Введение к работе
Актуальность темы
Современная медицина рассматривает область клеточных технологий как одну из самых перспективных. Со времени введения термина «стволовая клетка» (Максимов А.А., 1908) до первого клинического применения стволовых клеток прошло более 50 лет (Thomas E.D., 1957). Сегодня в мире активно обсуждаются вопросы клеточной медицины и биотехнологии. Наряду с гемопоэтическими клетками, перспективно использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК) (Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Edition, American textbook of internal medicine; Kasper DL et. al., 2008; Ichiro Sekiya, 2002). ММСК были обнаружены среди адгезивной фракции клеток стромы костного мозга (А.Я. Фриденштейн, 1968). В экспериментах in vitro была показана высокая пролиферативная активность этих клеток, а также их способность дифференцироваться в жировую, костную, хрящевую, нейрональную и мышечную ткань (Baksh D. et. al., 2004; Bruno Delorme, 2009). В отдельных экспериментах удавалось дифференцировать эти клетки в кардиомиоциты, гепатоциты, инсулин-продуцирующие клетки (Bianco P., 2001; Salamon A, 2009).
Создание банков клеток позволяет в качестве отдельного направления клеточных технологий применять метод тестирования различных материалов и лекарственных средств, используемых в медицине и трансплантологии на токсичность и биологическую совместимость. (Roeker S. et. al., 2009; Manso-Silvn M. et. al., 2007; Ahmadi R. et. al., 2008; Волова Л.Т., 2008)
В клинической практике ММСК применяются в гематологии при совместной трансплантации с гемопоэтическими клетками для уменьшения времени приживления трансплантата и нивелирования реакции «трансплантат против хозяина» (Schfer R. et. al., 2009; Le Blanc K., 2004), что значительно повышает эффективность трансплантаций. Перспективно применение ММСК в травматологии и ортопедии для лечения дефектов хрящевой ткани (Murdoch A.D. et. al., 2007; Kevin B.L. Lee et. al., 2007), костных дефектов (Cancedda R., 2003; Dennis J.E. et. al., 2007), в нейрохирургии для лечения нейродегенеративных заболеваний (Bae J. et al., 2007; Coleman B. et. al., 2007). В последних работах показано, что генетически модифицированные ММСК можно успешно применять для лечения некоторых генетических заболеваний (Samantha L. Ginn et. al., 2005).
В настоящее время в клинических испытаниях преимущественно используются аутологичные ММСК аспирата костного мозга. Процедура получения материала достаточно травматична и может вызвать ряд нежелательных реакций (Bain B.J., 2001). В качестве альтернативного источника ММСК ряд авторов предлагает использовать аспират жировой ткани или пуповинную кровь (Kern S. et al., 2006). Однако отсутствие в доступной литературе полной сравнительной характеристики этих источников и наличие противоречивых данных о принадлежности получаемых клеток из жировой ткани и пуповинной крови к группе ММСК, а, следовательно, их биологических свойств, не позволяют использовать эти клетки в качестве альтернативы ММСК для клинических и других видов исследований.
Таким образом, являются актуальными исследования направленные на доказательство принадлежности клеток из различных источников к группе ММСК костного мозга, оценка потенциала каждого источника для применения в клинической практике и тестирования биоматериалов и других средств медицинского назначения на биосовместимость и токсичность.
Цель исследования
Проведение сравнительного анализа адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и плацентарной/пуповинной крови для определения оптимального источника мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для применения в области клеточных технологий.
Задачи исследования
Охарактеризовать пролиферативную активность адгезивных клеток, полученных из разных источников с помощью комплекса морфологических методов исследования в зависимости от длительности культивирования и времени удвоения клеточной культуры.
Сравнить фенотипические характеристики и охарактеризовать дифференцировочный потенциал адгезивных клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови с помощью гистохимических и иммунологических методов исследования для определения принадлежности клеток к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.
Определить уровни синтеза цитокинов во внеклеточной среде клеточной популяции аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови, характер изменений этих показателей в процессе культивирования с помощью иммунологических методов исследования.
Сравнить степень биологической совместимости и адгезивной способности изучаемых клеток к бионосителям из лиофилизированной костной матрицы LyoPlast и титановой пружины (Металлорезина) с использованием электронно-растровой микроскопии, провести исследование на совместимость имплантатов нитинол (NiTi) и нитинол с гидроксиапатитом (NiTi+GA) на мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках самого оптимального источника.
Провести комплексную сравнительную оценку адгезивной фракции клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови с позиции: биоэтичекой пригодности, доступности и стоимости получения материала, степени пролиферативной активности, направленной дифференцировки, совместимости с биологическими носителями.
Научная новизна
Впервые на территории РФ получена сравнительная оценка фенотипа и дифференцировочной способности клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови в условиях одной лаборатории и в абсолютно идентичных условиях культивирования.
Впервые были получены данные сравнительного анализа уровня синтезируемых цитокинов и их изменений в зависимости от длительности культивирования у всех групп клеток.
Проанализированы в сравнительном аспекте комплексные морфологические и пролиферативные характеристики адгезивных фракций клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови, выведены формулы определения максимально возможного количества удвоений культуры, получены индексы падения скорости пролиферации.
Впервые проведено сравнение адгезивной совместимости клеток из трех источников на биоимплантатах LyoPlast, имплантатах металлорезина, показана эффективность метода тестирования совместимости материалов нитинол и нитинол с гидроксиапатитом на мультипотентных мезенхимальных клетках жировой ткани.
Разработана и внедрена методика определения наличия, жизнеспособности и подвижности адгезивных клеток на имплантатах без использования методов электронной микроскопии (Рационализаторское предложение №97 от 27 сентября 2010г.).
Впервые проведена комплексная сравнительная оценка адгезивных клеток из трех источников с использованием не только лабораторных методов исследования, но и с позиции биоэтики, доступности получения материала и перспективы их применения в области клеточных технологий.
Научно-практическая значимость
Получены данные о максимально возможном количестве удвоений культуры клеток из различных источников, их индекса пролиферативной активности, что позволяет рассчитывать эффективность культивирования.
Разработаны математические модели и функции, благодаря которым можно рассчитать максимально возможное количество удвоений культуры в пределах пролиферативной активности, вычислить индекс пролиферативной активности на любом этапе культивирования.
Определены потенции дифференцировки в мезенхимном направлении (адипогенное, остеогенное, хондрогенное) и подтверждена специфическая экспрессия антигенов, что позволило отнести изучаемые клетки к группе мезенхимальных стромальных.
Выявлена способность клеток из трех источников одинаково эффективно образовывать комбинированные клеточные имплантаты. Опытным путем доказана эффективность использования ММСК оптимального источника для тестирования имплантатов.
Путем комплексного сравнительного анализа выявлен оптимальный источник мультипотентных мезенхимально стромальных клеток для применения в области клеточных технологий.
