоялась на совместном научном заседании сотрудников кафедр нормальной анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета (10 января 2012 года).
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: итоговой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящённой 40-летию КГМА (Кемерово, 1996); II-IV Республиканских конференциях молодых учёных и специалистов (Казань, 1996, 1997, 2001); IV Всероссийской научной конференции «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных» (Казань, 1997); II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, D и G – проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1997, 1999); Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 1997); научной конференции, посвящённой 35-летию ЦНИЛ КГМУ (Казань, 1997); конференции молодых учёных России с международным участием, посвящённой 240-летию ММА им. И.М.Сеченова (Москва, 1998); международных симпозиумах «Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry» (Братислава, 1995, 1998); IV, VIII, IX, XIV, XVI Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 1999, 2003, 2004, 2009, 2011); IV Съезде Российских морфологов с международным участием (Ижевск, 1999); XI международном конгрессе по заболеваниям печени (Базель, 1999); XI и XIII международных конгрессах по гистохимии и цитохимии (Йорк, 2000; Сан-Диего, 2004); XVIII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001); XXXVII, XXXXIV-XXXXVI встречах Европейской ассоциации по изучению печени (Мадрид, 2002; Копенгаген, 2009; Вена, 2010; Берлин, 2011); VI конгрессе международной ассоциации морфологов (Уфа, 2002); V общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); XII, XIII международных гепатологических неделях (Фрайбург, 2003, 2006); I-IV международных конгрессах по гастроэнтерологии (Фрайбург, 2004, 2010; Дрезден, 2007; Майнц, 2008); XVI конгрессе международной федерации анатомических обществ (Киото, 2004); Всероссийской научной конференции с международным участием, посвящённой 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии человека БелГУ (Белгород, 2006); Британско-Российском совещании в сотрудничестве с Европейской комиссией по стволовым клеткам (Москва, 2007); научно-практической конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина (Санкт-Петербург, 2007); объединённой европейской гастронеделе (Вена, 2008); международной конференции европейской ассоциации по изучению печени (Будапешт, 2009); Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); 10-м юбилейном съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2010); IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); III Международном симпозиуме «Актуальные вопросы клеточных технологий» (Москва, 2010); II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2011), международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011).
-
Гепатоциты человека развиваются из двух клеточных источников: энтодермального эпителия передней кишки и десмин-позитивных клеток мезенхимы поперечной перегородки и вентральной брыжейки и их потомков – звёздчатых клеток печени, имеющих смешанный мезенхимально-эпителиальный фенотип и экспрессирующих маркёры стволовых клеток. Звёздчатые клетки печени крысы проявляют свойства прогениторных клеток печени также в процессе её репаративной регенерации, экспрессируя C-kit, и способны дифференцироваться в гепатоциты in vitro в чистой культуре при образовании монослоя.
-
Разделение путей дифференцировки потомков общей эпителиальной кишечной клетки-предшественницы на две клеточные линии – гепатоциты и холангиоциты – происходит в течение первой недели после закладки печени человека, когда в ней выделяются две популяции эпителиальных клеток, отличающихся размерами, формой и экспрессией фенотипических маркеров (СК19, десмин, C-met, CD66a, HSA, ЕМА, СК7). При этом основным клеточным типом, образующим микроокружение для дифференцирующихся гепатобластов и холангиобластов, а также кроветворных стволовых клеток, являются мезенхимные десмин-позитивные клетки поперечной перегородки и вентральной брыжейки и звёздчатые клетки печени.
-
Формирование системы внутрипечёночных желчных протоков у человека связано с развитием афферентных кровеносных сосудов: дифференциация ветвей воротной вены и центральных вен предшествует формированию протоковой пластинки, затем в печень прорастают ветви печёночной артерии, после чего начинается перестройка протоковой пластинки, приобретение холангиобластами дефинитивного фенотипа и их миграция в мезенхиму портального тракта и вдоль афферентных кровеносных сосудов. У человека и у крысы основными механизмами восстановления внутрипечёночных желчных протоков после повреждения являются пролиферация холангиоцитов и ветвление протоков одновременно с ветвлением внутрипечёночных кровеносных сосудов.
Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе 17 статей в ведущих российских научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов научных исследований. Общий объём публикаций – 12,16 условно печатных листа, в т.ч. авторский вклад – 8,99 условно печатных листа.
Личное участие диссертанта. Приведённые в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, постановку задач, выбор методов исследования, проведение экспериментов, забор материала для исследования и его обработку, анализ экспериментальных данных. Автор провел подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения экспериментов, методы, позволяющие решить поставленные задачи. Теоретическое обобщение результатов исследования, их анализ и оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 364 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 511 источников: 33 отечественных и 478 иностранных. Диссертация содержит 136 рисунков и 4 таблицы.
