Содержание к диссертации
Введение
1 Получение аксеничных эксплантатов из талломов морских макрофитных водорослей 59
1.1. При помощи поверхностных стерилизующих агентоа 60
1.2. При помощи антибиотикоа 61
2. Культивирование эксплантатов морских макрофитных водорослей в аксеничных условиях. каллусный и вегетативный рост 66
3. Получение и исследование характеристик жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей, полученных механической мацерацией таллома 72
3.1. Получение жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей 73
3.2. Исследование характеристик жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей . 73
4. Получение клеточных суспензий и протопластов с помощью коммерческих ферментных препаратов и препаратов, выделенных из природных продуцентов 78
4.1. Получение ферментных комплексов из природных продуцентов.78
4.2. Получение клеточных суспензий и протопластов 82
Выводы 90
Литература 91
- При помощи антибиотикоа
- Получение и исследование характеристик жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей, полученных механической мацерацией таллома
- Исследование характеристик жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей
- Получение клеточных суспензий и протопластов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Культуры клеток и тканей растений являются удобным объектом для физиологических, генетических и биохимических исследований, а также источником ценных продуктов клеточного метаболизма (Бутенко, 1964; 1984). Исследования способов ведения культур тканей морских макрофитных водорослей, были начаты в 60-70 годы в Швеции и Японии (Fries, 1963; 1977; Nakamura, 1974; Saga et al., 1978; Chen, Taylor, 1978). У нас в стране это было начато в 1983 г. в группе проф. А.Х. Тамбиева. В перспективе это могло бы заменить добычу макрофитов и одновременно с выращиванием водорослей в хозяйствах марикультуры служить источником промышленно важных соединений водорослей, таких как агар, каррагинан, альгинаты и др.
В настоящее время показана возможность получения каллусных культур, аксеничного вегетативного роста, протопластов из ряда видов морских водорослей (Polne-Fuller, Gibor, 1984; Гусев, Тамбиев и др., 1984; Butler et al., 1989; Garcia-Reina et al., 1991; Mollet et al., 1995; Rusig et al., 2001), а также только двух суспензионных клеточных культур (Chen, 1989; Taitetal., 1990).
Однако исследования культур тканей морских макрофитных водорослей достаточно трудны, что связано с их гетерогенностью по морфологическим, физиологическим и биохимическим характеристикам, сложным жизненным циклам, недостатком знаний о механизмах роста, трудностью получения аксеничных культур и, как правило, их медленным ростом.
Возможно, что, учитывая происхождение макрофитных водорослей, правомерно проводить сопоставление их культур тканей с колониальными формами водорослей, где может наблюдаться лишь начальная
ди фференциация.
В настоящее время весьма важным является ведение и развитие культур тканей новых видов морских макрофитных водорослей с полезными для человека свойствами, а также оптимизация условий автономного культивирования их клеток и тканей с целью получения различных ценных продуктов.
Цель и задачи исследования. Основной целью нашей работы являлось исследование возможностей получения каллусного роста, жизнеспособных суспензий клеток и протопластов из талломов красных, бурых и зеленых морских макрофитных водорослей.
В соответствии с этим в работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Подбор условий стерилизации и получение аксеничного материала из талломов нескольких видов морских макрофитных водорослей.
Получение каллусного и вегетативного роста из эксплантатов водорослей в аксеничных условиях.
Подбор коммерческих ферментных препаратов для мацерации талломов водорослей.
Поиск и выделение природных продуцентов экзоферментов для разрушения специфических компонентов клеточных стенок водорослей.
Получение природных ферментных препаратов и изучение их ферментативных активностей.
Исследование эффективности воздействия коммерческих и природных ферментных препаратов на талломы морских макрофитных водорослей с целью получения жизнеспособных суспензий клеток и протопластов.
Изучение физиологических характеристик полученных в работе
суспензии клеток и протопластов исследуемых видов макрофитных водорослей.
Научная новизна работы. Выявлены индивидуальные комплексы антибиотиков, эффективные для получения аксеничных эксплантатов из талломов нескольких видов морских водорослей. Установлена возможность получения каллусного и вегетативного роста из эксплантатов тропической морской макрофитной красной водоросли - Botryocladia neushulii.
Показана возможность роста нескольких видов наземных грибов (21 штамма)- продуцентов экзоферментов на сухой биомассе морской красной водоросли В. neushulii
Исследована активность полученных в работе природных ферментных препаратов (из грибов и моллюска Littorina littorea) и их эффективность при разрушении клеточных стенок и межклетников красных водорослей. При помощи коммерческих и экспериментально подобранных ферментных препаратов получены жизнеспособные клеточные суспензии из талломов ряда видов морских макрофитных водорослей.
Получено значительное количество протопластов из талломов красных, бурых и зеленых макрофитных водорослей, некоторые из которых способны к регенерации клеточных стенок.
Практическое значение работы. Выявленные в работе комплексы антибиотиков могут быть использованы для получения аксеничных культур из ряда видов морских макрофитных водорослей.
Отработанные методики получения жизнеспособных клеточных суспензий и протопластов ряда видов красных, бурых и зеленых морских
макрофитных водорослей могут быть рекомендованы для использования на других представителях водорослей.
Получение каллусов, жизнеспособных клеточных суспензий и протопластов, способных к регенерации клеточных стенок, открывают перспективы перехода к суспензионным культурам морских макрофитных водорослей — автономным источникам ценных пищевых и лекарственных продуктов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференциях:
VIII Международная конференция и дискуссионный научный клуб:
«Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф, 6-
10 июня 2000 г.
Международная научная конференции «Автотрофные
микроорганизмы». Москва, 13-15 декабря 2000 г.
IX Международная конференция и дискуссионный научный клуб:
«Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф,, 1 -
10 июня 2001 г.
Международная научная конференция «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» Россия, Пущино Московской области, 29 октября - 2 ноября 2001 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
При помощи антибиотикоа
Наборы антибиотиков, эффективные для получения аксеничных культур водорослей, должны включать в себя агенты, подавляющие рост всего комплекса сопутствующей микрофлоры данной водоросли. С этой целью из талломов водорослей, растертых в гомогенизаторе и высеянных на поверхность питательного агара, были выделены в чистую культуру все обнаруженные бактериальные изоляты, если они отличались по цвету, форме или плотности колонии. Затем каждый из выделенных изолятов был проверен на чувствительность к набору антибиотических дисков (фото 1). Наборы антибиотиков, эффективные для получения аксеничных культур водорослей, должны включать в себя агенты, подавляющие рост всего комплекса сопутствующей микрофлоры данной водоросли.
С этой целью из талломов водорослей, растертых в гомогенизаторе и высеянных на поверхность питательного агара, были выделены в чистую культуру все обнаруженные бактериальные изоляты, если они отличались по цвету, форме или плотности колонии. Затем каждый из выделенных изолятов был проверен на чувствительность к набору антибиотических дисков (фото 1). При выделении сопутствующих бактерий оказалось существенным растирание водорослевых тканей в гомогенизаторе, что позволило выявить линии бактерий, обитающих глубоко внутри таллома. Эффективность различных антибиотиков по отношению к бактериальной микрофлоре тропической морской красной водоросли В. neushulii (с предварительной обработкой таллома бетадином и без обработки) представлена в таблицах 1, 2. При анализе данных по чувствительности микрофлоры к набору антибиотиков, проявились следующие закономерности: 1) Для достижения аксеничной культуры морской красных водорослей В. neushulii необходима двухступенчатая обработка таллома бетадином и строго индивидуальным набором антибиотиков. 2) Комплекс антибиотиков должен включать рифампицин или левомицетин, которые подавляют рост большинства бактериальных изолятов, и тетрациклин и эритромицин, которые ингибируют жизнедеятельность изолята 5 из таблицы 2 и изолята 3 из таблицы 1 соответственно. Фото 1. Чувствительность бактериального изолята 4 (таблица 2) из таллома
В. neushulii к набору антибиотиков: стрептомицин, левомицетин, пенициллин, эритромицин, тетрациклин, ампициллин, гентамицин, неомицин, рифампицин, фурадонин. Полученные данные согласуются с данными полученными ранее на беломорских красных водорослях Ahnfeltia plicata, Palmaria palmata и Phyllophora brodiaei, где наиболее эффективными оказались антибиотики левомицетин, тетрациклин и эритромицин. Поэтому комплекс из антибиотиков рифампицин, левомицетин, тетрациклин, эритромицин в комбинации с обработкой бетадином был в дальнейшем использован для получения аксеничного материала и из других исследованных в данной работе видов водорослей. После проверки на аксеничность в течение одного месяца около 90-95% эксплантатов сохраняли аксеничность и естественную пигментацию, при этом не было отмечено токсического действия использованных антибиотиков.
Преимуществом использования аксеничных культур тканей является возможность обеспечить строгий контроль за условиями их выращивания и питания, а также исключить влияние сопутствующей микрофлоры (Бутенко, 1964). Однако необходимо учитывать и тот факт, что нормальное развитие некоторых водорослей происходит только в присутствии эпифитных бактерий, а в аксеничных культурах формируются аномальные талломы с угнетенным ростом (Provasoli, Carlucci, 1974; Provasoli, Pintner, 1980; Tatewaki et al., 1983). По-видимому, это связано со способностью экзометаболитов эволюционно подобранных сопутствующих микроорганизмов являться стимуляторами роста и развития водорослей. В свою очередь, микроорганизмы могут использовать для своего роста экзометаболиты водорослей (Тамбиев и др., 1986). О возможности получения вегетативного роста и каллусных структур эксплантатов водорослей - макрофитов различных отделов сообщалось в ряде работ (Гусев с соавт., 1984, 1987; Тамбиев с соавт., 1984, 1996; Chen, Taylor, 1978; Fries, 1980, 1984; Saga et al. 1982; Polne et al. 1983; Polne-Fuller, Gibor 1984, 1987). Однако в настоящее время до конца не выявлены условия индукции и поддержания. В отличие от высших растений (Бутенко, 1964), у макрофитных водорослей не доказано непосредственное участие ростовых веществ в каллусогенезе (Garsia-Reina et al., 1991). В нашей работе изучалось влияние различной температуры и плотности фотонного потока на частоту образования каллуса и і вегетативного роста из эксплантатов красной морской водоросли В. neushulii. Эксплантаты инкубировались на чашках Петри (Фото 2) на ага-ризованной среде PES и в колбах объемом 750мл, при этом изучали влияние степени перемешивания жидкой среды (частота вращения 50 об/мин, температура 25 С, плотность фотонного потока 40мкмоль фотонов м" с" ). Рост каллуса индуцировался после 2 недель выращивания в культуре на агаризованной среде. Эксплантаты находились в температурном диапазоне 15-25С, но образование каллуса происходило только при 20С.
Эта температура и низкая плотность фотонного потока 10 мкмоль фотонов м с" являлись наиболее благоприятными для индукции каллуса (Фото 4-6). Каллус образовывался из коровых клеток раневой поверхности и был пигментированным, розоватого цвета. После 2 месяцев инкубации в культуре каллус имел размер 2-Змм. Каллусные клетки были эллипсоидальной или сферической формы. Температура 15 С не приводила к образованию каллуса, при этом большая часть эксплантатов погибала (70 %), а оставшаяся часть образовывала слабый вегетативный рост спустя 4-6 недель культивирования. В естественных условиях водоросль В. neushulii растет в тропических широтах. По-видимому, этим и объясняется плохой вегетативный и каллусный рост при низкой для этого вида водоросли температуре, в отличие, например, от видов водорослей из Белого моря (Тамбиев, Николаева, 1996). Наиболее высокий уровень вегетативного роста аксеничных эксплантатов наблюдался при 25С и плотности фотонного потока 40 мкмоль фотонов м с", как на жидкой, так и на агаризованной среде PES (Фото 2) и составлял 90% от общего количества эксплантатов. Сначала происходило образование небольших округлых клеток на раневой поверхности в области медуллярных клеток с последующим увеличением количества нарастающих клеток в центре. Эти клетки, видимо, можно считать каллусными, т.к. они были похожи на клетки, выросшие из коровых клеток и образовавшие каллусную ткань (Фото 3). Они были так же пигментированными. Затем довольно быстро, в течение 3-х недель происходило превращение этих клеток в проросток, который всегда прорастал, образуя поплавок. После формирования на проростке поплавка его рост шел быстрее и, спустя 4-5 недель его длина составляла 1-1,5см. Следует отметить, что такой вегетативный рост происходил из центра раневой поверхности и затрагивал только медуллярную ткань (Фото 9). Такой вегетативный рост наблюдался только в частях эксплантата, близких к апикальному концу. И в случае помещения разветвленного аксеничного эксплантата на питательную среду PES происходило формирование проростков на двух концах этого эксплантата.
Получение и исследование характеристик жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей, полученных механической мацерацией таллома
В настоящее время имеется значительный интерес к суспензионным культурам, которые могут быть получены из тканей макрофитных водорослей, в том числе промышленно важных, поскольку клетки таких культур могут экскретировать полезные вещества в среду.Суспензионные культуры клеток морских макрофитных водорослей открывают ряд чрезвычайно интересных возможностей. Помимо длительно существующего источника клеток для различных исследований, они могли бы заменить споры в коммерческой аквакультуре, особенно для таких видов, которые не формируют вегетативных моноспор, а, кроме того, крупномасштабные клеточные культуры можно было бы развивать для получения биомассы и специфических промышленно важных соединений макрофитных водорослей.
В обзоре литературы нами были перечислены три подхода к получению клеточных суспензионных культур морских макрофитных водорослей. Однако каждое из этих направлений имеет ряд трудностей. Обычным способом получения культур клеток высших растений является перенос в жидкую среду рыхлой или растертой каллусной ткани, выращиваемой на агаре (Бутенко, 1977).Однако невысокая частота каллусогенеза и низкая скорость роста каллусов макрофитных водорослей, отмеченные в нашей и других работах (Polne-Fuller, Gibor, 1984; 1987а; Гусев, Тамбиев и др. 1984) не позволяют в настоящее время реализацию этого направления.
Сложность мацерации талломов морских макрофитов заключалась в большом разнообразии и непостоянстве состава полисахаридов клеточных стенок и межклеточного матрикса (Усов, 1985), а также в отсутствии высокоэффективных коммерческих ферментных препаратов, разрушающих эти полисахариды (Gomez-Pinchetti, Garcia-Reina, 1993), что приводит к необходимости индивидуального подбора средств для мацерации талломов водоросли. Клеточные суспензии зеленых морских макрофитных водорослей Caulerpa prolifera и Caulerpa mexicana получали механическим растиранием водорослей в обычных условиях в морской воде с последующим фильтрованием через нейлоновые сетки. Благодаря тому, что данные водоросли имели поверхностные коровые клетки малого размера, в отличие от других исследованных нами макрофитов, и эти клетки не разрушались при механическом воздействии на таллом нам удалось получить клеточные суспензии данных водорослей. При этом медуллярные клетки разрушались. В дальнейшем, при фильтровании были получены клеточные суспензии, состоящие из одиночных коровых клеток, сохранивших клеточную стенку. способность клеток в суспензиях к делениям является их физиологическое состояние, которое согласно литературным данным, для некоторых объектов (бактерии, микро- и макроводоросли) можно оценить по изменению реакционной способности среды, определяемой выделяемыми клетками экзометаболитов (Тамбиев, 1984).
В данной работе исследовалась реакционная способность (PC) питательной среды, содержащей, как нативные экзометаболиты, так и внеклеточные продукты, поступающие в среду после лизиса клеток, как показатель физиологического состояния эксплантатов таллома и клеточных суспензий морской макрофитной зеленой водоросли С. prolifera. Инкубацию полученных клеток и эксплантатов таллома проводили в искусственной морской воде и в дистиллированной воде. Одновременно с определением PC среды в суспензии определяли количество живых и мертвых клеток на продолжении инкубации в течение 7 суток.
Было показано, что PC среды, как эксплантатов таллома, так и среды с суспензией клеток изменялась в процессе инкубации в искусственной морской воде (рис. 10). Через 1,5 часа инкубации в обоих вариантах наблюдалась выраженная окислительная активность (ОА) соответственно 115% и 128% по отношению к контролю. Через сутки значения PC среды переходят в антиокислительную активность (АОА), соответственно 85% и 80%, а через двое суток инкубации PC в опыте с эксплантатами таллома возвращалась к ОА (110%). PC среды суспензии клеток сохраняла АОА (94%), при этом живые клетки составляли 30-35% от их количества. При инкубации тех же проб в дистиллированной воде в течение двух суток наблюдалась выраженная ОА, более выраженная у таллома через сутки и сравнивающаяся по величине с АО суспензии клеток на вторые сутки.
Исследование характеристик жизнеспособных клеточных суспензий морских макрофитных водорослей
Было показано, что PC среды, как эксплантатов таллома, так и среды с суспензией клеток изменялась в процессе инкубации в искусственной морской воде (рис. 10). Через 1,5 часа инкубации в обоих вариантах наблюдалась выраженная окислительная активность (ОА) соответственно 115% и 128% по отношению к контролю. Через сутки значения PC среды переходят в антиокислительную активность (АОА), соответственно 85% и 80%, а через двое суток инкубации PC в опыте с эксплантатами таллома возвращалась к ОА (110%). PC среды суспензии клеток сохраняла АОА (94%), при этом живые клетки составляли 30-35% от их количества. При инкубации тех же проб в дистиллированной воде в течение двух суток наблюдалась выраженная ОА, более выраженная у таллома через сутки и сравнивающаяся по величине с АО суспензии клеток на вторые сутки. Л ОА%
Рис. 10. Реакционная способность среды эксплантатов таллома (I) и среды с суспензией клеток (II) морской макрофитной водоросли С. prolifera Известно, что нативные экзометаболиты морских водорослей, в том числе макрофитных, обладают в норме выраженной ОА, которая снижается при возникновении неблагоприятных условий культивирования (Тамбиев, 1984). При инкубации эксплантатов таллома и суспензии, полученных из клеток таллома в искусственной морской воде в течение первых суток падение ОА и переход в АОА можно, видимо, объяснить известным в литературе "культуральным шоком", наступающим при резком изменении условий инкубации. На вторые сутки, как видно на рис. 10, эксплантаты таллома выходят из этого состояния, о чем свидетельствует появление ОА питательной среды таллома, что нельзя сказать в случае суспензии клеток, где сохраняется АОА среды и находится около 70% живых клеток.
В дистиллированной воде "культуральный шок" наблюдается лишь в первые сутки в среде с эксплантатами таллома и не наблюдается в случае суспензии клеток, где происходит падение ОА с переходом в АОА в течение двух суток, сопровождающееся уменьшением количества живых клеток, что наблюдалось ранее у других видов водорослей.
Таким образом, с помощью измерения PC среды можно определить физиологическое состояние - наступление и прохождение "культурального шока" как у эксплантатов таллома, так и у полученных из него клеточных суспензий.Нами были предприняты попытки выявить регулирующее действие физических факторов — миллиметровых волн низкой, не тепловой интенсивности (КВЧ - излучения) на процесс перевода дифференцированного многоклеточного таллома водорослей в состояние недифференцированных каллусов или на повышение жизнеспособности суспензий одиночных клеток и протопластов, полученных мацерацией таллома.
Действие КВЧ - излучения проверяли на аксеничных эксплантатах и суспензиях клеток Черноморских макрофитных водорослей.С целью выявления оптимального времени воздействия проводили облучение при длине волны 8,34 мм и падающей мощностью 2,2 мВт/см2 эксплантатов и суспензий в течение 10, 20, 30, 40, 45 и 60 минут. После 20 минут облучения (оптимальное время) длительный период сохранялась пигментация эксплантатов, а также было отмечено их набухание и усиление их вегетативного роста по сравнению с необлученными.
Трехкратное облучение суспензии клеток макрофитной водоросли Phyllophora nervosa вызывало изменение PC выделяемых соединений — подъем окислительной активности экзометаболитов, что было более выражено при времени облучения 60 минут. При этом также уменьшалось время индукции окисления ДОФА, что свидетельствовало о повышении жизнеспособности клеток после облучения. Таким образом, реакционная способность выделяемых экзометаболитов может также служить удобным, быстро определяемым физиологическим критерием стимулирующего действия КВЧ — излучения. эксплантатами таллома возвращалась к ОА (110%). PC среды суспензии клеток сохраняла АОА (94%), при этом живые клетки составляли 30-35% от их количества. При инкубации тех же проб в дистиллированной воде в течение двух суток наблюдалась выраженная ОА, более выраженная у таллома через сутки и сравнивающаяся по величине с АО суспензии клеток на вторые сутки. Л ОА%Рис. 10. Реакционная способность среды эксплантатов таллома (I) и среды с суспензией клеток (II) морской макрофитной водоросли С. prolifera Известно, что нативные экзометаболиты морских водорослей, в том числе макрофитных, обладают в норме выраженной ОА, которая снижается при возникновении неблагоприятных условий культивирования (Тамбиев, 1984). При инкубации эксплантатов
Получение клеточных суспензий и протопластов
Из обзора литературы следует, что обработка фрагментов талломов морских водорослей комплексами ферментных препаратов может привести к получению суспензий клеток (Polne-Fuller, Gibor, 1984; Chen, 1986; Tait et al., 1990) в том случае, если разрушается только межклеточный матрикс, и протопластов (Saga et al., 1986; Chen, 1987; 1989) - при дополнительной деградации клеточных стенок. Ферментные комплексы, выделенные нами из природных продуцентов, а также коммерческие ферментные препараты совместно с выделенными препаратами применяли для получения клеточной суспензии из морской макрофитной водоросли В. neushulii. Применение только коммерческих препаратов (целлюлазы, пектиназы, дрезилазы, ксиланазы) в различных комбинациях и концентрациях не приводило к получению клеточной суспензии. При обработке частей талломов морской водоросли В. neushulii полученными в работе ферментными препаратами из микро- и макромицетов, приспособленными к росту на сухой биомассе данной водоросли, происходило их размягчение. При последующим растирании этих частей в ручном гомогенизаторе было получено небольшое количество одиночных медуллярных клеток этой водоросли. Также были получены довольно крупные агрегаты коровых клеток.
Возможно, это связано с индивидуальными физиологическими особенностями исследуемой водоросли, а также с недостаточно изученными условиями ферментной обработки. Подобные данные были получены на исследованных ранее в нашей лаборатории талломах флоридеевых водорослей Phyllophora nervosa, Palmaria palmata, Odonthalia dentata. В этом случае мацерация сопровождалась частичной или, как правило, с небольшой частотой, полной деградацией клеточных стенок медуллярных клеток, выполняющих в талломах запасающую функцию, тогда как довольно толстые клеточные стенки защитных коровых клеток не были разрушены ни при каких условиях. В литературе есть сведения (Gross, 1990) о неудачных попытках мацерации таллома флоридеевых водорослей родов Neoptilota, Iridaea, Polisifonia и других, несмотря на использование сложных ферментных комплексов. В нашем случае, лучшие результаты были получены при применении совместно с ферментными препаратами из микро- и макромицетов коммерческих ферментных препаратов. При этом увеличивался выход одиночных медуллярных клеток. Полученные клеточные суспензии В. neushulii состояли из небольшого числа бесцветных медуллярных клеток с деградирующими клеточными стенками и агрегатов пигментированных коровых клеток.
Дальнейшее культивирование клеточной суспензии в течение 2-х дней приводило к снижению числа живых клеток, при этом исчезала их пигментация. Вероятно, это связано с тем, что протеазы, оксидазы и нуклеазы, обычно присутствующие в составе подобных комплексных препаратов, способны вызывать повреждения и гибель клеток водорослей (Butler et al., 1990). Несомненно, что предварительная очистка ферментных препаратов от подобных компонентов, либо добавление в литическую смесь ингибиторов протеаз, положительно окажется на увеличении выхода и жизнеспособности клеток и протопластов в процессе мацерации талломов морских водорослей. Нами был экспериментально установлен осмотический режим, при котором начиналось сжатие протопласта внутри клеточной стенки у исследованных видов морских макрофитных водорослей. В ходе работы с помощью коммерческих и природных ферментных препаратов были получены протопласты из талломов зеленых, бурой и красной морских макрофитных водорослей (таблица 4). Время обработки ферментными препаратами варьировало в зависимости от вида водоросли и составляло 2-6 часов. Использование коммерческого ферментного препарата абалон, выделенного из моллюска Abalone entralis, показало его положительное действие во многих случаях. Использование ферментных комплексов из микро- и макромицетов не приводило в нашей работе к выделению протопластов из исследованных нами видов водорослей - макрофитов.
Нами были подтверждены данные (Polne-Fuller, Gibor, 1990; Waaland et al., 1990) о влиянии зоны таллома водоросли на степень мацерации. Наибольшее количество протопластов и наименьшее время их выхода из ткани наблюдалось у молодых талломов водорослей, а также в верхней части веточек талломов — зоне активного роста, где активно делящиеся клетки погружены в относительно тонкий слой матрикса, составляющий межклетники. Клетки же базальной части таллома, близкой к подошве, экстрацеллюлярный матрикс которых, пронизан полисахаридными нитями, оставались связанными этими нитями даже при длительной ферментативной обработке. Так же, выход клеток из больших фрагментов таллома происходил труднее. В ходе ферментативной обработки клетки округлялись по мере разрушения клеточных стенок и высвобождались из межклеточного матрикса, но некоторые так и оставались в нем, в этом случае требовалось перемешивание и небольшое механическое воздействие на таллом, тогда они выходили в среду (Фото 12).
