Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 16
Современные представления о патогенезе хронической сердечной недостаточности и методах клеточной терапии, направленных на стимуляцию репарации миокарда 16
1.1. Механизмы репаративной регенерации миокарда 17
1.2. Клеточная терапия сердечно-сосудистых заболеваний 34
1.2.1. Результаты применения мононуклеарных клеток костного мозга 36
1.2.2. Результаты применения мультипотентных стромальных клеток костного мозга 44
1.3. Механизмы стимуляции репарации миокарда при трансплантации клеток костного мозга 54
2. Материалы и методы исследования 70
2.1. Экспериментальное исследование безопасности и эффективности интракоронарнои трансплантации мононуклеарных и мультипотентных стромальных клеток костного мозга 71
2.1.1. Техника подготовки и проведения экспериментальной модели постинфарктного кардиосклероза и трансвентрикулярной интракоронарнои трансплантации клеток 74
2.1.2. Методы экспериментальных исследований 83
2.2. Клиническое исследование безопасности и эффективности интракоронарнои трансплантации алогенных мультипотентных стромальных клеток больным хронической сердечной недостаточностью 91
2.2.1. Протокол клинического исследования 91
2.2.2. Клеточный трансплантат 94
2.2.3. Методы клинического исследования 98
3. Результаты исследований и обсуждение 102
3.1. Результаты экспериментального исследования трансвентрикулярной интракоронарнои трансплантации клеток костного мозга при постинфарктном кардиосклерозе 102
3.1.1. Изменение функциональных показателей работы сердца крыс после трансплантации 102
3.1.2. Хоминг трансплантированных клеток костного мозга 114
3.1.3. Пути дифференцировки трансплантированных клеток 132
3.1.4. Морфология рубцовой ткани постинфарктного сердца 142
3.1.5. Обратное ремоделирование левого желудочка сердца 158
3.1.6. Ангиогенез, участие в нем трансплантированных клеток 169
3.1.7. Морфологические изменения в других органах после острого инфаркта миокарда и трансплантации клеток костного мозга 176
3.2. Результаты пилотного клинического исследования безопасности и эффективности интракоронарной трансплантации аллогенных мультипотентных стромальных клеток костного мозга 182
3.2.1. Безопасность интракоронарной аллогенной трансплантации мультипотентных стромальных клеток костного мозга 183
3.2.2. Эффективность интракоронарной аллогенной трансплантации мультипотентных стромальных клеток при хронической сердечной недостаточности 190
Заключение 212
Выводы 219
Список литературы 223
- Механизмы стимуляции репарации миокарда при трансплантации клеток костного мозга
- Техника подготовки и проведения экспериментальной модели постинфарктного кардиосклероза и трансвентрикулярной интракоронарнои трансплантации клеток
- Изменение функциональных показателей работы сердца крыс после трансплантации
- Морфологические изменения в других органах после острого инфаркта миокарда и трансплантации клеток костного мозга
Введение к работе
Актуальность проблемы
Крайне высокая распространенность сердечно-сосудистых заболеваний на сегодняшний день определяет актуальность изучения репаративной регенерации миокарда и методов, направленных на ее стимуляцию. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) занимает лидирующую позицию в структуре причин смертности населения в развитых странах мира и России [Агеев Ф.Е. и др., 2000, 2004]. Основными причинами развития ХСН являются ишемическая болезнь сердца (ИБС) и дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), в последнем случае ХСН отличается быстропрогрессирующим течением и неблагоприятным прогнозом [Шумаков В.И. и др., 2004]. В связи с этим существует необходимость в разработке принципиально новых методов лечения ХСН. Поэтому исследования в этом направлении имеют высокую медицинскую и социальную значимость.
Восстановительные процессы в миокарде обеспечиваются не только за счет образования рубца и гипертрофии сохранившихся кардиомиоцитов (КМЦ), но и участия резидентных и внесердечных прогениторных клеток [Bollini S. et al., 2001]. В репарации миокарда участвуют клетки крови, в том числе гемопоэтические и стромальные стволовые клетки, рециркулирующие из костного мозга [Dezawa M. et al., 2008]. По-прежнему остается неясным вопрос: обеспечивают ли эти клетки только реакцию стромы миокарда или все же они дифференцируются в КМЦ. Последнее предположение является основой концепции клеточной терапии миокарда, которая заключается в выделении и экспансии прогениторных клеток костного мозга и введении их в поврежденный миокард с целью замещения погибших КМЦ вновь образующимися [Dohmann H. et al., 2005, Behfar A. et al., 2010]. В работах многих авторов приводятся попытки доказать факт дифференцировки клеток костного мозга в КМЦ с помощью витального мечения и дифференцировочных маркеров [Perin E. et al., 2003, 2004, Ikegami Y. et al., 2010], но всегда остается открытым вопрос реутилизации метки и никогда нельзя исключить возможность слияния (fusion) клеток [Terada N. et al., 2002]. Поэтому сейчас самой распространенной, но убедительно не доказанной, является теория индукционной (паракринной) стимуляции регенерации при трансплантации прогениторных клеток костного мозга, которые, как известно, продуцируют большое количество цитокинов, факторов роста, дифференцировки, регулирующих репаративные процессы [Burchfield J.S. et al., 2008].
Недостаточно изученным является вопрос о влиянии экзогенных стволовых клеток на репарацию миокарда в отдаленные сроки после повреждения, в условиях постинфарктного кардиосклероза. Стоит ли нам ожидать кардиомиогенез после трансплантации клеток на данной стадии заболевания, когда микроокружение в области повреждения значительно отличается от такового в острый период и, вероятно, будет обусловливать иное поведение клеток.
Остается открытым вопрос: какие клетки костного мозга вносят больший вклад в репарацию миокарда, какой фенотип прогениторных клеток костного мозга лучше использовать для стимуляции репарации.
Несмотря на отсутствие четких представлений о механизмах репарации миокарда при трансплантации прогениторных клеток костного мозга, методы клеточной терапии миокарда активно изучаются в клинике и находятся на заключительных фазах клинических испытаний [Menasche P. et al., 2009]. Однако результаты, полученные в различных клинических исследованиях, неоднозначны и во многом противоречивы, и это обусловлено выбором неэффективных методов верификации результатов, неадекватных суррогатных точек для малых выборок и др.
Все вышесказанное свидетельствует об актуальности дальнейших исследований о роли прогениторных клеток костного мозга в репарации миокарда, что необходимо для разработки эффективных методов стимуляции регенерации.
Цель исследования – изучить участие трансплантированных интракоронарно различных типов прогениторных клеток костного мозга в репаративной регенерации миокарда при хронической сердечной недостаточности в эксперименте и клиническом исследовании.
Задачи:
-
Исследовать хоминг, выживаемость, локализацию, морфологию трансплантированных аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток костного мозга в сердце и других органах через 1 сутки, 2, 4, 8 нед. после введения при постинфарктном кардиосклерозе у крыс.
-
Определить направление дифференцировки трансплантированных аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток в условиях постинфарктного кардиосклероза.
-
Исследовать морфологию рубца в постинфарктном сердце через 2 и 4 недели после интракоронарного введения физиологического раствора, аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток.
-
Изучить динамику морфометрических параметров патологического ремоделирования левого желудочка через 2 и 4 недели после интракоронарного введения физиологического раствора, аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток.
-
Изучить неоангиогенез при репарации миокарда и участие в нем трансплантированных аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток.
-
Оценить возможные патоморфологические изменения в других органах, вызванные экспериментальным повреждением сердца и трансплантацией клеток.
-
Оценить изменения сократительной функции сердца после интракоронарной трансплантации аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток при постинфарктном кардиосклерозе у крыс.
-
Изучить безопасность и эффективность интракоронарной трансплантации аллогенных мультипотентных стромальных клеток при хронической сердечной недостаточности обусловленной дилатационной кардиомиопатией в пилотном клиническом исследовании.
Научная новизна
В настоящем исследовании изучена роль различных типов прогениторных клеток костного мозга в репаративной регенерации сердца при постинфарктном кардиосклерозе.
С помощью метода витального мечения трансплантированных клеток изучены направления миграции прогениторных клеток костного мозга. Показано, что даже после завершения воспалительных процессов в рубце сердца наблюдается хоминг клеток костного мозга. Количественно охарактеризовано распределение меченых клеток по органам при интракоронарной трансплантации клеток. Кроме сердца, клетки также активно заселяют селезенку, в печени и легких выявлены единичные меченые клетки.
Изучены направления дифференцировки трансплантированных клеток костного мозга в условиях экспериментальной модели постинфарктного кардиосклероза. Впервые были получены данные, свидетельствующие о дифференцировке трансплантированных в миокард клеток в фибробласты и миофибробласты. Полученные данные не подтверждают возможность дифференцировки клеток костного мозга в кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки при постинфарктном кардиосклерозе.
Трансплантация прогениторных клеток костного в отдаленные сроки после острого инфаркта миокарда, в условиях сформировавшегося кардиосклероза, обеспечивает стимуляцию фиброгенеза, но только в области рубца, и не приводит к экспансии фиброза в перифокальных зонах. Утолщение стенки левого желудочка в области рубца снижает напряжения на неповрежденные участки его стенки, что препятствует патологическому ремоделированию сердца.
Проведена сравнительная оценка безопасности и эффективности применения аутогенных нефракционированных мононуклеарных клеток и ауто- и алло-генных мультипотентных стромальных клеток костного мозга для лечения экспериментальной хронической сердечной недостаточности. Трансплантация аутогенных мультипотентных стромальных клеток обеспечивает стимуляцию ангиогенеза и обратного ремоделирования левого желудочка. Аллогенные мультипотентные стромальные клетки значительно уступают аутогенным по своей терапевтической активности, стимулируют ангиогенез и гипертрофию миокарда, не оказывая влияния на ремоделирование левого желудочка. По сравнению с мультипотентными стромальными клетками трансплантация мононуклеарных клеток неэффективна в отношении обратного ремоделирования левого желудочка.
Разработан протокол клинического исследования безопасности и эффективности аллогенной клеточной терапии больных хронической сердечной недостаточностью, обусловленной дилатационной кардиомиопатией, с тяжелым течением и неблагоприятным прогнозом. Предложенная тактика клеточной терапии оказалась безопасной в ближайший и отдаленный периоды наблюдения и приводит к снижению уровня мозгового натрий-уретического пептида и улучшению клинического состояния больных.
Научно-практическая значимость
Проведенное доклиническое исследование послужило экспериментальным обоснованием применения клеток костного мозга для лечения хронической сердечной недостаточности в клинической практике. Клиническое исследование продемонстрировало безопасность и эффективность предложенного метода клеточной терапии хронической сердечной недостаточности. В результате чего, было получено разрешение Минздравсоцразвития России на применение предложенного способа для лечения хронической сердечной недостаточности при дилатационной кардиомиопатии (Метод стимуляции репарации миокарда при дилатационной кардиомиопатии, ФС№2010/354 от 21 сентября 2010 г.).
Полученные научные данные о хоминге и направлениях дифференцировки клеток костного мозга при трансплантации в сердце при хронической сердечной недостаточности следует учитывать при разработке новых методов клеточной терапии.
Полученные данные могут быть использованы в процессе преподавания в вузах медицинского и биологического профиля по специальностям гистология, эмбриология, анатомия и патологическая анатомия.
Оригинальный способ интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации клеток может быть использован в научно-исследовательских разработках.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При постинфарктном кардиосклерозе ауто - и аллогенные прогениторные клетки костного мозга мигрируют в область повреждения, длительно выживают и не элиминируются иммунной системой после трансплантации. В сердце клетки костного мозга мигрируют в рубец, где они дифференцируются в фибробласты и миофибробласты и принимают участие в его формировании и перестройке, но не вызывают экспансию фиброза в перифокальных зонах.
-
В условиях постинфарктного кардиосклероза прогениторные клетки костного мозга, трансплантированные интракоронарно, не дифференцируются в кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки кровеносных сосудов.
-
Изолированные и культивированные аутогенные мультипотентные стромальные клетки обладают большими регенераторными потенциями по сравнению с аллогенными мультипотентными стромальными клетками и нефракционированными мононуклеарными клетками. Интракоронарная трансплантация аутогенных мультипотентных стромальных клеток приводит к стимуляции ангиогенеза и репаративных процессов миокарда, что проявляется в уменьшении дилатации левого желудочка, гипертрофии перифокального миокарда. Это обеспечивает улучшение функции сердца.
-
Интракоронарная клеточная трансплантация больным с тяжелой ХСН IIБ – III стадии при ДКМП является безопасным и эффективным методом лечения данного заболевания. При этом позитивный клинический эффект сохраняется в течение шести месяцев. Наиболее информативным критерием клинической эффективности клеточной терапии и эффективной суррогатной точкой является динамика уровня мозгового натрий-утретического пептида в плазме крови.
Внедрение в практику
Результаты проведенного исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на Кафедре гистологии и эмбриологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Российского национального исследовательского медицинского университета им. И.Н. Пирогова и Кафедре анатомии и гистологии животных ГБОУ ВПО Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина.
Степень личного вклада автора в результаты исследования
Механизмы стимуляции репарации миокарда при трансплантации клеток костного мозга
Несмотря на бурное развитие клеточных технологий и их внедрение в клиническую медицину, до сих пор отсутствуют четкие представления о механизмах терапевтической активности. Всеобщий ажиотаж в отношении стволовых клеток как панацеи от всех заболеваний привел к тому, что прикладные исследования развивались гораздо интенсивнее фундаментальных. В результате теперь клетки трансплантируют человеку при самых разных заболеваниях, имея лишь несколько до конца не доказанных гипотез механизма их действия.
Прежде чем перечислить основные предположения о механизмах терапевтической активности стволовых/прогениторных клеток, необходимо определить мишени, на которые они могут воздействовать при репарации миокарда. С большим приближением можно выделить три такие мишени: количество и жизнеспособность КМЦ; кровоснабжение миокарда; состояние рубцовой ткани.
Количество и жизнеспособность КМЦ можно регулировать двумя способами - ограничивать их гибель или обеспечивать появление новых КМЦ (или и то, и другое). Для репарации и оптимального функционирования миокарда необходимо стимулировать уровень кровоснабжения в оставшемся после ишемического повреждения миокарде, особенно в его гибернированных участках. Стимуляцию ангиогенеза при острой или хронической коронарной недостаточности вообще можно считать этиотропным лечением. Стимуляция ангиогенеза в рубце также оказывает положительное влияние на течение некоторых патологических процессов в сердце, в частности, на обратное ремоделирование ЛЖ. Состояние рубцовой ткани, кроме того, играет ключевую роль в процессах восстановления структуры и функции миокарда. Согласно представленным ниже гипотезам, СПК могут воздействовать на одну из этих мишеней или на все сразу.
Все обсуждаемые в литературе предположения о механизмах действия стволовых/прогениторных клеток можно разделить на две группы. В первую группу входят гипотезы, основанные на допущении замещения погибших КМЦ и клеток кровеносных сосудов трансплантированными клетками путем слияния или трансдиференцировки. Назовем его «заместительный механизм». Вторая группа включает все механизмы стимуляции репарации и ангиогенеза за счет синтеза и секреции СПК паракринных факторов, регулирующих различные процессы при воспалении и регенерации - «механизм паракринной индукции».
Среди клеток костного мозга только гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и МСК теоретически могут дифференцироваться в КМЦ. На сегодняшний день такие потенции уже не приписывают ГСК. МСК по-прежнему считают потенциальными предшественниками КМЦ. Во многих исследованиях как in vivo, так и in vitro показано, что МСК экспрессируют кардиоспецифические маркеры [Тота С. et al.,2002; Ikegami Y. et al., 2010] и транскрипционные факторы, ответственные за кардиомиогенез во время пренатального развитии сердца [Arminan A. et al., 2009; Gao L.R. et al., 2010.]. При добавлении в культуру МСК смесь «кардиогенных факторов» значительно увеличивает способность клеток к кардиомиогенезу («управляемый кардиопоэз») [Behfar A. et al., 2010]. Механическое раздражение или электростимуляция приводит к дифференцировке МСК в КМЦ [Ge D. et al., 2009; Genovese J.A. et al., 2009; Bhang S.H. et al., 2010]. Однако доказательства такой дифференцировки основываются на экспрессии специфичных маркеров, а не на соответствующих морфологических и функциональных изменениях в клетках (цилиндрическая форма, сократительный аппарат, ионные каналы, нексусы, спонтанные сокращения).
Makino S. и его коллегам в 1999 г. первым удалось получить из МСК клетки с характерной морфологией, спонтанно сокращающиеся в культуре. Но при этом исследователи воздействовали на эпигеном МСК путем деметилирования ДНК с помощью 5-азацитидина [Makino S. et al., 1999]. Впоследствии этот эксперимент многократно воспроизводили [Hattan N. et al., 2005]. По своим морфологическим и функциональным характеристикам и протеомному профилю полученные клетки полностью соответствовали КМЦ. Позднее было показано, что ацетилирование гистонов еще более эффективно меняет транскрипционный профиль МСК в сторону кардиомиогенеза [Feng С. et al., 200.9]. К сожалению, такое воздействие на эпигеном может привести к непредсказуемым последствиям в функционировании клеток, что ограничивает их использование у человека.
Применение некоторых факторов роста и цитокинов для индуцированной диффренцировки МСК, таких как ВМР-2, HGF, TGF-рЧ и др., приводит к экспрессии кардиоспецифических белковых маркеров [Forte G. et al., 2006; Li H. et al., 2006; Chang S.A. et al., 2008; Herrmann J.L. et al., 2010]. Описаны также и другие стратегии индуцированной дифференцировки, например, сокультивирование с КМЦ [Okamoto К. et al., 2007; Ventura С. et al., 2007; He X.Q. et al., 2010; Yang M.C. et al., 2010] или использование конденсированной культуральной среды или экстрактов КМЦ [Labovsky V. et al., 2010; Peran M. et al., 2010]. В то же время результаты, полученные одними учеными, не всегда воспроизводятся другими [Koninckx R. et al., 2009; Mastitskaya S., Denecke В., 2009; Mauney J. et al., 2010]. Несмотря на то, что применение преддифференцированных МСК некоторыми исследователями считается эффективнее трансплантации непредифференцированных [Shim W.S. et al., 2010], эффективных и безопасных способов индукции дифференцировки МСК в КМЦ так и не было найдено.
Доказательства дифференцировки МСК в КМЦ in vivo в миокарде по-прежнему являются неочевидными, так как базируются на выявлении витальной метки и дифференцировочных маркеров, что при гистологическом исследовании увеличивает вероятность ошибочного суждения. Многим ученым представляется маловероятной дифференцировка МСК в КМЦ под воздействием микроокружения поврежденного миокарда [Тота С. et al., 2002; Airey J.A. et al., 2004; Hattan N. et al., 2005]. Во многом дифференцировочные потенции определяются тем, какую популяцию МСК удалось выделить и нарастить исследователям. Как уже обсуждалось, различия в протоколах изолирования и наращивания МСК не позволяют утверждать, что разными исследователями использовались одни и те же клетки. В некоторых работах выделяют популяцию быстро пролиферирующих МСК, которые, по мнению авторов, могут дифференцироваться не только в клетки соединительнотканной ткани [Jiang Y. et al., 2002; Kogler G. et al., 2004; Yoon Y.S. et al., 2005; Lee R.H. et al., 2009]. По-прежнему, хотя и в меньшем количестве, но все же появляются публикации, где МСК после трансплантации демонстрируют чудеса пластичности, даже при ксеногенных трансплантациях [Tsuji Н. et al., 2010].
Таким образом, по данным литературы, если в условиях in vitro МСК могут дифференцироваться в КМЦ, то в условиях in vivo такое явление происходит крайне редко или не происходит вообще.
Техника подготовки и проведения экспериментальной модели постинфарктного кардиосклероза и трансвентрикулярной интракоронарнои трансплантации клеток
Забор костного мозга проводили у всех животных непосредственно перед операцией по моделированию ОИМ, т.е. за 30 суток перед введением трансплантата. Эксфузию выполняли под наркозом (кетамин + ксилазин, внутримышечно, в дозе 90-120 мг/кг + 10 мг/кг) путем пунктирования губчатого вещества болыпеберцовой костей обеих конечностей через полость коленного сустава. Для этого левой рукой сгибали лапку в области коленного сустава. Пальцем правой руки нащупывали щель коленного сустава и в центр суставной поверхности круговыми движениями вводили иглу шприца (на 20 мл) с тонким мандреном в игле. Направление иглы было параллельным кости. Когда игла входила в кость, убирали мандрен и соединяли иглу со шприцем со средой и гепарином и осуществляли эксфузию костного мозга. Процедуру повторяли многократно до получения 1 мл костномозговой взвеси. Полученную костномозговую взвесь в асептических условиях помещали в стерильные пробирки, содержащие транспортную среду DMEM/F12 с амикацином (500 мкг/мл) и гепарином (10 ЕД/мл) в объеме 7 мл и затем выделяли МНК и культивировали МСК.
Для изолирования ядросодержащих клеток (МНК) из костного мозга использовали стандартную методику [Perin Е.С., 2008]. Полученную костномозговую взвесь наслаивали на 3 мл раствора фиколла-урографина (ООО «ПанЭко») в стерильных 15 мл центрифужных пробирках. Пробирки центрифугировали при 1300 об/мин, 20 мин, 4 С. Супернатант собирали пипеткой, добавляли среду DMEM до 15 мл и снова центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин и удаляли супернатант.
Культура МСК была выделена и охарактеризована согласно стандартным протоколам Лаборатории стволовых клеток ЗАО «Реметэкс» [Ржанинова А.А. и др., 2003]. МСК культивировали на среде DMEM/F12 1:1, содержащей 2 шМ L-глутамина («РАА Laboratories») с 10% эмбриональной телячьей сывороткой («HyClone-Perbio») и 0,5 мг/мл амикацина («Синтез») при стандартных условиях (температура 37С, в атмосфере с 5% С02, в условиях насыщающей влажности). При экспансии МСК проводили не более четырех пассажей при низкой посевной плотности, известно, что при этом клетки сохраняют иммунофенотип и потенции к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях [Prockop D.J., 2009]. Полученные клетки замораживали партиями по 5-10 млн клеток в криозащитном растворе, содержащем 10 % высокоочищенный диметилсульфоксид и 90 % аутологичной сыворотки. Криопробирки помещали в программный замораживатель, где они подвергались охлаждению до - 80С со скоростью 1 /мин. После этого криопробирки помещали в емкость для хранения (сосуд Дьюара) и хранили в жидкой фазе азота до использования. Непосредственно перед трансплантацией МСК размораживали и отмывали от дебриса путем трехкратного центрифугирования.
Приготовление клеточного трансплантата Полученные МНК или МСК ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. В аликвоте подсчитывали количество клеток в камере Горяева. На основании подсчета полученное количество клеток разводили до концентрации 5 млн. кл./мл физиологического раствора. Жизнеспособность клеток определяли при окраске трипановым синим. При наличии более 10% погибших клеток суспензию отмывали от дебриса путем центрифугирования. Суспензии клеток для введения фасовали в соответствующие промаркированные пробирки и до введения хранили при температуре 5 ± 3С не более 3 ч. В качестве трансплантата в контрольной группе использовали 1 мл физиологического раствора. Приготовление девитализированного клеточного трансплантата Выделенные и криопрезервированные клетки размораживали на водяной бане при 37С. 5 мл клеточной суспензии переносили в 15 мл центрифужную пробирку, добавляли 5 мл физраствора, центрифугировали (10 мин, 1100 об/мин, +4С), удаляли супернатант. Осадок ресуспендировали в 5 мл 4% раствора формалина на фосфатном буфере и инкубировали 30 мин при 4С. Клетки центрифугировали (10 мин, 1100 об/мин, 4С), удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в 10 мл физраствора, центрифугировали повторно, и осадок ресуспендировали в 1 мл физраствора. В аликвоте подсчитывали количество клеток в камере Горяева. Нежизнеспособность клеток определяли при окраске трипановым синим. На основании подсчета полученное количество клеток разводили до концентрации 5 млн. кл./мл физраствора. Животным, указанным в Таблице 1, вводили клетки, как живые, так и девитализированные, которые непосредственно перед трансплантацией метили красной флуоресцентной мембранной меткой РКН26 (Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, Sigma). Для этого клеточную суспензию промывали раствором цефазолина в Хэнксе (1 мг/мл), центрифугировали (10 мин, 1100 об/мин, +4С), промывали раствором цефазолина в Хэнксе, центрифугировали (5 мин, 1100 об/мин, +25С), к осадку добавляли 0,5 мл растворителя С. К 0,5 мл приготовленного раствора РКН26 (2 мкл стока РКН26 в 0.5 мл растворителя С) добавляли 0,5 мл полученной суспензии клеток, перемешивали и инкубировали, встряхивая, 2-3 мин при +25С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 1% раствора БСА и инкубировали 1 мин. Суспензию разводили 2 мл раствора цефазолина в Хэнксе и центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин. Клеточный осадок переносили в другую пробирку и дважды промывали 10-15 мл раствора цефазолина в Хэнксе с последующим центрифугированием (10 мин, 1100 об/мин). Осадок разводили в 1 мл физиологического раствора. В аликвоте подсчитывали количество клеток в камере Горяева. На основании подсчета полученное количество клеток разводили до концентрации 5 млн. кл./мл физраствора.
Контроль правильности приготовления трансплантата При приготовлении трансплантата для введения каждый раз проводили анализ концентрации клеток. Концентрация клеток определялась методом прямого подсчета в камере Горяева. Количество клеток в костном мозге подсчитывали в двадцати пяти квадратах камеры Горяева в предварительно лизированном растворе для удаления эритроцитов. В качестве лизата использовали 4%-ый раствор уксусной кислоты. Разводили суспензию в 20 раз (400 мкл уксусной кислоты + 20 мкл суспензии). Формула для подсчета клеток:
Изменение функциональных показателей работы сердца крыс после трансплантации
После операции по моделированию инфаркта миокарда с 1 по 9 день эксперимента погибло от 13,8 до 27,6% оперированных животных в разных группах (Табл. 9). После трансвентрикулярного интракоронарного введения максимальное количество животных погибло при трансплантации аллогенных МСК, но различия с контрольной группой не достоверны (z-тест, р 0,05). Животные погибали непосредственно сразу после процедуры введения или через 1-2 дня, что вероятно связано с тяжестью процедуры, выполняемой при двукратном пережатии аорты. Кроме того, гибель животных отмечали и после теста на толерантность к физическим нагрузкам, что также, вероятно, связано с тяжестью клинического состояния животных и самой процедуры.
Предложенная экспериментальная модель постинфарктного кардиосклероза и интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации характеризуется значительной инвазивностью. Животные как опытной, так и контрольной групп тяжело переносили многократные воздействия: двукратный общий наркоз, интубацию, искусственную вентиляцию легких, эксфузию костного мозга, ОИМ, катетеризацию сонной артерии, пережатие аорты, функциональные тесты, поэтому высокая смертность животных была непосредственно связана с хирургическими манипуляциями. Особенно тяжело животные переносили интракоронарное трансвентрикулярное введение клеток и физиологического раствора. Двукратное, хотя и краткосрочное, пережатие аорты у некоторых животных на фоне постинфарктного кардиосклероза вызывало критическое увеличение преднагрузки, желудочковые аритмии, иногда несовместимые с жизнью, что приводило к клинической смерти и требовало реанимационных мероприятий. Учитывая, что смертность животных была одинаково высокой как при введении клеток, так и физиологического раствора, можно утверждать, что смерть наступала на фоне стресса от инвазивных хирургических манипуляций, а не от трансплантации клеток.
Толерантность к физическим нагрузкам, определяемая по продолжительности плавания животных, является количественным показателем состояния функциональных систем организма, в особенности сердечно-сосудистой. После введения физиологического раствора продолжительность плавания животных значительно не изменялась через 14 и 30 суток после трансплантации по сравнению с исходными показателями (Табл. 10, Рис. 4). После трансплантации МНК у животных также не увеличивалась толерантность к физическим нагрузкам. Улучшение функционального состояния сердечно-сосудистой системы наблюдали после трансплантации как аутогенных, так и аллогенных МСК.
На Рис. 5 представлены выборочные ЭКГ непосредственно до трансплантации (30 дней после инфаркта). Картины и соответственно, параметры ЭКГ как до трансплантации, так и после были достаточно разнообразны: отмечали подъем сегмента ST, характерный для острой стадии инфаркта, патологическую волну Q, уменьшение зубца R и отрицательный коронарный зубец Т, характерный для стадии рубцевания. Через 4 недели после введения МНК было отмечено уменьшение продолжительности зубца Т по сравнению со значением до введения и значением в контрольной группе (Табл. 11). Учитывая, что при субэндокардиальной ишемии может наблюдаться гигантский зубец Т, уменьшение продолжительности Т в нашем исследовании можно оценивать как показатель уменьшения зоны ишемии после введения клеток. Также через 2 и 4 недели после введения клеточного трансплантата наблюдали увеличение амплитуды зубца Р по сравнению со значением до введения (30-й день после моделирования инфаркта). Через 2 недели после введения амплитуда Р была достоверно выше также по сравнению с контрольной группой. Следует отметить, что изменение зубца Р в картине постинфарктной ЭКГ нехарактерно, но рост зубца Р может наблюдаться при увеличении правого предсердия. Вероятно, в нашем исследовании это связано с развитием легочной гипертензии при постинфарктном кардиосклерозе.
При трансплантации аутогенных МСК через 4 недели отмечали уменьшение амплитуды зубца R по сравнению с исходным значением в этой группе. Однако, каких либо достоверных различий параметров ЭКГ по сравнению с контрольной группой обнаружено не было.
Через 2 и 4 недели после аллогенных МСК отмечали уменьшение амплитуды зубца R и зубца Т по сравнению с исходными значениями в этой группе. Но достоверных различий с контрольной группой также обнаружено не было.
Во всех группах непосредственно сразу после введения трансплантата, как клеток, так и физиологического раствора у многих животных развивались разного рода аритмии (предсердная, желудочковая тахикардии, фибрилляция, и др.), иногда несовместимые с жизнью (Рис. 6).
Морфологические изменения в других органах после острого инфаркта миокарда и трансплантации клеток костного мозга
Разработанный метод трансвентрикулярной интракоронарной трансплантации клеток без рентгенологического контроля локализации катетера является эффективным и обеспечивает доставку клеток в ткани сердца мелких лабораторных животных. На сегодняшний день интракоронарный способ введения клеток считают оптимальным, так как по эффективности доставки он соответствует интрамиокардиальному, но является гораздо менее инвазивным [Freyman Т. et al., 2006]. Кроме того, нами показано, что даже при неселективном введении в правую и левую коронарные артерии клетки оказываются только в области повреждения миокарда, а не распределяются равномерно по всем тканям сердца, как в других исследованиях [Perin Е.С. et al., 2008]. Локализация трансплантированных клеток в зоне рубца указывает на их хоминг в зону повреждения. При интракоронарном введении клетки мигрируют в зону с повышенной концентрацией цитокинов и хемоатрактантов, усиливающих их миграцию в поврежденную ткань. Высокая концентрация хемоатрактантов сохраняется и через месяц после ОИМ, поэтому клетки в соединительной ткани, по-видимому, принимают участие в формировании рубцовой ткани. Ранее было показано, что клетки-предшественники мигрируют в зону с повышенной концентрацией хемоаттрактантов, в частности SDF-1 (stromal-derived factor), усиливающих их миграцию в поврежденную ткань [Askari А.Т. et al., 2003].
Трансплантированные клетки попадают в большой круг кровообращения, но при этом преимущественно заселяют органы кроветворения, в частности селезенку, а не печень и легкие, как это происходит при внутривенном введении [Grogaard Н.К. et al., 2007; Hale S.L. et al., 2007]. При этом в селезенке клетки преимущественно локализуются в красной пульпе, и массивный хоминг клеток в селезенку обусловлен теми же механизмами, так как селезенка как орган кроветворения является естественной нишей введенного клеточного трансплантата. Трансплантированные клетки, по всей видимости, сохраняли жизнеспособность в течение всего наблюдения и не элиминировались иммунной системой. Во-первых, о жизнеспособности клеток свидетельствует сам факт хоминга, во-вторых, на срезах клетки, несущие флуоресцентную метку, имели вид неповрежденных, в-третьих, вокруг трансплантированных клеток не было выявлено выраженной лимфо-макрофагальной инфильтрации. При окраске гистологических препаратов МАТ к маркеру макрофагов (CD68), макрофаги были выявлены как в контрольной, так и в опытных группах. Единичные клетки, возможно, элиминировались макрофагами, о чем свидетельствует окрашивание МАТ некоторых флуоресцентномеченых клеток, но при этом не было выявлено морфологических признаков реакции отторжения трансплантата. В миокарде клетки были локализованы только в рубцовой ткани, они имели характерную веретеновидную форму и располагались между коллагеновыми волокнами. Учитывая характер распределения клеток по органам и их морфологию, можно предположить, что в сердце мигрировали и там приживались в большей степени МСК, представленные во всех вариантах клеточных трансплантатов, а гемопоэтические клетки (CD34+) мононуклеарной фракции мигрировали с кровотоком в селезенку и другие органы кроветворения. Одним из основных вопросов при изучении роли клеток костного мозга в репарации миокарда является возможность этих клеток дифференцироваться в специализированные клетки сердца. Могут ли стромальные или гемопоэтические клетки предшественники дифференцироваться в КМЦ, клетки кровеносных сосудов или другие немышечные клетки? In vitro показана возможность дифференцировки и тех и других в КМЦ, эндотелий, гладкомышечные клетки и др. однако в условиях in vivo возможность этого не очевидна и по-прежнему обсуждается. В многочисленных исследованиях, где демонстрируют превращение незрелых клеток костного мозга в специализированные клетки сердца, основываются на выявлении в этих клетках дифференцировочных маркеров КМЦ, эндотелия и тд. Но при этом следует помнить, что наличие того или иного маркера совершено не обусловливает факт превращения прогениторной клетки, например, в функционально активный рабочий КМЦ. По нашему мнению, обязательными критериями трансдифференцировки клеток костного мозга в специализированные клетки должны быть локализация и морфология этих клеток, которые очень часто совсем не учитываются. В нашем исследовании все меченые клетки независимо от варианта трансплантата выявляли только в толще рубцовой ткани. При этом клетки располагались между пучками коллагеновых волокон и имели веретеновидную или полигональную форму (Рис. 24, В, Г). Как видно на микрофотографии, среди клеток рубцовой ткани лишь незначительная часть несет флуоресцентную метку, остальные также располагаются между коллагеновыми волокнами и по морфологии не отличаются от меченых клеток. В результате исследований было показано, что прогениторные клетки костного мозга не дифференцируются в рабочие КМЦ. Не было выявлено ни одного рабочего КМЦ, который в составе своей мембраны или цитоплазмы имел бы флуоресцентную метку. В перифокальном миокарде меченые клетки выявляли только в окружающей КМЦ соединительной ткани (Рис. 25, А, В). Ни одной меченой клетки не было обнаружено в области неповрежденного миокарда (Рис. 25, С, D). При такой локализации и морфологии, даже если меченые клетки положительно окрашивались МАТ к дифференцировочным маркерам КМЦ (тропонин I, коннексин 43 и др.), можно утверждать, что трансплантированные клетки в течение 2 месяцев опыта не дифференцировались в функционирующие рабочие КМЦ.
Во всех опытных группах меченые клетки не выявляли в составе стенок новообразованных кровеносных сосудов рубцовой ткани. Независимо от типа и калибра кровеносного сосуда в их внутренней и средней оболочках не было обнаружено ни одной меченой клетки (Рис. 26). Меченые клетки можно было видеть в составе адвентициальной оболочки, но в этих случаях отсутствовала четкая граница между адвентицией и окружающей сосуд соединительной тканью. Это позволяет утверждать, что трансплантированные прогениторные клетки костного мозга не принимают участия в образовании новых кровеносных сосудов рубцовой ткани, не дифференцируются ни в эндотелиальные, ни в гладкомышечные клетки. Трансплантированных клеток также не было выявлено в составе кровеносных сосудов неповрежденного миокарда.
