Введение к работе
Актуальность темы. В современной медицинской практике при различных дефектах соединительной ткани используется введение восполняющих объём препаратов. К таким дефектам соединительной ткани, нуждающимся в коррекции, относятся дегенеративные заболевания кожи и собственно соединительной ткани, врождённые заболевания мочевыводящих путей, стрессовое недержание мочи и ряд других заболеваний.
Так, например, для коррекции стрессового недержания мочи у женщин разработано более 200 терапевтических и хирургических подходов [Пушкарь Д.Ю., 1996]. Методом выбора являются слинговые (петлевые) операции [Кулаков В.И., 2000]. Однако при использовании минимально инвазивных слинговых методик, их эффективность не достаточна, также лечение может сопровождаться осложнениями в виде пролежней и/или прорезания в просвет уретры синтетической ленты, что требует разработки принципиально новых подходов.
Наиболее эффективными для коррекции дефектов соединительной ткани являются методы, основанные на введении препаратов, создающих в области трансплантации дополнительный объём и направленные на достижение равновесного давления между мочевым пузырем и уретрой. Преимущества данного подхода заключаются в том, что пара- или периуретрально вводятся различные биоматериалы, которые образуют дополнительный искусственный неконтролируемый сфинктер, увеличивающий парциальное давление в просвете уретры [Pickard R., 2003], что также является конечной целью и при использовании слинговых операций.
В связи с тем, что создание такого препарата основано на способности организма реагировать на инородное тело, особые требования предъявляются к физико-химическим свойствам компонентов, входящих в его состав. Для создания продолжительного эффекта компоненты должны быть нетоксичными,
длительное время сохраняться в области введения и не мигрировать в окружающие ткани.
В ряде работ показано, что использование клеточных суспензий (мультипотентных стромальных клеток) дает положительный эффект при введении в парауретральную область, который заключается во временной ремиссии клинических проявлений стрессового недержании мочи [Carr L.K., 2008; Mitterberger М, 2007]. Однако введение неприкрепленных клеток сопровождается их диффузной миграцией в окружающие ткани и массовой гибелью из-за стрессового воздействия изменений окружающей среды, в связи с чем данный эффект является непродолжительным. Поэтому перед исследователями стоит задача создать такой препарат, -который был бы лишен этих недостатков. Данный препарат должен быть способным к восполнению собственного объёма, и замещать дефицит соединительной ткани. В связи с этим была поставлена задача создания тканеинженерной конструкции, которая включает клеточную культуру, способную восполнять объём соединительной ткани. При этом матрица-носитель должна обеспечивать сохранность клеток при малоинвазивном (инъекционном) способе введения, а также фиксировать клетки в месте введения.
При выборе оптимального носителя тканеинженерной конструкции были исключены многие синтетические препараты, из-за их неспособности к биодеградации, токсичности и неконтролируемым миграционным свойствам [Roques С, 2009; Fano V., 2007; Goldberg М., 2008]. Использование препаратов на основе полиэстеров органических кислот ограничено из-за невозможности создания инъекционной формы [Peter S.J., 1997]. Гели на основе коллагена и гиалуроновой кислоты не являются полностью биологически инертными и могут вызывать аллергические реакции [Hirsch R.J., 2008].
В качестве носителя тканеинженерной конструкции предложено
использовать желатиновую губку. Желатин является продуктом денатурации
коллагена, и поэтому, обладая всеми свойствами, характерными для коллагена,
является невидоспецифичным, полностью инертным материалом, нашедшим
широкое применение в медицине. Ряд авторов считает, что препараты на основе желатина являются оптимальными для создания биогелей и конструкций на их основе [Hsu S.H., 2007; Sung HW, 1999].
Выбор стромальной фракции жировой ткани в качестве клеточного -компонента тканеинженерной конструкции был основан на соответствии культуры определенным параметрам. Благодаря малой травматичности забора первичного материала, получают именно аутологичную клеточную культуру. По данным литературы данная культура характеризуется высокой пролиферативной активностью и активным синтезом внеклеточного матрикса [Wang H.J., 2004]. При этом ряд авторов утверждает, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные именно из жировой ткани, обладают более выраженной способностью образовывать коллаген, при сравнении с клеточными культурами из других источников [Wagner W., 2005; Shvetsova E.V., 2008]. Однако, в современной литературе отсутствует описание морфологических изменений, которые развиваются при введении тканеинженерных конструкций на основе мультипотентных стромальных клеток фракции жировой ткани и желатиновой матрицы-носителя в область собственно соединительной ткани.
В свете приведенных положений, разрабатываемая проблема является актуальной, представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что определяет актуальность данного экспериментального исследования.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение морфологических изменений в парауретральной области при введении тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и желатиновой матрицы-носителя.
Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:
1. Разработать тканеинженерную конструкцию (комбинированный трансплантат) на основе мультипотентных стромальных клеток фракции жировой ткани и желатиновой матрицы-носителя;
Изучить морфологические изменения в парауретральной области при введении тканеинженерной конструкции на основе аутологичной клеточной культуры мультипотнетных стромальных клеток жировой ткани;
Изучить морфологические изменения в парауретральной области при введении тканеинженерной конструкции на основе аллогенной клеточной культуры мультипотентных стромальных клеток жировой ткани;
Изучить морфологические изменения в парауретральной области при введении тканеинженерной конструкции на основе девитализированной клеточной культуры стромальных клеток жировой ткани и при введении только желатинового матрикса конструкции без клеточного компонента.
Научная новизна работы. Впервые дана сравнительная структурная характеристика реакции соединительной ткани на введение инъекционной формы тканеинженерной конструкции на основе клеточной культуры стромальных клеток жировой ткани. Разработана оригинальная инъекционная форма тканеинженерной конструкции, содержащая желатиновую губку и клеточную культуру мультипотентных стромальных клеток жировой ткани, характеризующуюся высокой пролиферативной активностью. Впервые изучены морфологические изменения при парауретральном введении тканеинженерной конструкции в область представленную собственно соединительной тканью.
Парауретральное введение тканеинженерной конструкции, содержащей клеточную культуру стромальной фракции жировой ткани и желатиновую губку, в качестве носителя, сопровождается активным образованием соединительной ткани, что позволяет длительное время сохранять заданный объём. Сохранение массы образованной соединительной ткани конструкции обеспечивается функционированием трансплантированной культуры стромальных клеток жировой ткани. Трансплантация носителя или носителя с девитализированной клеточной культурой неэффективна и не приводит к выраженному образованию соединительной ткани и коллагеновых волокон.
Начальная стадия формирования соединительной ткани одинакова во
всех группах и характеризуется преобладанием клеточного компонента в
основных группах наблюдения. По мере удлинения срока эксперимента при использовании тканеинженерных конструкций, содержащих клеточные культуры, как аллогенные, так и аутологичные, отмечается увеличение объёма соединительной ткани, по сравнению с его деградацией в контрольных группах.
Иммуногистохимическое исследование выявило сохранение витальной метки Green fluorescent protein (GFP) на всех сроках эксперимента, что свидетельствует о длительном выживании трансплантированных клеточных культур.
Трансплантация тканеинженерной конструкции, содержащей аутологичную культуру стромальной фракции жировой ткани, вызывает наиболее быструю деградацию матрикса и образование максимального количества коллагена даже на ранних сроках эксперимента и является максимально эффективной.
Научно-практическая значимость работы. На основе изучения морфологических изменений соединительной ткани парауретральной области после введения тканеинженерной конструкции показано, что при использовании тканеинженерной конструкции, содержащей живые аутологичные клеточные культуры стромальной фракции жировой ткани, происходит формирование наибольшего количества коллагеновых волокон в области введения, при этом отмечена прямая корреляция между наличием трансплантированных клеток, количеством фибробластов и фиброцитов в области введения и площадью образованных коллагеновых волокон. Сравнительное исследование ТИК, содержащей девитализированные клеточные культуры показало незначительное образование коллагена в области введения, статистически значимо не отличающееся от группы, в которой вводился только матрикс без клеточной культуры. Полученные данные открывают перспективы для разработки методов коррекции дефектов собственно соединительной ткани при ряде патологических состояний. Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на
Первом международный конгресс по репродуктивной медицине "Проблемы
репродукции, Конференции в РГМУ (Москва, 2006); Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении" (Москва, 2007); Британско-российском совещании в сотрудничестве с Европейской Комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества» (Москва, 2007); XX юбилейном международном конгрессе с курсом эндоскопии "Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний" (Москва, 2007); Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования (Москва, 2009); межлабораторной конференции в Учреждении РАМН НИИ морфологии человека РАМН (май, 2009). Внедрение полученных результатов. Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Московского государственного медико-стоматологического университета.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получен патент на изобретение. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 122 страницах и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 59 рисунками. Указатель цитируемой литературы включает 86 источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Выделение культуры мулыпипотенных стромальных клеток жировой ткани
Выделение клеточной культуры стромальной фракции жировой ткани
проводили по методике, разработанной Mitchell J.B. et al [Mitchell J.B., 2006].
Материал (подкожную жировую ткань крыс) помещали в стерильные пробирки,
содержащие транспортную среду (F12 с амикацином, 0,5 г/л) и доставляли в культуральную лабораторию в течение одного часа после забора. Всю работу с материалом проводили в стерильных условиях в ламинарном шкафу II класса защиты.
Кусочки ткани переносили в чашку Петри, максимально тщательно очищали от кровеносных сосудов и промывали раствором Хэнкса с цефазолином (1 г/л) 3-4 раза. Отобранный материал переносили в другую чашку Петри, также заполненную раствором Хэнкса с цефазолином, где его измельчали при помощи ножниц. Далее гомогенизированную ткань переносили пипеткой в 15 мл центрифужную пробирку, аккуратно отбирали раствор Хэнкса и заливали материал раствором Версена и 0,25% раствором трипсина в соотношении 1:1 так, чтобы материал был весь покрыт ферментами. Пробирки помещали в СОг-инкубатор (37С, 5% СОг) на 1,5-2 часа. Каждые 15 минут содержимое пробирки встряхивали при помощи вортекса.
После инкубирования в пробирку доливали раствор Хэнкса или культуральную среду для уменьшения концентрации ферментов и осаждали клетки центрифугированием (1100 об/мин, 10 мин). Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в культуральной среде (DMEM/F12 1:1с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки до 10%, L-глутамина (584 мг/л), антибиотика (амикацин-500 мг/л) и переносили в культуральную посуду. Прикрепление клеток к подложке наблюдали через 12-24 часа.
После отмывания неприкрепленных клеток культура была достаточно однородной, представлена преимущественно вытянутыми веретеновидными малоотросчатыми фибробластоподобными клетками до 15-17 микрон в длину, с центральным расположением ядра и небольшим количеством гранул в цитоплазме. Трансфекция культуры клеток маркерным геном Green Fluorescent Protein
Для трансфекции клеток маркерным геном Green Fluorescent Protein
(GFP) использовали конструкцию на основе аденовируса (AD-5 EGFP),
любезно предоставленную д.б.н. Народицким Б.С, руководителем лаборатории
молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи.
Для определения рабочего разведения вируса клетки рассаживали на 6-луночную плашку и инкубировали в среде с разным содержанием трансфицирующего агента. Оптимальное разведение определяли по эффективности трансфекции и отсутствию цитотоксического эффекта.
За двое суток до трансплантации клетки, достигшие монослоя, отмывали от сыворотки, добавляли бессывороточную среду с подобранной концентрацией вируса и инкубировали в течение 2,5-3 часов при 37С. После инкубирования клетки повторно отмывали и добавляли поддерживающую среду (с пониженным до 1% содержанием сыворотки).
Эффективность трансфекции оценивали визуально. Начало зеленого свечения детектировали через 24 часа после трансфекции. Девитализация культуры клеток
Необходимое количество клеток суспендировали в физиологическом растворе и переносили в криопробирку, которую помещали в жидкий азот (без добавления криопротекторов и соблюдения этапов замораживания). После замораживания суспензии пробирку помещали в горячую воду (90С) до полного оттаивания. Процедуру повторяли 3 раза. Витальность клеток исключалась окрашиванием 0,4% трипановым синим. Гибель клеток также подтверждали неспособностью прикрепления к культуральному пластику в течение 48 часов после помещения их в стандартные культуральные условия. Постановка экспериментального исследования
В работе использовали самок крыс Вистар, массой тела 250-300 г (питомник «Столбовая»). При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии Учреждения РАМН НИИ морфологии человека РАМН (протокол №4 оті2 марта 2007 г.).
Были сформированы четыре группы наблюдения: основная, в которой животным вводили конструкцию, содержащую измельченную желатиновую губку и аутогенную (АУ) клеточную культуру стромальной фракции жировой ткани; сравнения, в которой были использованы измельченная желатиновая губка и аллогенная (АЛ) клеточная культура; и две контрольных группы. В первой контрольной группе проводилось введение животным только матрикса (М) тканеинженерной конструкции, а во второй контрольной группе— введение измельченной желатиновой губки и девитализированной (Д) клеточной культуры стромальной фракции жировой ткани. В основных группах двум животным в каждой точке наблюдения вводили тканеинженерные конструкции с клеточной культурой, трансфицированной геном зелёного белка.
Животных вводили в наркоз путём внутримышечной инъекции раствора препарата «Золетил-50» в дозе 5мг/кг или ингаляцией диэтилового эфира. До начала основного эксперимента для получения аутогенных и аллогенных клеточных культур стромальной фракции жировой ткани в основной группе наблюдения забирали участки подкожной жировой ткани в области холки. Волосы в области операционного поля выстригали. Производили продольный разрез кожи, отсекали фрагмент жировой ткани размером 0,5x0,5 см, проводили гемостаз, накладывали швы на рану. Полученные образцы помещали в транспортную среду и при соблюдении температурного режима (+4С) транспортировали в культуральную лабораторию. Для соблюдения принципа аутогенности животные были маркированы с помощью надрезов ушных раковин.
Подготовленный трансплантат вводили под эфирным наркозом, парауретрально с помощью инсулинового шприца со стандартной иглой (диаметр 0,6 мм). 5 млн. клеток вводили в объеме 0,1 мл физиологического раствора.
Сроки выведения животных в каждой группе составили: 7-е, 14-е, 30-е и
60-е сутки, по 6 животных в каждой точке наблюдения. В каждой точке
эксперимента в группах сравнения и основной двум животным была введена
клеточная культура, трансфицированная геном Green Fluorescent Protein. Из эксперимента животных выводили передозировкой диэтилового эфира. Самкам крыс проводили окаймляющий разрез кожи вокруг клитора с захватом верхней половины влагалища. Тупым и острым путем клитор был мобилизован до лонных костей, вместе с участком влагалища и отсечен на глубине 1 см.
Гистологические и морфометрические методы исследования
Гистологическое исследование образцов ткани проводили непосредственно после выведения животных из эксперимента. Полученный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере по Лилли в течение 72 часов, после чего в течение 24 часов образцы ткани промывали в проточной воде. После стандартной гистологической проводки образцы тканей заливали в парафин («Гистомикс», Биовитрум), используя гистологические кольца (Биовитрум). Срезы получали на микротоме Microm НМ430 толщиной 5 мкм. Для изучения срезов тканей парауретральной области использовали обзорные окраски - гематоксилином и эозином, по Маллори; пикросириусом красным для количественной оценки общей площади коллагеновых волокон и окраску по Романовскому-Гимзе для изучения морфологии клеточного инфильтрата. Локализацию GFP выявляли путем иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов с использованием кроличьих поликлональных антител к GFP (Abeam, США). Гистологические препараты изучали и фотографировали, используя микроскоп Zeiss Axioplan-2, фотосъёмку проводили цифровой камерой Axiocam.
Для оценки морфологических изменений в области трансплантации проводили морфометрическое исследование матрикса конструкции, клеток, инфильтрирующих область введения конструкций, коллагеновых волокон; кровеносных сосудов.
На каждом срезе в области, соответствующей введению, делали 6
цифровых снимков при увеличении х200, используя камеру AxioCam
микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия), причем поля зрения выбирали по
таблице случайных чисел. Подсчет проводили с помощью сетки из 100 узлов с использованием метода «полей» [Автандилов Г.Г., 1990], затем определяли относительный объем каждого из элементов.
Качественный состав клеточного инфильтрата оценивали путём подсчёта 100 клеток в «заинтересованной» области у одного животного. Во всех группах учитывались следующие клеточные элементы: макрофаги, фибробласты и фибоциты, клетки трансплантата.
Динамику изменения содержания коллагеновых волокон исследовали на срезах толщиной 4 мкм, окрашенных пикросириусом красным, позволяющим наиболее точно визуализировать коллаген [Junqueira L.C.U., 1979]. На каждом срезе в области введения, делали до 4-х цифровых снимков общим увеличением х20 и обрабатывали их с помощью пакета «Анализ» программы Adobe Photoshop CS3 extended (Adobe Systems Incorporated). Фракцию коллагеновых волокон вычисляли по отношению всех пикселей «коллагена» к общему количеству пикселей в поле зрения по формуле:
С=ВА/(ТА/100),
где С - содержание коллагеновых волокон в процентах, ТА (Total Area) -общая площадь изображения, СА (Collagen Area) - общая площадь красных областей. Статистические методы исследования
В группах определяли среднее арифметическое х , стандартную ошибку
среднего s, по формуле для долей (Урбах В.Ю., 1975). Для стабилизации
дисперсии использовали метод <р с вычислением статистики Колмогорова-Смирнова до и после трансформации. Трансформированные данные использовали для всех параметрических тестов (однофакторный дисперсионный анализ, t-тест с поправкой Бонферрони). Границы 95%-ных доверительных интервалов L определяли с помощью (р-преобразования для долей [Урбах В.Ю., 1975]. Статистический анализ результатов проводили с
помощью программ Microsoft Excel 2007, Statistica 6.0 (StatSoft) и Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc.), при 5% уровне достоверности.
