Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы разработке методов искусственного получения перламутра, с использованием мантийной ткани двустворчатых моллюсков посвящено множество работ. Работы по использованию культуры ткани мантии проводятся на пресноводных и преимущественно на морских моллюсках (Bank S.K., et al., 2004).
В России имеются огромные запасы пресноводных перламутробразующих раковин, в основном, двух родов, Anodonta и Unio. Они распространены в реках, практически по всей территории России, от Европейской части до Дальнего Востока. Anodonta и Unio образуют хороший перламутровый слой, что допускает возможность получения его при помощи культуры ткани мантии.
Перламутр является сложным биоорганическим комплексом, основу минеральной части которого составляет арагонит - разновидность карбоната кальция. Белковая часть, представлена структурными и энзиматическими белками, составляющими органический белковый матрикс.
Перламутр, на сегодняшний день, является одним из наиболее перспективных материалов, для реконструктивной медицины и ортопедии. Свойства перламутра в целом и отдельных его белковых и минеральных компонентов исследуются не только in vitro (Moutahir-Belqasmi F., et al., 2001), но и на животных моделях. На основании экспериментальных данных были сделаны заключения, о способности перламутра двустворчатых моллюсков и его частных компонентов способствовать регенерации костной ткани (Lamghari М., et al., 1999).
Натуральные раковины моллюсков, являются идеальной основой для тканевой инженерии с целью обеспечения структурного микроокружения, аналогичного кости, обладающей необходимой архитектоникой для инвазии клеток кости, васкуляризации и ангиогенеза. Перламутр может применяться как ортопедический наполнитель (Delattre О., et al., 1997), обладая остеоиндуктивным потенциалом, связанным с его структурными свойствами (Green D., et al, 2002).
Перламутр способен не только инициировать образование новой костной ткани, но и направлять клеточную дифференцировку по заданному пути. К такому выводу пришли, изучив превращение адипогенного (преадипоциты) в остеогенный (остеобласты) клеточный фенотип, используя трехмерную биоматрицу с СаСОз, морских губок (Porites luted). Была показана дифференцировка клеточной линии преадипоцитов (3T3F442A) в клетки, способные формировать кость, растущие на биоматриксе, без добавления каких либо индукторов морфогенеза кости. Это указывает на то, что кристаллическая биоматрица частично обладает трехмерной топологией или поверхностными параметрами, обеспечивающими быструю клеточную адгезию, пролиферацию и дифференцировку преадипоцитов по остеогенному фенотипу (Ruth Z. Birk, et al., 2006).
Таким образом, актуальным представляется изучение в рамках одной работы вопросов, связанных как с получением культуры ткани мантии, так и с проблемой образования полноценного перламутра in vitro. Подобное исследование может не только углубить теоретическое представление о процессе формирования перламутра, но и будет способствовать получению перламутра в комплексе с функционально активными белковыми компонентами, как материала обладающего остеоиндуктивными свойствами с целью реконструкции костной ткани.
Целью настоящей работы явилось получение культуры ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков с сохранением их секреторной активности.
Исходя из цели исследования, были сформулированы следующие конкретные задачи:
-
Получить функционально активную культура ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков родов Anodonta и Unio.
-
Оптимизировать качественный состав питательной среды для обеспечения успешного процесса кристаллизации перламутра и его основного структурного компонента арагонита.
"і
-
Индуцировать и форсировать процесс кристаллизации арагонита, в культуре ткани и эпителиальных клеток мантии.
-
Изучить этапы процесса образования перламутра in vitro.
-
Изучить типы кристаллизации арагонита in vitro.
-
При помощи рентгеноструктурного и рентгеноспектрального анализов подтвердить получение в культуре ткани мантии моллюска арагонита и перламутра, идентичного природному.
Научная новизна. Впервые в России разработана отечественная технология культивирования ткани мантии моллюсков, позволяющая получать перламутр.
Впервые в мировой практике были использованы моллюски двух родов Unio и Anodonta, для культивирования перламутра in vitro.
Оптимизированы методики подготовки и культивирования тканей мантии непосредственно для пресноводных моллюсков, с целью получения длительной культуры ткани.
Питательная среда дополнена компонентами, позволяющими не только сохранять жизнеспособность ткани мантии, но и инициировать процесс образования арагонита, как основного минерального компонента перламутра.
Разработана уникальная методика приготовления белковых мембран из экстрапаллиальной жидкости моллюсков, позволяющая интенсифицировать процесс образования арагонита и перламутра в культуре ткани мантии.
Получены данные об этапах образования многослойного перламутра in vitro. При этом получены сведения о возможности побочной кристаллизации арагонита в виде игольчатой или альвеолярной форм.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты имеют большое значение для понимания механизма кристаллизации арагонита в культуре ткани мантии пресноводных моллюсков.
Результаты исследований, показывающие, что в культуре ткани возможно получение перламутра, идентичного природному, имеют практическое значение для идентификации и получения белков органического матрикса перламутра, обладающих регуляторными и остеоиндуктивными свойствами.
Данные о форсировании образования арагонита и перламутра за счет применения уникальных белковых мембран на основе экстрапаллиальной жидкости моллюсков, помогут эффективнее получать культуру ткани мантии моллюсков.
Представляется особенно перспективным применение перламутра или его водорастворимой белковой фракции, для изучения воздействия на культуры клеток, в частности, остеобластов и остеоцитов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры клеточной биологии и технологий медико-биологического факультета и Медицинского центра Российского государственного медицинского университета в 2008 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы в отечественных изданиях, поданы две патентные заявки.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список цитированной литературы, включающий 122 источника (11 отечественных, 111 зарубежных). Работа иллюстрирована 42 рисунками и 4 таблицами.
