Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12
1. Дифференцировка и регенерация поперечнополосатых скелетных мышц 12
1.1. Развитие скелетных мышц в эмбриогенезе 12
1.2. Формирование нейромышечных соединений 15
1.3. Регенерация скелетных мышц 19
1.4. Миогенные клетки в регенерации скелетных мышц 21
2. Мышечная дистрофия Дюшенна 29
2.1. Дистрофии и дистрофш-ассоциированный гликопротеиновый комплекс 30
2.2. Мыши max как животная модель мышечной дистрофии Дюшенна 36
2.3. Лечение мышечной дистрофии Дюшенна 46
2.3.1. Генная терапия мышечной дистрофии Дюшенна 47
2.3.2. Клеточная терапия мышечной дистрофии Дюшенна 54
3. Воздействие слабых комбинированных полей на биологические объекты 65
3.1. Ионный циклотронный резонанс (модель А.Р. Либова) 65
3.2. Теория магнитного параметрического резонанса (в биосистемах) (Теория В.В. Леднева) 67
II. Материалы и методы 70
1. Животные 70
2. Внутримышечная трансплантация Lin(-)-CKKM мышей C57BL/6 и C57BL/6, экспрессирующих GFP, мышам mdx 70
2.1. Выделение Ып(-)-СККМ. 70
2.2. Цитофлуориметрический анализ Ып(-)-СККМ. 71
2.3. Внутримышечная трансплантация Ып(-)-СККМмышам mdx.. 72
3. Создание радиационных химер 73
4. Облучение радиационных химер mdx слабым комбинированным магнитным полем 73
5. Гистологические и иммуногистохимические методы 74
5.1. Получение срезов мышц 74
5.2. Оценка экспрессии GFP после трансплантации СККМ GFP (+) доноров 74
5.3. Иммуногистохимия 75
5.4. Окраска гематоксилином-эозином 77
5.5. Определение площади ППМВ 77
6. Исследование НМС 77
III. Результаты 79
1. Влияние внутримышечной трансплантации Lin(-)-CKKM на регенерацию и дифференцировку ППМВ мышей mdx 79
1.1. Участие GFP (+) Ып(—)-СККМ в регенерации ППМВ мышей mdx после внутримышечной трансплантации 79
1.2. Внутримышечное введение Ып(—)-СККМ вызывает усиление дифференцировки ППМВ мышей mdx 81
1.3. Изменение структуры НМС мышей mdx после внутримышечного введения п(-)-СККМ . 85
2. Участие СККМ в регенерации и дифференцировке ППМВ мышей mdx у радиационных химер 89
2.1. Трансплантация СККМ облученным в дозе 5 Гр мышам mdx не вызывает усиления дифференцировки ППМВ 89
2.2. Влияние Са2+-КМП на участие СККМ в дифференцировке ППМВ химерных мышей mdx 93
2.3. Влияние замены костного мозга на фоне рентгеновского облучения в дозе 3 Гр на дифференцировку ППМВ мышей mdx 97
IV. Обсуждения 100
1. Lin(-)-CKKM после внутримышечного введения участвуют в регенерации ППМВ мышей mdx и усиливают их дифференцировку... 100
2. ОСМ участвуют в регенерации и дифференцировке ППМВ мышей mdx после внутривенного введения облученным мышам mdx 108
2.1. Воздействие Са -КМП увеличивает эффективность участия СККМв дифференцировке ППМВ мышей mdx 110
2.3. Внутривенное введение ККМ мышам mdx, обученным в дозе 3 Гр усиливает экспрессию. дистрофина и дифференцировку ППМВ мышей mdx 111
Выводы 114
Список литературы 115
- Дистрофии и дистрофш-ассоциированный гликопротеиновый комплекс
- Теория магнитного параметрического резонанса (в биосистемах) (Теория В.В. Леднева)
- Облучение радиационных химер mdx слабым комбинированным магнитным полем
- Изменение структуры НМС мышей mdx после внутримышечного введения п(-)-СККМ
Введение к работе
Актуальность исследования. Мышечные дистрофии представляют собой гетерогенную группу генетических расстройств, характеризующихся прогрессирующей потерей силы скелетных мышц. Одной из самых распространенных и тяжелых форм мышечной дистрофии является Х-сцепленная рецессивная мышечная дистрофия Дюшенна (МДД; см. список сокращений на с. 7) [1]. Для исследования возможностей лечения МДД используют различных животных, являющихся моделью этого заболевания [2, 3]. Наиболее широко используемой экспериментальной моделью МДД являются мыши mdx с точечной мутацией в X-хромосоме, приводящей к блокаде синтеза связанного с мембраной белка дистрофина [4, 5]. Обширные исследования мышей mdx показали, что с возрастом их скелетные мышцы подвергаются структурным и функциональным изменениям, сходным с теми, которые наблюдаются при МДД [6]. В настоящее время в качестве основных патогенетических механизмов, лежащих в основе повреждения мышечных волокон в отсутствие дистрофина и ассоциированного с ним белкового комплекса, рассматриваются: 1) ослабление сарколеммы в результате потери механической поддержки, обеспечиваемой дистрофином; 2) не соответствующий нормальному уровню приток кальция в клетки; 3) нарушение передачи сигналов клетками; 4) окислительный стресс; 5) периодически повторяющаяся ишемия мышц [7, 8]. Так, показано, что развивающийся в поперечнополосатых мышечных волокнах (ППМВ) мышей mdx окислительный стресс [9, 10] приводит к гибели ППМВ. Гибель мышечных волокон протекает преимущественно по типу апоптоза [11, 12, 13, 14]. За гибелью ППМВ следует регенерация. Постоянно повторяющиеся циклы дегенерации—регенерации, приводят к тому, что большая часть ППМВ имеет центрально расположенные ядра [15], указывающие на то, что дифференцировка ППМВ заторможена на стадии мышечных трубочек [14]. Кроме того, в скелетных мышцах мышей mdx наблюдаются нарушения структуры нейромышечных соединений (НМС) [15, 16].
В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на поиски путей восстановления нормальной структуры ППМВ мышей mdx. В работах используют как фармакологические подходы, так и методы генной [17] и клеточной терапии [18]. Широкое распространение также получило изучение возможностей
клеточной терапии с использованием стволовых клеток. Предполагается, что вхождение в состав мутантных ППМВ ядер стволовых клеток дикого типа с нормальным генотипом способно исправить метаболизм ППМВ и превратить их в нормальные сократительные клетки. В качестве источников стволовых клеток для трансплантации предлагают, в первую очередь, костный мозг [19, 20], мышечную ткань [21]. По литературным данным, наиболее эффективными клетками оказались мезоангиобласты и перициты [22, 23]. Однако, несмотря на разнообразие источников стволовых клеток, для которых показана способность дифференцироваться в миогенном направлении, и которые, соответственно, могут использоваться для клеточной терапии мышечных дистрофий, костный мозг остается наиболее доступным источником. Кроме того, до настоящего времени не достаточно изучено влияния на дифференцировку ППМВ полной замены мутантных клеток костного мозга (ККМ) мышей mdx на стволовые клетки костного мозга (СККМ) дикого типа. В частности, не получено объяснения низкой функциональной активности ядер СККМ, включившихся в состав ППМВ после такой замены. В качестве возможных агентов, стимулирующих экспрессию специфических для мышц генов с ядер трансплантированных клеток, могут, по-видимому, рассматриваться воздействия, влияющие на регенерацию тканей. В частности, способность значительно усиливать рост и регенерацию различных тканей показана для слабых комбинированных
магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са (Са -КМП) [24, 25, 26, 27].
Таким образом, изучение участия СККМ, трансплантированных мышам mdx, в регенерации и дифференцировке ППМВ мышей mdx представляется актуальной задачей, как с точки зрения изучения регенерации скелетных мышц, так и с точки зрения разработки методов лечения МДД, моделью которой и являются мыши mdx.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении влияния трансплантированных местно или внутривенно стволовых клеток костного мозга мышей C57BL/6 на дифференцировку и регенерацию поперечнополосатых мышечных волокон мутантных мышей mdx. Для достижения данной цели решались следующие задачи:
1. Оценить участие стволовых клеток костного мозга дикого типа,
трансплантированных внутримышечно или внутривенно, в регенерации
поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx в сингенных условиях.
2. Оценить влияние внутримышечной трансплантации Lin(-) популяции стволовых
клеток костного мозга дикого типа на структуру нейромышечных соединений
скелетных мышц мышей mdx.
Исследовать изменение дифференцировки поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx на разных сроках после внутримышечной трансплантации Lin(-) стволовых клеток костного мозга нормальных мышей C57BL/6 по таким признакам, как уровень гибели поперечнополосатых мышечных волокон, изменение доли поперечнополосатых мышечных волокон без центрально расположенных ядер и экспрессия дистрофина.
Исследовать дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон радиационных химер mdx, полученных после облучения в дозе 5 Гр, и возможность усиления дифференцировочных процессов в мышцах этих мышей под действием слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са +.
5. Исследовать дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон после
сингенной внутривенной трансплантации клеток костного мозга дикого типа
облученным в дозе 3 Гр мышам mdx.
Основные положения, выносимые на защиту:
СККМ мышей C57BL/6 участвуют в регенерации ППМВ мутантных мышей mdx как после внутримышечной трансплантации, так и после внутривенного введения предварительно облученным животным.
Трансплантированные внутримышечно Lin(-) стволовые клетки костного мозга (Lin(-)-CKKM) мышей C57BL/6 усиливают дифференцировку ППМВ мышей mdx, что выражается в усилении синтеза дистрофина, увеличении доли ППМВ без центрально расположенных ядер (ЦЯ (-)), а также в снижении уровня гибели ППМВ.
3. Внутримышечная трансплантация Lin(-)-CKKM мышей C57BL/6 изменяет
распределение кластеров (АХР) в НМС мышей mdx так, что приближает структуру
НМС мышей mdx к структуре НМС нормальных мышей C57BL/6.
4. Внутривенная трансплантация ККМ мышей C57BL/6 мышам mdx,
предварительно облученным рентгеновыми лучами в дозе 5 Гр, не приводит к
9-І-
нарастанию синтеза дистрофина в ППМВ. Воздействие Са -КМП усиливает дифференцировку и синтез дистрофина в скелетных мышцах радиационных химер мышей mdx, полученных путем внутривенной трансплантации ККМ мышам mdx, облученным в дозе 5 Гр.
5. Сингенная внутривенная трансплантация ККМ дикого типа после
рентгеновского облучения в дозе 3 Гр вызывает усиление синтеза дистрофина в
ППМВ, увеличивает долю ЦЯ (—) ППМВ и снижает долю погибших ППМВ у мышей
mdx.
Научная новизна работы. Впервые показано, что внутримышечная трансплантация Lin(-)-CKKM дикого типа приводит к изменениям структуры НМС мышей mdx, которые приближают ее к структуре НМС нормальных мышей C57BL/6.
9-І-
Впервые показано, что Са -КМП способно влиять на функционирование ККМ, внутривенно трансплантированных мышам mdx, облученным в дозе 5 Гр, и вызывать усиление синтеза дистрофина в ППМВ этих мышей через 2 мес после трансплантации.
Впервые показано, что внутривенная трансплантация ККМ мышам mdx, облученным в дозе 3 Гр, приводит к увеличению доли дистрофин-положительных ППМВ и усилению дифференцировки ППМВ этих мышей на длительных сроках наблюдения (6 мес).
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание участия ККМ в регенерации ППМВ. Данные, свидетельствующие о влиянии трансплантированных внутримышечно СККМ на структуру НМС мышей mdx, могут служить основой для дальнейших исследований возможности применения трансплантации СККМ для лечения дегенеративных нейромышечных заболеваний. Кроме того, данные об усилении синтеза дистрофина у радиационных химер mdx, полученных путем внутривенной трансплантации ККМ дикого типа мышам mdx, облученным в дозе 3 Гр, и данные об усилении синтеза дистрофина у радиационных химер mdx, полученных после облучения в дозе 5 Гр и дополнительно
9+
подвергавшихся действию Са -КМП, позволяют предлагать эти воздействия для
дальнейшей разработки способов лечения мышечной дистрофии мышей mdx и, в последующем, МДД у людей.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на конференции «Молекулярная и структурная биология» Политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), XIV Международном конгрессе Мирового мышечного общества (Женева, Швейцария, 2009). Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009), II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах группы генетики клеточных популяций Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения
Дистрофии и дистрофш-ассоциированный гликопротеиновый комплекс
Белок с молекулярной массой 427 кДа был назван дистрофином, так как был идентифицирован с помощью молекулярно-генетических исследований больных МДД (Hoffman, 1987). Ген дистрофина высококонсервативен, гомологи идентифицированы не только у позвоночных (млекопитающие, птицы и рыбы), но и так же у популярных беспозвоночных лабораторных моделей Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster (Collins, Morgan, 2003).
Дистрофии расположен под сарколеммой и формирует в мышечных волокнах сеть густых поперечных колец (костамеров), связанных тонкими продольных соединениями (Straub et al., 1992).
Большой размер гена дистрофина способствует высокой степени спонтанных мутаций в нем. Ген дистрофина содержит 79 экзонов, которые кодируют 14-кб кДНК и охватывают 2.4 Мб на хромосоме Хр21 (Lapidos et. al., 2004b).
Существуют несколько изоформ дистрофина. Экспрессия трех полноразмерных изоформ дистрофина с молекулярной массой 427 кДа (Dp 427) контролируется тремя независимо регулируемыми промоторами: Р (Пуркинье), М (мышца) и В (мозг). Полноразмерные изоформы содержат уникальные первые экзоны, связанные с общим набором из 78 экзонов. Названия промоторов отражают основные сайты экспрессии дистрофина. Кроме полноразмерных изоформ, существуют, по крайней мере, пять более коротких транскриптов, генерируемые с внутренних промоторов и обозначаемых согласно их размеру в кДа: Dp 260 (сетчатка, мозг, сердце), Dp 140 (головной и спинной мозг), Dp 116 (мозг, периферические нервы), Dp 71 (повсеместно) и Dp 40 (Tokarz et al., 1998; Emery, 2002; Blake et al., 2002).
Функции дистрофина в мышцах еще окончательно не определены, однако подтверждено, что: 1) дистрофии обеспечивает механическое укрепление сарколеммы и, таким образом, защищает ее от мембранных стрессов, развивающихся в ходе мышечного сокращения (Petrof et al., 1993). 2) дистрофии участвует в регуляции внутриклеточного кальция и дальнейшем каскаде кальций-зависимых процессов (Franco, Lansman, 1990). 3) дистрофии участвует в передаче сигналов (Lapidos et. al., 2004b). 4) дистрофии влияет на агрегацию АХРов (Kong, Anderson, 1999). 5) дистрофии тормозит чрезмерную генерацию активных форм кислорода (Niebrqj-Dobosz, Hausmanowa-Petrusewicz, 2005) и предотвращает повреждения, вызываемые окислительным стрессом (Disatnik et al, 2000).
Дистрофии имеет 4 функциональных домена (рис. 1.1). N-конец дистрофина содержит кальпонин-подобный актин связывающий домен, гомологичный другим актин связывающим белкам, таким как (3-спектрин и а-актинин (Lapidos et. al., 2004b). Этот актин связывающий домен отвечает за прикрепление дистрофина к цитоскелету через у-актин (Rybakova et al., 2000). Центральный Rod-домен дистрофина содержит 24 спектрин-подобных повтора. Как и в других спектриновых повторах, три спиральные связки выровнены для формирования единицы повтора и обеспечивают структурную жесткость. Гибкость Rod домена, как полагают, связана с нарушением структуры спектриновых повторов четырьмя шарнирными регионами. На С-конце дистрофина находится цистеин-богатый регион, взаимодействующий с внутриклеточной частью трансмембранного белка р дистрогликана и прикрепляющий дистрофии к сарколемме. Самый крайний регион С-конца является по своей природе а-спиралью и обеспечивает взаимодействие дистрофина с синтрофинами (Lapidos et. al., 2004b). Таким образом, N-конец дистрофина прикрепляется к костамерному у-актину, в то время как С-конец прикрепляется к дистрофин-ассоциированному белковому комплексу (DAPC), который связывается с ламинином, что обеспечивает механически прочную физическую связь между сарколеммой и цитоскелетом (Ervasti, Campbell, 1993; Chamberlain J.S., 1997; Rybakova et al., 2000).
N-конец содержит актин-связывающий сайт, в то время как С-конец содержит сайты связывающие Р-дистрогликан, дистробревин и синтрофин. N- и С-концевые домены соединены 24 спектрин-подобными повторами, некоторые из которых, как показано, связывают актин. Четыре «шарнирных» региона отмечены Н1-Н4 (Sweeney, Barton, 2000).
Кроме того, данные Prins и др. (Prins et al., 2009) подтверждают, что дистрофии непосредственно организует и(или) стабилизирует костамерные микротрубочки, и это позволяет говорить о дистрофине как о цитолинкере в скелетной мышце.
Связанный с дистрофином DAPC состоит из трансмембранных, цитоплазматических и внеклеточных белков. Известные компоненты DAPC включают дистрофии, саркогликаны, дистрогликан, дистробревины, синтрофины, саркоспан, кавеолин-3 и нейрональную NO-синтазу (nNOS) (Lapidos et. al., 2004b). Схематическое представление DAPC отражено на рис. 2.2. N-терминальный актин связывающий домен дистрофина соединяется с кортикальным актином. С-терминальный домен соединяется с р-дистрогликаном и с а-и р-синрофином и дистробревином. Как известно, nNOS связана с синтрофинами так же как и с кавеолином (Sweeney, Barton, 2000). Дистрогликан синтезируется с одного гена и, претерпевая пострансляционные модификации, разделяется на а и Р субъединицы, р-дистрогликан — трансмембранный белок, С-конец которого взаимодействует с цистеин-богатым доменом дистрофина.
Теория магнитного параметрического резонанса (в биосистемах) (Теория В.В. Леднева)
МСК были открыты в 60-х годах прошлого столетия А. Фриденштейном (Friedenstein, 1976.). В последние годы они привлекли к себе особо пристальное внимание исследователей благодаря некоторым особенностям, открывающим широкие перспективы для их клинического применения. К ним можно отнести обширный спектр дифференцировки и легкость культивирования в течение длительного времени
В настоящее время МСК чаще всего рассматривают как мультипотентные клетки с фибробластоподобной морфологией, которые присутствуют во взрослом костном мозге. МСК способны пролиферировать как недифференцированные клетки и несут потенциал дифференцировки в различные клетки различных линий, включая остеобласты, хондроциты, адипоциты, гладкомышечные клетки, астроциты, эндотелиальные клетки (Sell, 2004; Мусина и др., 2004; Tare et al., 2008). Общепринято, что взрослые человеческие МСК не экспрессируют гемопоэтические маркеры CD45, CD34, CD14, CD11, адгезионные молекулы, такие как CD31 (РЕСАМ-1), CD56 (NCAM-1), CD 18 (LCAMB) и стимулирующие молекулы, такие как CD80, CD86, CD40. Однако эти клетки экспрессируют CD 105 (SI-12/эндоглин), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71, антиген STRO-1, так же как адгезионные молекулы CD 106 (VCAM-1), CD 166 (ALCAM-1), ICAM-1 и CD29 (Tare et al., 2008).
Показано, что МСК проникают в различные органы после внутрисосудистой трансплантации. Так через двое суток после внутривенного (или внутриартериального) введения МСК присутствие введенных клеток наблюдается в различных органах, включая печень, легкие, почки, селезенку и длинные кости (Gao et al., 2001). Описанные свойства МСК позволяют рассматривать данную клеточную популяцию в качестве еще одного типа клеток для клеточной терапии МДД (Markert et al., 2009). Кроме того, способность МСК распространятся по организму после трансплантации, а также возможность их длительного культивирования лежит в основе разработке методов совместной генной и клеточной терапии с использованием МСК (Gao et al., 2001). Например, в опытах на мышах mdx по трансплантации первичных МСК человека, трансдуцированных РахЗ, наблюдалось нарастание дистрофин-положительных мышечных волокон до 11 % (Gang et al., 2009).
Однако одним из серьезных препятствий для использования длительно культивируемых МСК и МСК, трансфецированных различными векторами, является их возможная туморогенность (Гринчук и др., 2008; Попов и др., 2009). Так описано возникновение рабдомиосарком после трансплантации мышам mdx клеток линии мышиных МСК, транфецированных РахЗ (Gang et al., 2009).
Еще одним потенциальным источником клеток для цели клеточной терапии скелетных мышц называют клетки пуповинной крови, обладающие потенциалом дифференцироваться в миогенном направлении в опытах in vitro (Gang et al., 2004).
Одной из клеточных популяций, для которых, также показана способность дифференцироваться в миогенном направлении, являются CD133(+) клетки крови (Torrente et al., 2004) и мышц (Benchaouir et al., 2007). Так после внутримышечной или внутриартериальной трансплантации циркулирующих человеческих CD 133(+) клеток мышам scid/mdx наблюдалось нарастание количества дистрофин-положительных мышечных волокон (Torrente et al., 2004; Gavina et al., 2006). Так же популяция CD133(+) клеток, способных дифференцироваться в миогенном направлении, обнаружена и в мышцах. Кроме того, показано, что CD 133(+) клетки мышц больных МДД, подвергнутые exon skipping и трансплантированные внутримышечно мышам scid/mdx способны сливаться с регенерирующими мышечными волокнами и экспрессировать функциональный дистрофии (Benchaouir et al., 2007).
Наиболее удачными опытами по исследованию клеточной терапии МДД на животных моделях стали опыты по трансплантации мезангиобластов. На такой лабораторной модели МДД как собаки золотистый ретривер показано, что трансплантация мезангиобластов больным животным значительно усиливает экспрессию дистрофина, а также восстанавливает нормальную морфологию и функцию мышц (Sampaolesi et al., 2006). Эффективность трансплантации мезангиобластов также подтверждена и в опытах на модели мышечной дистрофии, вызванной дефицитом а-саркогликана. В этом случае также после трансплантации наблюдалось усиление экспрессии а-саркогликана (Galvez et al., 2006).
Получение стволовых клеток в достаточном количестве связано с определенными сложностями, как методическими, так и этическими проблемами. В настоящее время развивается направление исследования так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, получаемых на основе дифференцированных клеток, например фибробластов. Перепрограммирование дифференцированных клеток к возвращению в эмбриональное состояние производят путем внесения в клетки таких факторов, как Oct3/4, Sox2, с-Мус и Klf4 (Takahashi, Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007). Возможность создания iPS клеток путем введения указанных факторов показано, как на фибробластах мышей (Takahashi, Yamanaka, 2006), так и человеческих фибробластах (Takahashi et al., 2007). При этом полученные iPS клетки имеют морфологию ЭСК и экспрессируют маркеры ЭСК. Как в опытах in vitro, так и в опытах in vitro в тератомах, возникающих при введении этих клеток животным, показано, что эти клетки дифференцируются в клетки всех трех зародышевых листков (Takahashi, Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007). Одним из подходов является комбинирование клеточной терапии (использование iPS клеток, созданных из клеток пациента) и генной терапии (введение в полученные из клеток пациента iPS клеток векторов, содержащих нормальную версию дефектного гена). Так показано, что iPS клетки, полученные из эмбриональных фибробластов мышей mdx и из фибробластов больных МДД путем ретровирусной доставки факторов, включающих Kl/4, Sox2 и Oct4 для мышиных клеток и ОСТ4, KLF4, SOX2 и cMYC для человеческих клеток дают рост колониям клеток подобных ЭСК. Полученные клетки трансфецировали вектором на основе искусственной человеческой хромосомы, содержащим нормальную версию дефектного гена. Показано, что при трансплантации таких клеток иммунодефицитным мышам, возникают тератомы, содержащие производные трех зародышевых листков. Причем в тканях, напоминающих мышечную, наблюдалась экспрессия дистрофина (Kazuki et al., 2010).
Облучение радиационных химер mdx слабым комбинированным магнитным полем
В настоящее время широко исследуются возможности применения клеточной терапии с использованием стволовых клеток различного происхождения для лечения МДД, которые проводятся, главным образом, на мышах mdx как самой распространенной и доступной животной модели данного заболевания. Нами были проведены исследования по изучению влияния однократного внутримышечного введения Lin(-)-CKKM на дифференцировку ППМВ мышей mdx.
Первая часть исследования состояла в изучении распределения GFP-положительных Lin(-)-CKKM, трансплантированных внутримышечно мышам mdx и мышам C57BL/6. Было обнаружено, что в течении 2-х недель введенные клетки сохраняются в мышце в пространстве между мышечными волокнами. Кроме того наблюдается присутствие GFP-положительных ППМВ как у мышей mdx, так и у мышей C57BL/6. Количество меченных GFP ППМВ значительно выше у мышей mdx по сравнению с мышами дикого типа. Это связанно с тем, что для мышей mdx характерен более высокий уровень гибели ППМВ и соответственно высокий уровень регенерации. Постоянно протекающая регенерация приводит к значительно высокому потреблению мышцами стволовых клеток. Большая активность стволовых клеток, в частности клеток-сателлитов как основной клеточной популяции, участвующей в регенерации мышц, подтверждается в частности тем фактом, что у больных МДД количество клеток-сателлитов превышает значения, характерные для нормального контроля. Так же наблюдается увеличение доли эухроматина в общем хроматине ядер клеток-сателлитов по сравнению с клетками-сателлитами здоровых людей (Wakayama et al., 1979). Присутствие GFP-положительных 1111МВ в мышцах мышей после трансплантации им СККМ свидетельствуют о том, что введенные клетки с ядрами сливаются с в мышечными симпластами мышей mdx и ядра дикого типа функционируют там, тем самым участвуя в регенерации 1111MB.
Кроме того, GFP-положительные клетки и ППМВ были обнаружены и в контрлатеральной мышце, в которую вместо клеток вводился только буфер. Таким образом, введенные клетки распространяются по организму животного с током крови и участвуют в регенерации мышц, не подвергавшихся трансплантации СККМ. Эти данные свидетельствуют, что, несмотря на местное введение, СККМ способны покидать область трансплантации и распространятся в другие органы и ткани, что свидетельствует о необходимости более тщательного контролирования поведения СККМ даже в условиях местного воздействия.
Цитофлуориметрический анализ трансплантируемых Lin(—)-СККМ показал присутствие значительного числа CD45-положительных клеток (рис. 2.1). Некоторые авторы предполагают, что именно данная фракция СККМ (Lin(—), CD45(+)) содержит стволовые клетки, способные реконструировать дистрофическую мышцу (Kapsa et al., 2002). Кроме того, способность CD45-положительных стволовых клеток как мышечного, так и костномозгового происхождения участвовать в регенерации мышечных волокон описана рядом авторов (Gussoni et al., 1999; McKinney-Freeman et al., 2002; Cao et al., 2003; Shi, Garry, 2006). Так нами было показано, что после внутримышечной трансплантации Lin(—)-СККМ большая часть клеток донорского происхождения, оставшихся в пространстве между 1111MB и идентифицируемых по экспрессии GFP, являются CD45-положительными (Михайлов и др., 2006). Наличие в нашей Lin(—) популяции СККМ значительной доли С045-положительных клеток указывает на то, что изучаемая популяция не относится к мезенхимальным стволовым клеткам (Tare et al., 2008).
Так как было показано участие трансплантированных внутримышечно Lin(—)-СККМ в регенерации ППМВ у мышей mdx, то далее было необходимо исследовать, насколько эффективен данный вид клеточной терапии, в частности оценить влияние этих клеток на дифференцировку ППМВ мышей mdx.
Для оценки эффективности клеточной терапии в первую очередь определялась доля дистрофин-положительных ППМВ у мышей mdx и у мышей mdx после внутримышечной трансплантации СККМ. Несмотря на то, что в наших исследованиях по внутримышечному введению GFP-положительных СККМ уже через 2 недели после трансплантации наблюдалась экспрессия GFP в ППМВ, что свидетельствовало о включении ядер введенных клеток в ППМВ мышей mdx, после введения Lin(—)-СККМ на сроках 4 и 8 недель увеличения доли дистрофин-положительных ППМВ мы не наблюдали. Эти результаты согласуются с данными, о том, что включение ядер клеток костного мозга в ППМВ недостаточно для усиления экспрессии дистрофина (Chretien et al., 2005; Wernig et al., 2005). Тем ни менее, на более поздних сроках после трансплантации (16 и 24 нед), мы зарегистрировали достоверное нарастание доли ППМВ, экспрессирующих дистрофии, с 0.5 % до 1.8 %.
Отсутствие синтеза дистрофина после трансплантации СККМ дикого типа в мышцы мышей mdx отмечена многими авторами и, по мнению одного из них (Cossu, 2004), отражает блокаду экспрессии мышечных генов в ядрах дикого типа, включившихся в состав мутантных мышечных волокон.
Как описано в литературе, отсутствие дистрофина у мышей mdx приводит к гибели ППМВ и последующей регенерации. Таким образом, мышцы мышей mdx характеризуются присутствием погибших ППМВ, а так же наличием значительного количества регенерирующих ППМВ, характеризующихся центральным расположением ядер (Torres, Duchen, 1987). В связи с этим, производилась оценка уровня гибели ППМВ в мышцах мышей mdx после трансплантации СККМ, а так же определение доли ППМВ без центрально расположенных ядер. Было отмечено, что снижение доли погибших ППМВ регистрируется, начиная с 4-й недели после трансплантации, и не увеличивается на всех сроках наблюдения. Так же показано, что, начиная с 8 недели после трансплантации, доля ППМВ без центрально расположенных ядер достоверно превышает количество, характерное для обычных мышей mdx, и не уменьшается до 24 нед, что свидетельствует об увеличении доли ППМВ достигших терминальной стадии дифференцировки, для которых характерно периферическое расположение ядер.
Помимо присутствия большого количества погибших ППМВ и ППМВ с центрально расположенными ядрами, для мышей mdx характерно уменьшение средних поперечных размеров мышечных волокон. Известно также, что у мышей mdx наблюдается больший разброс диаметров ППМВ по сравнению с мышами дикого типа (Torres , Duchen 1987; Михайлов и др., 1998; Reed el al., 2005). Определение площадей поперечных срезов ППМВ после введения СККМ выявило у ППМВ мышей mdx тенденцию к увеличению площади ППМВ, начиная с 4-й недели после трансплантации, что также свидетельствует об усилении дифференцировки ППМВ в мышцах мышей mdx после трансплантации СККМ.
Изменение структуры НМС мышей mdx после внутримышечного введения п(-)-СККМ
Основная часть исследования участия СККМ в регенерации скелетных мышц мышей mdx производилось на радиационных химерах, полученных путем введения ККМ, предварительно облученным летальными дозами или рентгеновского или у-излучения (Gussoni et al. 1999, Chretien et al., 2005).
В свою очередь показано, что донорский химеризм в костном мозге мышей после трансплантации ККМ наблюдается и в случае, если клетки трансплантировались животным предварительно облученным в дозе 3, 1.6 Гр (Goebel et al., 2002) и даже необлученным мышам (Stewart et al., 1993). Так же в этих исследованиях показано, что приживление клеток костного мозга и степень химеризма зависит от количества вводимых клеток (Stewart et al., 1993; Goebel et al., 2002). Перечисленные данные позволяли предполагать, что после трансплантации стволовых клеток, местной или общей, в мышце-мишени возникает конкуренция между местными стволовыми клетками и введенными клетками за участие в проникновение в саркоплазму. В связи с этим было принято решение о снижение дозы облучения до 3 Гр при приготовлении химер mdx. В результате было получено, что, в соответствии с литературными данными (Goebel et al., 2002), у мышей облученных в такой дозе наблюдается присутствие значительного количества меченных клеток в костном мозге. У радиационных химер mdx 3 Гр, так же как и у облученных большими дозами животных, введенные клетки распространялись по организму животного и их присутствие наблюдалось в мышцах, сердце, надпочечнике и других органах. Как и в предыдущих экспериментах в мышцах химер мышей mdx присутствовали как ППМВ, экспрессирующие GFP, так и отдельные GFP (+) клетки. Причем с течением времени доля GFP (+) волокон возрастала, что, по-видимому, свидетельствует об постепенной замене мутантных ядер на ядра трансплантированных клеток дикого типа.
При исследовании влияния облучения в дозе 3 Гр и последующей трансплантации ККМ на дифференцировку ППМВ мышей mdx было получено, что уровень дистрофина возрастает с течением времени и если через 2 мес после трансплантации составляет 4.1±0.9%, то через 6 мес составляет уже 27.6±6.7 %, что значительно превышает характерный для контрольных мышей mdx уровень в 1.1±0.4%. При этом происходило снижение доли погибших ППМВ и нарастании ППМВ, не имеющих центрально расположенных ядер, доля которых через 6 мес составила 22.6±1.9%. Следовательно доза облучения 3 Гр вызывает повышение эффективности участия введенных стволовых клеток костного мозга в регенерации ППМВ. По литературным данным (Chretien et al., 2005) введение клеток костного мозга мышам mdx, облученным в дозе 9 Гр, не вызывает достоверного усиления экспрессии дистрофина ни на ранних сроках (1,3 мес) ни на рассматриваемом нами сроке, 6 мес. Аналогичное отсутствие нарастания синтеза дистрофина мы наблюдали и в наших экспериментах на химерах после облучения в дозе 5 Гр. По нашим наблюдениям доза 5 Гр летальна для мышей mdx и доза 3 Гр вызывает умеренную гибель мышей mdx. Усиление эффективности клеточной терапии мышц у мышей, облученным в дозе 3 Гр по сравнению с обучением в более высоких дозах, не может найти свое объяснение в предположении об участии конкуренции между мутантными и дикими стволовыми клетками за участие в регенерации мышц и требует дополнительных исследований. Известно, что дозы рентгеновского облучения величиной 1-3 Гр относятся к так называемым слабым радиационным воздействиям. Показано, что при таких воздействиях клетки животных переходят в новое устойчивое состояние, отличающееся от исходного повышением частоты встречаемости клеток, несущих признаки повреждения (Бычковская и др., 2002). Также описан «эффект ложа опухоли», который состоит в снижении приживления необлученных опухолевых клеток при трансплантации в предварительно облученные в дозах 1—3 Гр зоны тела экспериментального животного (цит. по Бычковской и др., 2002). По данным Шиффера (Шиффер и др., 1978) эффект развивается через сутки после облучения. Можно предполагать, что облучение 3 Гр менее значительно повреждает мышцы, чем дозы 5 Гр и выше, тем самым облегчая заселение мышцы трансплантированными СККМ и активацию транскрипционной активности трансплантированных ядер в большой степени, чем после обучения в дозах 5 Гр и выше. 1. Стволовые клетки костного мозга мышей C57BL/6 участвуют в регенерации поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx как после внутримышечной, так и после внутривенной трансплантации. 2. Внутримышечная сингенная трансплантация Lin(—) стволовых клеток костного мозга мышей C57BL/6 усиливает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx; при этом, в первую очередь, уменьшается доля погибших поперечнополосатых мышечных волокон, на более длительных сроках наблюдения увеличивается доля поперечнополосатых мышечных волокон, не имеющих центрально расположенных ядер, и возрастает доля дистрофин-положительных поперечнополосатых мышечных волокон. 3. Сингенная внутримышечная трансплантация Lin(-) популяции стволовых клеток дикого типа мышам mdx частично улучшает структуру нейромышечных соединений скелетных мышц, приближая её к структуре нейромышечных соединений скелетных мышц нормальных мышей C57BL/6. 4. Воздействие слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са усиливает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон и синтез дистрофина в скелетных мышцах радиационных химер mdx. 5. Сингенная внутривенная трансплантация клеток костного мозга дикого типа мышам mdx, облученных в дозе 3 Гр, усиливает дифференцировку и синтез дистрофина в поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx.
