Введение к работе
Актуальность темы. Проблема опухолевого роста является предметом исследования специалистов многих отраслей науки, в том числе гистологии, молекулярной биологии, онкологии. Во всем мире регистрируется неуклонный рост заболеваемости даже в экономически развитых странах злокачественные опухоли занимают третье место в общей структуре смертности (Чиссов В.И. и др., 2011; Jemal A. et al., 2010). Среди ведущих методов лечения, наряду с хирургическим и лучевым, в клинической онкологии широко применяют цитотоксическую химиотерапию (Shewach D.S. et al., 2009; Nussbaumer S. et al., 2011). Лечебный эффект цитостатиков основан на их способности подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в опухолевых клетках (Kaufmann S.H. et al., 2000; Beauparlant P. et al., 2003; Lvborg H. et al., 2004; Meng X.W. et al., 2005; Nelius T. et al., 2011).
Разработаны препараты, характеризующиеся высокой противоопухолевой эффективностью в эксперименте, но не всегда обеспечивающие успешное лечение (Davidson A. et al., 1997; Yamauchi K. et al., 2008). Это связано с резистентностью опухолей к химиотерапевтическим агентам, низкой селективностью действия препаратов, а также побочными эффектами химиотерапии, наиболее выраженными при применении высоких доз цитостатиков (Thurston D.E. et al., 2007; Nelius T. et al., 2011).
При проведении химиотерапии организм испытывает воздействие факторов паранеопластической интоксикации и лекарственных препаратов. Печень как главный орган детоксикации осуществляет биотрансформацию и обезвреживание ксенобиотиков (Parkinson A. et al., 1996; Desmeules J. et al., 1999; Plaa G.L. et al., 2001), однако некоторые их метаболиты характеризуются еще большей токсичностью и наряду с антиопухолевым оказывают выраженный системный эффект (Thurston D.E. et al., 2007). Это требует продолжительных промежутков между курсами для восстановления быстрообновляющихся и других клеточных популяций организма (Kerbel R.S. et al., 2004).
Повреждение сосудов опухоли при введении цитотоксических препаратов происходит посредством различных механизмов (Hansen S.W. et al., 1990; Doll D.C. et al., 1992; Soultati A. et al., 2012). Данный подход базируется на следующих положениях: во-первых, дозы, необходимые для дезорганизации клеток эндотелия сосудов опухоли, гораздо ниже тех, которые необходимы для деградации трансформированных клеток (Belotti D. et al., 1996; Vacca A. et al., 1999). Во-вторых, химиотерапевтический препарат модифицирует функции эндотелиальных клеток, не вызывая их деструкции (Clements M.K. et al., 1999). Кроме того, в отличие от опухолевых клеток, эндотелиоциты не приобретают устойчивости к цитотоксическим агентам (Boehm T. et. al., 1997; Kerbel R.S. et al., 2004).
Интенсивный поиск путей преодоления негативного побочного действия цитостатиков привел к разработке новой стратегии терапии, основанной на их антиангиогенном действии при использовании в малых дозах (Miller K.D. et al., 2001). Одновременно с развитием целенаправленной терапии на опухолевый ангиогенез происходил поиск новых способов применения цитостатиков с целью снижения их токсичности и повышения эффективности. Одним из них стал метрономный режим химиотерапии, который позволяет контролировать развитие опухоли на продвинутых стадиях (Kerbel R.S. et al., 2004; Shiraga E. et al., 2008). Этот подход подразумевает предпочтительное ингибирование активности эндотелиальных клеток в растущем сосудистом русле опухоли. Таким образом, на применение цитостатиков в режиме метрономной терапии возлагают большие надежды и включают в схемы лечения ряда онкологических заболеваний в комбинации с другими методами противоопухолевой терапии (Nelius T. et al., 2011).
Для исследования механизмов опухолевого роста и разработки противоопухолевой терапии широко используют экспериментальные модели, например, карциносаркому Walker 256 (W256) (Rettori O. et al., 1995; Buffon A. et al., 2006; Perroud A.P.A.S., et al., 2006; Guimaraes F. et al., 2010). При этом недостаточно исследованы паренхиматозно-стромальные взаимоотношения в печени при карциносаркоме, в частности, эндотелиально-паренхиматозные, определяющие гематотканевый обмен в динамике спонтанного развития опухоли, а также при однократном корригирующем воздействии низкой дозы широко применяемого в клинике цитостатического препарата циклофосфана. Кроме того, не изучены стереотипные и специфические структурные реакции клеточных популяций печени в динамике альтерации и особенно регенерации в условиях системного опухолевого и низкодозового однократного цитостатического воздействия.
Цель исследования – изучить морфофункциональные изменения печени крыс Wistar при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и однократном воздействии низкой дозы циклофосфана.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительное ультраструктурное исследование клеточных популяций печени крыс Wistar в динамике спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 и в условиях однократного введения низкой дозы циклофосфана.
-
Изучить структурную плотность паренхиматозного и стромального компартментов печени экспериментальных животных в динамике спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 и в условиях однократного введения низкой дозы циклофосфана.
-
Изучить паренхиматозно-васкулярные взаимоотношения в печени и особенности ремоделирования кровеносного и лимфатического отделов микроциркуляции.
-
Оценить эффект однократной низкой дозы (25 мг/кг) циклофосфана на процессы метастазирования карциносаркомы Walker 256 в печени.
Научная новизна. Впервые с помощью электронно-микроскопического и морфометрического анализа исследованы структурные изменения паренхимы и стромы печени крыс-самцов Wistar при инокуляции карциносаркомы Walker 256 и однократном воздействии низкой дозы циклофосфана (25 мг/кг), что позволило выявить спектр стереотипных и специфических тканевых, клеточных и внутриклеточных изменений.
Впервые показано, что спонтанный рост опухоли Walker 256 у экспериментальных животных характеризуется резким увеличением ядерно-цитоплазматического соотношения гепатоцитов на 5-е сут с последующим снижением, достоверно превышая показатель контрольной группы. После введения циклофосфана максимальное уменьшение ядерно-цитоплазматического отношения гепатоцитов отмечено на 7-е сут, что обусловлено митотическим делением двуядерных гепатоцитов.
Впервые описаны ультраструктурные эквиваленты паранеопластического поражения печени в динамике спонтанного роста карциносаркомы Walker 256: нарушения биосинтетической, метаболической и желчевыводящей функции гепатоцитов, сопровождающиеся парциальной и тотальной цитодеструкцией; при этом показатели холестаза прямо коррелировали с опухолевой инфильтрацией печени и структурной плотностью метастазов.
Впервые получены динамические морфометрические показатели сосудистой системы печеночной дольки при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256: достоверное увеличение структурной плотности синусоидов на 65,23%, 72,31% и 51,69% на 5-е, 7-е и 14-е сут соответственно (р<0,05), обусловленное нарастающими обтурационными и тромботическими поражениями микрососудов с развитием геморрагий на 14-е сут эксперимента. Введение циклофосфана на 5-е сут в дозе 25 мг/кг тормозило опухолевую инвазию, уменьшало выраженность застойных явлений микроциркуляции с достоверным снижением объемной плотности синусоидов на 30% на 3-е (р<0,05) и на 27% на 7-е (р<0,05) сут после воздействия препарата с увеличением биосинтетической и пиноцитозной активности эндотелиоцитов на 3-и сут. К 14-м сут эффекты циклофосфана нивелировались.
Впервые сделан акцент на морфометрических показателях лимфатического компартмента печеночной дольки: установлено возрастание структурной плотности лимфатических пространств Малла, в наибольшей степени выраженное на 5-е сут (в 2 раза, р<0,05) роста карциносаркомы Walker 256, прямо коррелирующее с обтурационными изменениями сосудов портальных трактов и синусоидов. Временный корригирующий эффект циклофосфана зарегистрирован через 3-е сут: значимое уменьшение площади пространств Малла (на 49%, р<0,05).
Впервые представлены ультраструктурные маркеры компенсаторных и регенераторных реакций паренхимы на 3-и и 7-е сут после введения циклофосфана: комплексы внутриклеточной регенерации, индукция липолиза, гиперплазия элементов гладкой цитоплазматической сети, свидетельствующие об активации биосинтетической и дезинтоксикационной функциях гепатоцитов. Выявлены адаптивные перестройки цитолемм гепатоцитов в условиях токсического поражения печени: увеличение числа микроворсинок на синусоидальном и желчевыводящем полюсах гепатоцитов и формирование замыкательных пластинок на латеральных плазмалеммах.
В целом, на модели однократного введения низкой дозы цитостатика при развитии опухоли продемонстрирована ведущая роль внутриклеточной регенерации эндотелиальных клеток синусоидов для регенерации печени: индукция биосинтетической и пиноцитозной активности эндотелиоцитов опережала восстановление ультраструктуры гепатоцитов, что подчеркивает значимость васкулярно-паренхиматозных взаимодействий.
Теоретическая и практическая значимость. Проведено комплексное изучение структурных эквивалентов противоопухолевой активности низкой дозы циклофосфана в условиях системного опухолевого процесса с поражением печени с позиций клеточной биологии. Полученные данные продемонстрировали клеточные и ультраструктурные механизмы сочетанного опухолевого и низкодозового цитостатического воздействия на печень экспериментальных животных. Цитотоксический эффект опухолевого воздействия карциносаркомы Walker 256 модулируется цитостатическим эффектом циклофосфана, и в условиях торможения метастатической активности развивается транзиторная регенераторная реакция паренхимы – увеличение количества полиплоидных и двуядерных гепатоцитов. Кроме того, временный противоопухолевый эффект низкой дозы циклофосфана обладает цитопротекторным потенциалом и индуцирует метаболические и регенераторные процессы в клеточных популяциях паренхимы и стромы печени животных-опухоленосителей, что может иметь важное значение для дальнейших исследований с целью разработки схем противоопухолевой терапии.
Внедрение. Результаты исследования стромального и паренхиматозного компартмента печени при прогрессии опухоли и воздействия циклофосфана внедрены в курс лекций и практических занятий по общей патологической анатомии в разделах «Гепатиты», «Медикаментозные поражения печени», «Компенсаторно-приспособительные реакции». Результаты исследования динамики структурных преобразований в печени на фоне спонтанного развития опухолевого процесса внедрены на кафедре онкологии в курс лекций в разделе «Опухоли. Паранеопластический синдром» в ГБОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Министерства здравоохранения РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При инокуляции карциносаркомы Walker 256 крысам-самцам Wistar с помощью электронно-микроскопического и морфометрического анализа паренхимы и стромы печени продемонстрировано прогрессирующее нарушение биосинтетической, метаболической и желчевыводящей функции гепатоцитов с транзиторным увеличением ядерно-цитоплазматического соотношения. Структурная плотность междольковых желчных протоков может рассматриваться как маркер выраженности опухолевой инфильтрации печени.
-
Однократное воздействие низкой дозы циклофосфана (25 мг/кг) на 5-е сут спонтанного развития опухоли временно (в период 3 – 7-е сут после введения препарата) индуцировало биосинтетическую и пиноцитозную активность эндотелиоцитов, которая опережала внутриклеточную регенерацию гепатоцитов.
-
Однократное введение низкой дозы цитостатика при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 приводило к транзиторному ремоделированию кровеносной и лимфатической системы печеночной дольки; корригирующий эффект связан с дренажной функцией лимфатических пространств Малла.
Апробация работы. Результаты исследования представлены на выездной научной сессии, посвященной 80-летию С. У. Джумабаева (Узбекистан, 2008); 7-й научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2009); на Евразийском симпозиуме «Проблемы саногенного и патогенного эффектов эндо- и экзоэкологического воздействия на внутреннюю среду организма» (Бишкек, 2009); на VII международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2009); на 15-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2010); конференции врачей Татарстана (Казань, 2010); на V симпозиуме с международным участием «Проблемы адаптации человека к экологическим и социальным условиям Севера» (Сыктывкар, 2010); на IX российско-германской научно-практическом форуме им. Р.Коха и И.И.Мечникова (Новосибирск, 2010); на X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новогород, 2011); на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2011, 2012); на II Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2011); на международной научно-практической конференции «Научные исследования и их практическое применение. Современное состояние и пути развития ‘2011» (Одесса, 2011); Joint Meeting of the European Society for Microcirculation and the German Society of Microcirculation and Vascular Biology (Munich, 2011); на Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств» (Харьков, 2012); на 86-й Всероссийской студенческой научной конференции памяти академика АН РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 2012); на 18-й Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 2012), совместном заседании сотрудников кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии, кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии и центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета МЗ РФ.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 24 работы, из них 6 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов диссертаций, 1 статья в коллективной монографии и 17 статей в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 162 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 70 рисунками (диаграммы, микрофото- и электронограммы). Список цитированной литературы включает 388 источников.
