Введение к работе
Актуальность исследования
Несмотря на существенные успехи в лечении опухолевых заболеваний, они продолжают занимать одно из первых мест среди болезней, приводящих к летальному исходу (Canmstra, 1993) Не вызывают сомнения данные о том, что в большинстве случаев на первых этапах лечения достигается положительный химиотерапевтический эффект Однако выздоровление наступает только у незначительной части больных (Berek et al, 1999) Поэтому усилия многих научных групп направлены на изучение молекулярно-генетических механизмов, ответственных за чувствительность и резистентность опухолей к фармакологическим препаратам, используемым в онкологической практике Идентифицирована большая группа генов, которые ответственны за чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам разного механизма действия Среди них особое место занимают гены, продукты которых участвуют в контроле клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК и апоптоза Внимание к ним закономерно, так как, с одной стороны, нарушение их экспрессии приводит к нежелательной пролиферации клеток, а с другой - они вовлекаются в ответ клеток на повреждающее или антипролиферативное действие лекарственных препаратов
Открытие супрессора опухолевого роста - белка р53,
нарушение функции которого обнаруживается более чем в 50%
опухолей человека (Hams, 1996), закономерно сделало
первостепенным изучение его роли в ответе опухолевых клеток на
химиотерапевтические воздействия Накоплен большой
экспериментальный материал о связи статуса р53 (дикий или мутантный) в разных типах опухолей с их чувствительностью к цитостатикам разной природы, показанных для терапии данных типов опухолей Однако эти данные крайне противоречивы По-видимому, это связано с существованием множества различных типов мутаций в гене р53, а также наличием полиморфизма Наиболее распространенной и изученной является замена 347G/C, приводящая к замене 72 R/P в области, богатой пролином (Malashewski et al, 1987)
Показано, что чувствительность клеток к различным воздействиям зависит от сочетания полиморфизма и мутаций в гене -\/'
р53, однако эти данные также противоречивы (Bergamaschi et al, 2003, Concin et al, 2005) Вероятно, что в некоторых типах опухолей сочетание 72/R с мутациями в коровом домене приводит к большей резистентности, чем сочетание 72/Р с теми же мутациями Высоко вероятно, что это может быть следствием взаимодействия мутантного р53 с другим, открытым позже белком р73 (Kaghad et al, 1997), продуктом гена, также принадлежащего семейству р53 Из первичного продукта транскрипции гена р73 в результате альтернативного сплайсинга 5'- и 3'-концов и альтернативного полиаденилирования формируется ряд изоформ р73, которые проявляют в отношении р53 разнонаправленную модулирующую активность (Melmo et al, 2002)
Анализ накопленных данных позволяет считать, что ответ опухолевых клеток является специфичным, как для данного типа клеток, так и для данного фармакологического вещества, и связан со специфическими факторами данной клетки, которые могут изменять функции белков семейства р53
Цель и задачи исследования.
Целью исследования было изучение роли белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих и противоопухолевых агентов, а также в регуляции событий клеточного цикла, апоптоза, репарации генетических повреждений и ангиогенеза
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи
Исследовать способность опухолевого-супрессора/?55 в клетках, полученных из опухолей разного тканевого происхождения (яичников, кишечника, легких), блокировать клеточный цикл и индуцировать апоптоз в ответ на генотоксический стресс
Изучить вклад полиморфизма гена р53 в сочетании с «горячими» точковыми мутациями р53 в реализацию ответа клеток на генотоксический стресс
3 Определить, в какой степени экспрессия транскрипционного
фактора р73а в опухолевых клетках может влиять на экспрессию
генов-мишеней р53, и какие новые гены вовлекаются в клеточный
ответ при повышенной экспрессии/?73а
4 Оценить вклад ключевых генов-мишеней, индуцируемых р73а, в
репарацию генетических повреждений в клетках опухолей
яичников при действии ДНК-повреждающих факторов
5 Установить роль р73 в регуляции генов, ответственных за
ангиогенез и васкуляризацию опухолей in vivo Выяснить, каким
образом изоформы р73, в частности DNp73a, не обладающие
транскрипционной активностью, влияют на клеточные процессы,
связанные с ангиогенезом
6 Использовать данные о статусе и экспрессии генов р53 и р73 в
опухолях различного тканевого происхождения в качестве
прогностического критерия при выборе наиболее адекватного и
эффективного лечения онкологических заболеваний
Научная новизна. Впервые обнаружено новое свойство
опухолевого супрессора р53 в контроле клеточного цикла клеток
опухолей яичников, связанное со способностью р53 индуцировать
блок в фазе G2/M, помимо известной ранее способности вызывать
блок G1/S после действия повреждающих агентов Впервые
показано, что описанная как р53-зависимая активация гена
p21/wafl, может происходить на уровне транскрипции в отсутствие
р53, в частности после обработки клеток ингибитором
топоизомеразы 2а доксорубицином Впервые показано, что
опухолевый супрессор р53 может ингибировать транскрипцию
промотора гена топоизомеразы 2а Ингибирование транскрипции
не связано с определенными специфическими
последовательностями в промоторе гена Торо2а Показано, что р73 может конкурировать с р53 за специфические сайты связывания в промоторах генов, отвечающих после активации р53 повышением уровня транскрипции В связи с тем, что р73а, является более слабым активатором транскрипции, он может ингибировать транс-активирующее действие р53 Впервые выявлено плейотропное действие р73а на клетку Показано, что р73а способен индуцировать экспрессию генов ХРА, XPD и XPG, участвующих в эксцизионной репарации, усиливая, таким образом, защитные системы клетки С другой стороны, р73а может влиять на васкуляризацию опухолей посредством регуляции факторов ангиогенеза, таких как VEGF и TSP-I Повышенная экспрессия/)73а способствует повышению содержания проангиогенного фактора VEGF и снижению антиангиогенного фактора TSP1, что приводит к увеличению числа кровеносных сосудов in vivo Впервые
продемонстрирован новый механизм транскрипционной активации гена р73, который связан с вытеснением транскрипционного фактора- супрессора С/ЕВРа с промотора гена р73 при обработке клеток доксорубицином
Научно-практическое значение Данные о чувствительности и резистентности опухолевых клеток к ряду противоопухолевых препаратов, опосредованные генетическими модификациями генов семейства р53 и р73, могут быть использованы в клинической практике для разработки новых подходов в лечении опухолей Проведенные нами исследования показали, что присутствие активного р53 в клетках опухолей яичников может приводить к большей их резистентности к ингибитору топоизомеразы 2а -доксорубицину, что открыло принципиально новые свойства р53, ранее не описанные в литературе Это позволяет говорить о сложной зависимости окончательного эффекта действия химиотерапевтических препаратов этой группы от экспрессии р53 Сходные выводы были сделаны нами при исследовании повреждающего действия таксола, ингибитора веретена митоза, широко применяемого в клинике Впервые было обнаружено, что инактивация р53 приводит к большей лекарственной чувствительности клеток Эти данные предполагают возможность успешного лечения группы опухолей, которые лишены нормальной экспрессии р53 Цисплатина - агент, широко использующийся при лечении опухолей и вызывающий повреждения ДНК, может быть одинаково активен независимо от статуса р53 Показано, что мутантный р53 меняет ответ клетки на стресс в зависимости от типа мутации в ДНК-связывающем домене и от вида полиморфизма Pro/Arg в кодоне 72 Кроме того, эффективность повреждающего действия зависит от типа химиотерапии
В клетках опухолей яичников экспрессия р73а приводит к повышеннию эксцизионной репарации Это свойство повышает резистентность клеток к обработке цисплатиной и УФ Таким образом, присутствие р73а, в некоторых типах опухолей может служить в клинике индикатором резистентности клеток Помимо этого, нами показано, что усиленная экспрессия р73а в опухолях может способствовать ангиогенезу и предполагает возможность эффективного лечения с помощью ингибиторов ангиогенеза
Имеют большое научно-практическое значение данные, что изоформа р73а, не имеющая домена, ответственного за транскрипционную активацию и являющаяся репрессором р53 и р73 (так называемая доминантно-негативная форма p73DNd), присутствующая во многих опухолях, не снижает чувствительность клеток к действию повреждающих агентов Изоформаp73DNa сама по себе не достаточна для формирования резистентного фенотипа В целом, наши данные предполагают, что ответ опухолевых клеток специфичен, однако зависит от многочисленных клеточных факторов Результаты работы свидетельствуют о необходимости индивидуального подхода при лечении опухолей и могут быть использованы в лекционных курсах в различных институтах РАН, РАМН и университетах
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Одна из основных функций опухолевого супрессора р53
заключается в его способности регулировать транскрипцию
широкого спектра генов, продукты которых участвуют в регуляции
событий клеточного цикла, вызывая блоки G1/S и G2/M
клеточного цикла после действия повреждающих агентов
2 р53 является репрессором промотора гена Топоизомеразы 2а,
вовлеченного в изменения топологии ДНК и играющего
критическую роль во время митоза р53 контролирует цикл не
только путем активации, но и путем репрессии генов
3 Ингибитор циклин-зависимых киназ p21/wafl, являющийся
основной мишенью р53 и принимающий участие в реализации
блока G1/S после действия повреждающих агентов, может
индуцироваться в опухолевых клетках по р53-независимому
механизмы
4 Экспрессия р53 может быть причиной резистентности
опухолевых клеток к ДНК-повреждающим агентам различного
механизма действия, таким как к доксорубицин и таксол Р53 не
может расцениваться, как решающий клеточный фактор,
определяющий программу гибели опухолевых клеток при стрессе
5 Мутации гена/755 не исчерпывают всех изменений белка, так как
р53 существует по-крайней мере в двух полиморфных формах р53
72Pro/Arg Клетки, экспрессирующие р53 72/R и несущие мутацию
R249S, могут обладать повышенной резистентностью к
доксорубицину
6 р73а конкурирует с р53 за гены-мишени, причем экспрессия/?73а
может быть причиной резистентности опухолевых клеток к
некоторым типам химиотерапии р73а индуцирует ангиогенез
путем активации проангиогенного фактора VEGF и репрессии
антиангиогенного фактора TSP1, что приводит к повышенной
васкуляризации опухолей га vivo р73а может при некоторых
условиях повышать онкогенез клетки
ДНК-повреждающие агенты индуцируют р 73 на уровне мРНК и белка В промоторе р73 выявлен сайт негативной регуляции гена фактором С/ЕВРа, который при обработке клеток доксорубицином меняет ядерную локализацию на цитоплазматическую
Доминантно-негативная форма р73а, представляющая собой изоформу р73а с делетированным транс-активирующим доменом, не меняет ответ клетки на обработку противоопухолевыми препаратами
Апробация работы. В ходе выполнения работы ее результаты регулярно обсуждались на лабораторных семинарах фармакологического института "Марио Негри", а также на многочисленных международных симпозиумах на международном Симпозиуме «In vitro Cytotoxicity Mechanisms», Рим, 1999, на VII международной конференции по клинической фармакологии и терапии, Флоренция, 2000, на зимнем митинге EORTC, Лейчестер, 2000, на международных конференциях AACR в Новом Орлеане, 2001 и в Бостоне в 2003, на Международных митингах по р53 Крит, 1998, Барселона, 2002 и Дундин, 2004, на конференции по р73/р63, Рим 2002 и 2004 Апробация диссертации была на совместном семинаре нескольких лабораторий в Институте цитологии РАН (декабрь 2006 г)
Работа проводилась при финансовой поддержке Итальянской Ассоциации Исследования рака (AIRC), Национальным Советом Рима, проектом CNR, финансируемым АСРО, фондом Nerraa and Mario Mattioti, грантом Итальянского Министерства Здоровья, Фондом CARIPLO и другими Итальянскими грантами
Публикации по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 24 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 9 докладов на международных конференциях и съездах
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 41 рисунок Диссертация содержит 167 наименований цитируемой литературы
