Содержание к диссертации
Введение
1. Процесс прикрепления хромосом к микротрубочкам веретена деления .
1.1 Организация митотического веретена деления 9
1.2 Инициация взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами митотических хромосом 10
1.3 Передвижение хромосом во время прометафазы 14
1.4 Динамика микротрубочек веретена деления в процессе митоза 17
2. Механизм передвижения митотических хромосом.
2.1 Роль белков-биологических моторов в процессе передвижения хромосом 19
2.2 Турновер микротрубочек в процессе передвижения хромосом 23
3. Значение взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами в регуляции митотической прогрессии.
3.1 Точка перехода митоза 28
3.2 Сборка компонентов системы точки перехода на кинетохоре 32
3.3 Динамика компонентов митотической точки перехода 36
4. Кинетохорассоциированный белок Е (CENP-E).
4.1 Роль белка CENP-E в передвижении хромосом во время митоза 40
4.2 Роль белка CENP-E в регуляции расхождения хромосом 42
Материалы и методы.
1.Полимеразная цепная реакция и ПЦР-мутагенез 45
2. Культивирование клеточных линий HeLa, HeLa GFP Н2В 7.1 и HeLa GFP сс-тубулин...48
3. Трансформация клеток HeLa и иммуноокрашивание слайдов 48
4. Микроиньекции ДНК и цейтраферная фотосъемка 49
5. Реакция трансляции in vitro 50
6. Исследование способности связывать микротрубочки 50
7. ПААГ и иммуноблоттинг 51
8. Реакция иммунопреципитации и киназная реакция 51
9. Анализ состояния клеточного цикла 52
Результаты и обсуждение.
1. Восстановление полноразмерной копии кДНК гена CENP-E, создание кшРНК CENP-Е экспрессирующего вектора pSHAG3xFLAG и кшРНК резистентной аллели ммСЕЫР-Е126б2аа 58
2. Значение каждого из микротрубочко-связывающих доменов для функционирования CENP-Ein vivo 64
2.1 ЫН2-терминальмый микротрубочко-связывающий домен 65
2.2 СООН-термипальный микротрубочко-связывающий домен 69
2.3 Эффекты потери двух микротрубочко-связывающих доменов 72
3. Значение фосфорилирования CENP-E в процессе митоза 74
4. Оценка напряженности на кинетохорах сестринских хромосом при нарушении микротрубочкосвязывающей активности CENP-E или его регуляции 78
5. Функциональные основы взаимодействия CENP-E с киназой митотической точки рестрикции 80
Выводы 90
- Передвижение хромосом во время прометафазы
- Сборка компонентов системы точки перехода на кинетохоре
- Трансформация клеток HeLa и иммуноокрашивание слайдов
- Значение каждого из микротрубочко-связывающих доменов для функционирования CENP-Ein vivo
Введение к работе
Существование биологических видов, а, следовательно, и феномена жизни как такового, целиком зависит от точности передачи генетической информации как по вертикали - от организмов родителей к потомкам, так и по горизонтали - от одной соматической клетки к другой в процессе онтогенетического развития многоклеточных организмов. Для правильной передачи генетической информации исключительно важны как основные механизмы функционирования главной генетической системы, обеспечивающие воспроизведение генетической информации путем удвоения молекул ДНК - системы репликации; так и молекулярные механизмы, обеспечивающие расхождение удвоившихся хромосом между дочерними клетками у про - и эукариот в процессах митоза и мейоза. Учитывая тот факт, что 2,5x10 клеток человека подвергаются делению в каждый данный момент времени, появление хотя бы одной ошибки в данном процессе повлечет за собой возникновение множества генетически анормальных клеток на протяжении жизни индивидуума в целом.
В процессе деления клетка подвергается комплексу высоко организованных морфологических изменений, которые привлекают внимание биологов больше 100 лет, со времен открытия Вальтером Флемингом в 1882 году процесса, названного митозом. Основное событие митоза - это разделение реплицированных хромосом на две эквивалентные и чаще всего, физически обособленные клетки. Точность расхождения хромосом определяется сложными механическими процессами, главными из которых являются выравнивание и сегрегация хромосом, для правильного протекания которых необходимо прикрепление хромосом к веретену деления. Прикрепление - процесс стохастический, при этом хромосомы прикрепляются к микротрубочкам посредствам прямых столкновений. Это объясняет, почему хромосомы подвергаются выравниванию у клеточного экватора несинхронно, а также свидетельствует о необходимости наличия системы специального контроля - так называемой точки рестрикции (точки перехода митоза) (МТР).
Система точки рестрикции в клетках млекопитающих представлена эволюционно-консервативной группой белков, которая контролирует взаимодействие кинетохора и микротрубочек, предотвращая переход клетки в состояние анафазы при наличии невыравненных у клеточного экватора хромосом и, как следствие, появление в популяции клеток с неравномерным распределением генетической информации - анеуплоидов. Генетические и биохимические исследования выявили мишень митотической точки рестрикции - это макрокомплекс циклосом, известный также как Anaphase Promoting Complex (АРС/С), являющийся мультисубьединичной убиквитин-зависимой протеазой, подвергающей деградации такие ключевые митотические белки, как секурин и циклинВ, обуславливая тем самым расхождение хромосом и завершение митоза (Maiato et al., 2004; Rieder and Salmon, 1998). Ингибирование АРС/С осуществляется комплексом белков митотической точки рестрикции, получившим название MCC (Mitotic Checkpoint Complex), через взаимодействие с субстратом АРС/С - Cdc20.
Впервые выявленные в дрожжевых клетках белки МТР являются высоко консервативными в эволюционном плане. Гомологи дрожжевых BUB1, BUB3, MAD1, MAD2, MAD3 и Mpsl белков были идентифицированы у высших организмов, где также была показана их роль в регуляции митотической точки рестрикции. Характерной чертой представителей этой группы белков является их локализация на кинетохоре, где, как предполагается, они регулируют активность последних в процессе выстраивания хромосом. Наличие в клетке неприкрепленного к микротрубочкам веретена деления кинетохора вызывает увеличения плотности сигнала белков МТР на подобной хромосоме, что еще раз подтверждает, что белки митотической точки рестрикции чувствительны к взаимодействию кинетохоров и микротрубочек. На этапе, когда хромосома достигает состояния метафазного выравнивания, такие белки точки перехода как MAD1 и MAD2 полностью покидают кинетохоры, в то время как сигнал BUB1 и hBUBRl уменьшается в несколько раз(Спап, 2003; King et al., 2000а).
Расхождение хромосом осуществляется и отчасти контролируется белками-биологическими моторами, локализующихся на кинетохорах клетки. Представителем данной группы является кинезиноподобный Centromere-associated Protein Е (CENP-E) белок, обеспечивающий формирование контакта между кинетохором и микротрубочками (МТ). В структуре данного белка отмечают два микротрубочко-связывающих домена, расположенных на NH2- и СООН-концах, роль которых на сегодняшний день остается до конца не изученной; кинетохорсвязывающий домен, а также домен взаимодействия с белками митотической точки рестрикции, в частности киназой hBUBRl. Функциональные исследования CENP-E показали, что активность этого белка регулируется системой митотической точки рестрикции. Так, клетки HeLa с делецией CENP-E-гена подвергаются аресту или существенной задержке в митозе. Молекулярная связь CENP-E с системой точки рестрикции была показана на примере прямого взаимодействия данного белка с hBUBRl киназой, гомологичной MAD3 и BUB1 белкам точки рестрикции почкующихся дрожжей. И что наиболее важно, было показано, что митотический арест, индуцируемый отсутствием CENP-E, зависит от киназной активности hBUBRl. Учитывая все вышеприведенные результаты и тот факт, что hBUBRl также локализуется на кинетохоре, можно предположить, что CENP-E и hBUBRl являются неотъемлемой частью механосенсерного комплекса, который связывает функционирование кинетохоров и системы точки рестрикции.
В данной работе будут рассмотрены некоторые из аспектов функционального значения доменной структуры белка CENP-E, механизмы регуляции его активности и определена роль взаимодействия данного белка с белками митотической точки рестрикции, в частности киназы hBUBRl. Всесторонняя оценка активности данного белка в процессе митоза позволит использовать его в качестве избирательной мишени при лечении онкологических заболеваний (автору представляется, что потеря клетками данного CENP-E вызывает арест быстро делящихся раковых клеток), а также внесет вклад в понимание механизма атипичных митозов.
Цель и задачи работы. Цель данной работы - изучить роль белка CENP-E в процессах прикрепления кинетохоров сестринских хроматид к микротрубочкам веретена клеточного деления, хромосомной конгрессии и прохождения митотической точки рестрикции в делящихся культивируемых клетках млекопитающих (HeLa). Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Восстановить полноразмерную 8 кб кДНК копию гена CENP-E из имеющихся перекрывающихся фрагментов. Показать in vitro и in vivo, что полученная в процессе работы кДНК гена CENP-E является функциональным гомологом эндогенной формы.
2. Используя технологию pSHAG (короткошпилечных интерферирующих РНК) для ингибирования активности эндогенного белка, оценить in vivo роль каждого из двух микротрубочкосвязывающих доменов CENP-E в процессе митоза и эффект удаления двух МТсвязывающих доменов одновременно. Описать значение АТФ-азной активности МН2-терминального района CENP-E в процессе внутриклеточного турновера данного белка.
3. Используя технологию pSHAG, описать значение фосфорилирования CENP-E киназами MPF (комплексом циклина В и cdc2) и МАР р38 в процессе регуляции активности кинетохорсвязанного пула белка CENP-E на протяжении митотического цикла клетки. 4. Картировать район взаимодействия CENP-E и киназы митотической точки рестрикции hBUBRl и охарактеризовать in vivo роль подобного взаимодействия для завершения клеткой митотического деления.
Передвижение хромосом во время прометафазы
В процессе прометафазы наблюдается ассоциация растущих концов кинетохоных МТ веретена деления и кинетохоров сестринских хроматид. Описание передвижений прометафазных хромосом исторически проводилось на клеточных линиях, содержащих большие по размеру хромосомы (Rieder and Salmon, 1998). В подобных клетках хромосомы на начальном этапе прометафазы прикрепляются только к одному из полюсов деления, причем этом процесс носит случайный характер. Подобное прикрепление хромосомы называют моноориентированным (фиолетовая хромосома на рис 2). Со временем второй кинетохор хромосомы прикрепляется к МТ противоположного полюса деления, и такая хромосома становится биориентированной. Прикрепление сестринских кинетохоров к одному и тому же полюсу (синтелическое прикрепление) деления процесс маловероятный в нормальных условиях, хотя и описанный. Этому препятствует само расположение сестринских кинетохоров относительно друг друга, а также тот факт, что механически прикрепление двух кинетохоров к одному полюсу нестабильно в силу причин, рассмотренных нами ниже. Моноориентированная хромосома часто продвигается в сторону полюса деления, к которому она прикреплена, скользя по поверхности МТ со скоростью 10-25 мкм/мин, что значительно превышает скорость расхождения хромосом в анафазе. Подобное передвижение осуществляется при участии белков фиброзной короны кинетохоров - переплетенных фибрилл, экспонирующихся над поверхностью кинетохоров (см рисі). Подобные структуры хромосом выявляются на стадии раннего митоза, становясь более выраженными при деполимеризации МТ (Wittmann et al., 2001). Такие белки-биологические моторы, как динеин и CENP-E локализуются на фиброзной короне кинетохоров(\Уогс1етап et al., 1991), определяя значимость подобной структуры в процессе передвижения хромосом (Yaoetal., 1997). Продвижение моноориентированной хромосомы к одному из полюсов деления рано или поздно сменяется движением в противоположном направлении, и хромосома возвращается в зону клеточного экватора (красная хромосома на рис 2). Как правило, это совпадает с взаимодействием свободного кинетохора с МТ противоположного полюса деления, однако в редких случаях подобное явление было описано для моориентированных хромосом (Tippit et al., 1980). Чередование передвижения хромосомы в сторону полюса деления и зону клеточного экватора вызывает хромосомные осцилляции (Rieder et al., 1986)-прометафазный феномен, проявление которого сильно варьирует не только среди представителей различных организмов, но и среди хромосом одной клетки.
Применение световой микроскопии показало, что во время продвижения хромосомы к полюсу деления происходит растяжение центромерного материала (Skibbens et al., 1993), что говорит о приложении МТками определенных сил к кинетохорам, что обеспечивает напряженность. Под напряженностью кинетохора следует понимать изменение (уменьшение или увеличение) расстояния в центромерном районе между сестринскими хроматидами одной хромосомы вследствие приложения физических сил к хромосоме через прикрепление или отщепление МТ. Электронный анализ кинетохоров на стадии прометафазы выявил множество кинетохорассоциированных МТ (кМТ), плюс концы которых заякореваются во внешней пластинке кинетохора. Как было упомянуто выше, вслед за образованием билатерального прикрепления хромосомы передвигаются в район клеточного экватора в процессе, получившем название конгрессии. Конгрессия хромосом во время митоза носит адаптационный характер и служит для пространственного выстраивания всех хромосом в одну стартовую линию, что необходимо для последующей сегрегации всех хромосом клетки одновременно (Nicklas and Arana, 1992). Иногда конгрессия сопровождается хромосомными осцилляциями. Чередование передвижений к полюсу или экватору, имеющих приблизительно одинаковую скорость, но разную продолжительность, отталкивает хромосому в сторону клеточного экватора (Skibbens et al., 1993). При этом полюс-направленное движение одного их кинетохоров активирует экватор-направленное передвижение сестринского. Манипуляции с лазерным микрооблучением (Skibbens et al., 1995) или микроиглами (Skibbens and Salmon, 1997) поддерживают представление о том, что биориентированная хромосома представляет собой механическую систему, внутри которой сила, приложенная к одному из кинетохоров, изменяет поведение сестринского кинетохора. В процессе сегрегации, когда происходит разделение ДНК внутри продвигающейся биориентированной хромосомы, экватор- направленное продвижение нивелируется, доказывая тем самым, что МТ неспособны отталкивать хромосому к экватору (Khodjakov and Rieder, 1996), и силы, регулирующие этот процесс скрыты в самой хромосоме (см ниже). Таким образом, динамичность взаимодействия кМТ и кинетохоров гарантирует точность расхождения хромосом. 1.4 Динамика МТ веретена деления в процессе митоза. Вслед за образованием связей между кинетохорами и МТ веретена деления, все аспекты передвижения хромосомы должны соотносится с элонгацией или деполимеризацией МТ, что привязывает внутриклеточную динамику МТ к процессу деления (Васильев, 1999). Кинетика турновера МТ веретена деления in vivo изучалась с применением двух методов -измерение скорости диссоциации веретена деления под воздействием фармакологических средств, блокирующих полимеризацию МТ (Salmon et al., 1984), и подхода фотоотбелевания - высвечивания небольшого участка тубулина, помеченного флуорохромом, и определение скорости восстановления флуоресцентного сигнала (Saxton et al., 1984). Оба этих исследования показали, что время полужизни полюсных МТ составляет 30 секунд. Подобный результат вероятнее всего объясняется динамической нестабильностью плюс концов МТ. В то время как турновер кинетохорных МТ происходит с гораздо меньшей cKopocTbio(Gorbsky et al., 1988), так как они находятся в стабильном состоянии за счет формирования связей с кинетохорами(СогЬ5ку and Borisy, 1989).
Сайты ассоциации новых субъединиц тубулина с МТ веретена деления были охарактеризованы с использованием следующих методов исследования - инъекции меченного тубулина в клетки и отслеживание мест его аккумуляции (Wise et al., 1991); насыщение веретена деления тубулином, конъюгированного фотоактивирующимся флуорохромом, позволяет локализовать местоположение тубулина при испускании импульса света (Mitchison and Salmon, 1992); а также инъекции очень маленького количества меченного тубулина и наблюдение за передвижениями стахостически распределенных сайтов с высокой интенсивностью сигнала (Waterman-Storer and Salmon, 1998). Все эти эксперименты показали, что кМТ (заякореваются на кинетохорах) аккумулируют и теряют тубулин преимущественно с плюс конца. В экспериментах in vivo было показано, что скорость деполимеризации кМТ значительно ниже таковой у свободных МТ, однако их скорости полимеризации сравнительно одинаковы (Hunt and Mcintosh, 1998). Несколько серий исследований свидетельствует о том, что продвижение кМТ в сторону полюса деления может осуществляется за счет деполимеризации полюспроксимальных минус концов, сбалансированной аккумулированием субъединиц тубулина на плюс концах (Mitchison, 1989). Этот феномен, получивший название тредмиллинга, полностью зависит от процесса полимеризации МТ и напоминает прогулку по беговой дорожке. При не которых промежуточных концентрациях свободных молекул тубулина в среде МТ могут находиться в своеобразном стационарном состоянии, в котором на плюс конце преобладает связывание мономеров и деполимеризация - на минус. Вследствие этого образующие МТ молекулы все время перемещаются в ней от одного конца к другому, и при этом суммарная длинна МТ не меняется. Стало известно, что этот процесс не затрагивает работы кинезинподобных белков, таких как EBl(Sawin and Mitchison, 1994), передвигающих МТ относительно друг друга, поэтому локализация подобных белков на полюсе скорее всего отражает их физическое перемещение за время тредмиллинга, чем их функциональное действие (см ниже). Явление тредмиллинга не описано для дрожжевых клеток (Maddox et al., 2000). Таким образом, в ходе митоза передвижение хромосом в значительной степени определяется процессам полимеризации/деполимеризации МТчек.
Сборка компонентов системы точки перехода на кинетохоре
Сигналом сборки белков МТР на кинетохоре является отсутствие или наличие недостаточного числа кМТ. На этом этапе кинетика связывания белков МТР и кинетохора является очень быстрой. Так время восстановления после фотоотбелевания флуоресцентного MAD2 составляет 24-28 секунд (Howell et al., 2000). В свою очередь факторы, которые уменьшают динамику связывания белков МТР, на сегодняшний день до конца не охарактеризованы. Доказанной в этом процессе считается роль прикрепления МТ и развития напряженности на кинетохорах. Изначально прерогатива отдавалась процессу связывания МТ, как механизму контроля МТР, однако напряжение на кинетохоре, возникающее вслед за биполярным прикреплением хромосомы, увеличивает как стабильность так и число кМТ. Из чего следует, что на данный момент оценить относительный вклад каждого из этих процессов достаточно сложно. Роль процесса прикрепления МТ в выключении сигнала МТР демонстрируется на примере диссоциации белка MAD2 с кинетохоров, присоединяющих Мтки (Waters et al., 1998). Низкие концентрации нокадазола, вещества деполимеризирующего МТ, приводят к аккумулированию MAD2 на кинетохорах только неприкрепленных хромосом. Микроиньекции антител к MAD2 нивелируют блок МТР, и подобные клетки выходят из митоза. Кроме того, дрожжи, содержащие мутации в белках когезии, неспособны к развитию напряженности, но поддерживающие билатеральное прикрепление, не подвергаются аресту в митозе (Guacci et al., 1997b). Все это лишний раз доказывает способность MAD2 как члена МТР регулировать процесс прикрепления хромосом. Роль напряженности в процессе инактивации МТР изучалась в экспериментах на сперматоцитах крыс (Li and Nicklas, 1995; Nicklas et al., 1995). Единственная моноориентированная хромосома в данных клетках задерживала наступление анафазы на несколько часов, однако экспериментальное приложение силы к данной хромосоме вызывало быстрый переход в анафазу. Использование низких концентраций некоторых ядов, стабилизирующих МТ, приводило к накаплению белков МТР на кинетохорах, хотя структура веретена деления не претерпевала никаких изменений (Zhou et al., 2002). Использование препарата монострола, вызывающего образование монополярного веретена деления, не влияет на способность МТ связывать кинетохоры, однако вследствие дефекта структуры веретена деления напряженность не может быть достигнута, что вызывает арест клетки в митозе.
Как следует из выше приведенных примеров, напряженность на кинетохоре и количество прикрепленных МТ сопряжено контролируются белками МТР. Подтверждение данному заключению было получено в экспериментах последних лет. Было продемонстрировано, что клетки HeLa в отсутствие кМТ и напряженности на кинетохорах включают разные ветви MTP(Skoufias et al., 2001). Добавление наномолярных концентраций винбластина в среду вызывает потерю напряженности на кинетохоре и активацию сигнала МТР через киназы BUB1 и BUBR1, но не MAD2. Дальнейшее увеличение концентрации винбластина в среде вызывает распад МТ, что приводит к диссоциации связи МТ и кинетохоров, вслед за чем происходит активация МТР через аккумуляцию MAD2 белка. В подтверждение этому в экспериментах iv vitro было показано, что рекомбинантный hBUBRl не требует присутствия MAD2 для ингибирования АРС/С (Tang et al., 2001). Микроманипуляции с хромосомами в сперматоцитах кузнечика выявили промежуточную стадию в прикреплении кМТ - при ослабевании напряженности на кинетохоре, некоторые кМТ диссоциировали с внешней пластинке кинетохора, вызывая уменьшение силы сцепления кинетохора и МТ веретена деления. При этом с подобного кинетохора происходила диссоциация сигнала MAD2 (Nicklas et al., 2001). Приложение дополнительной напряженности путем микроманипуляций приводит резкому увеличению числа МТ и полной диссоциации MAD2 с кинетохоров. Взаимодействие между двумя процессами - прикреплением МТ и напряженностью -является основополагающим механизмом, в котором сложно вычленить вклад каждого из компонентов в активацию сигнала МТР. Однако последние исследования показали, что киназа Aurora В может являться связующим звеном в регуляции напряженности и взаимодействия между кинетохором и МТ. В исследованиях на дрожжах было показано, что мутантные клетки с нереплицированными хромосомами вследствие наличия дефекта в гене cdc6 или хромосомы с дефектами в системе белков когезии (mcdl), подвергаются аресту в митозе вследствие отсутствия напряженности на кинетохоре, хотя хромосомы остаются прикрепленными к МТ (Biggins and Murray, 2001). Данный арест обуславливается активностью Ірії киназы. Существует предположение что данная киназа способна отслеживать напряженность (Tanaka et al., 2002), являясь частью комплекса самоконтроля, предотвращающего прикрепление пары сестринских кинетохоров к одному и тому же полюсу деления. Данное синтелическое прикрепление распознается Ірії и при этом киназа катализирует отсоединение одного кинетохора от полюса деления. Иными словами, киназа Ірії способна опосредованно активировать сигнал МТР на кинетохоре с пониженной напряженностью, катализируя при этом деполимеризацию МТ. Данная гипотеза позволяет объяснить почему Ірії не является необходимой для митотического ареста, индуцированного потерей взаимодействия с МТками. Ірії дрожжей способна фосфорилировать как структурные компоненты кинетохора NdclOp (Biggins et al., 1999b), так и комплексы Ndc80/Daml (Cheeseman et al., 2002). При этом фосфорелирование компонентов Ndc80 дестабилизирует взаимодействие кинетохоров и кМТ, а дефосфорилирование -стабилизирует (Shang et al., 2003). В исследованиях на клетках млекопитающих было показано, что ингибирование Aurora В киназы (гомолог Ірії дрожжей) предотвращает арест клеток в митозе в присутствие в среде таксола (вызывает отсутствие напряженности), но не нокадазола (вызывает уменьшение количества МТ на KHHeToxope)(Ditchfield et al., 2003; Hauf et al., 2003). Механизм, с помощью которого Aurora В осуществляет контроль напряженности, на сегодняшний день неясен, но то, что этот белок локализуется между сестринскими кинетохорами, говорит о том, что данная киназа может быть чувствительна к физическому растягиванию центросомного материала. Еще одно важное наблюдение, полученное в этой серии экспериментов, указывает на то, что ингибирование функций Aurora В предотвращает связывание MAD2 и hBUBRl с кинетохором (Hauf et al., 2003). Однако это порождает некое несоответствие, почему клетки при отсутствии Aurora В способны поддерживать арест в присутствии нокодазола и выходят из митоза при наличии таксола, хотя считается, что в отсутствие Aurora В неоккупированные МТками кинетохоры неспособны запустить сигнал МТР.
Возможным объяснением подобного явления может служить тот факт, что коллективный сигнал МТР от неоккупированных кинетохоров в присутствии нокадазола достаточно мощный для поддержания ареста клеток, в ситуации же с таксолом кинетохоры прикрепляются к МТ и при этом мощность сигнала МТР падает, что позволяет клеткам выходить из митоза. Как было рассмотрено выше, кинезин МСАК контролирует как процесс формирования веретена деления, так и процесс исправления ошибочных взаимодействий между кМТ и кинетохором. Фосфорилирование данного белка, осуществляемое Aurora В, ингибирует его способность к деполимеризации МТ (Andrews et al., 2004). Сложные конфирмационные перестройки, вызванные добавлением или нивелированием фосфата, обуславливают перемещение МСАК на внешнюю или нижнюю пластинки кинетохора, чем обеспечивается включение или выключение его активности. Таким образом, на сегодняшний день принято выделять две ветви сигнала МТР -киназа hBUBRl вовлечена в передачу сигнала при уменьшении напряженности на кинетохоре, а белок MAD2 в свою очередь является чувствительным к изменению числа МТ. Из выше приведенных примеров, следует, что напряженность и количество прикрепленных кинетохоров тесно взаимосвязаны - так нокдаун белка CENP-E из клетки вызывает уменьшение напряженности на кинетохоре, однако при этом уменьшается стабильность связывания МТ, т.е. напряженность стабилизирует связь кинетохора и МТ. В дополнение, ни hBUBRl, ни MAD2 не могут супрессировать активность АРС независимо друг от друга. Из чего следует сделать вывод, что напряженность и количественное взаимодействие кинетохора клетки с МТ в действительности тесно взаимосвязаны и представляют собой две стороны одной медали.
Трансформация клеток HeLa и иммуноокрашивание слайдов
Клетки HeLa являются линией клеток, выделенной из эпителиальной аденокарциномы шейки матки пациента. Для проведения исследований данные клетки, полученные из банка АТСС (номер в каталоге CCL-2, США), культивировались в среде DMEM с добавлением 2мМ L-глютамина, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 1мМ пирувата и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), при 37С в присутствии 5% С02. Для культивирования клеток линий HeLa, содержащих GFP-форму гистона Н2В (HeLa GFP Н2В 7.1) и HeLa, содержащих GFP-форму сс-тубулина (HeLa GFP сс-тубулин) (любезно предоставленных проф. С. Яблонски, США) в вышеописанную среду дополнительно добавлялся антибиотик G418 до конечной концентрации 300 мгл/мл. Линия клеток РСЗ, полученная в клеточном банке АТТС (нормер в каталоге CRL-1435, США) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% ФБС, L-глютамина, 100мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. З.Трансфекция клеток HeLa и иммуноокрашивание клеток. Клетки HeLa культивировались на предметных стеклах 22x22 мм в среде DMEM, содержащей 10% ФБС при 37С в присутствии 5% С02 в течение 15 часов перед постановкой трансфекции. Для трансфекции клеток PEI трансфицирующим peareHTOM(Slgma, США) использовалось 2 мкг ДНК согласно протоколу фирмы-производителя и среда OptiMEM (Gibco, США). По прошествии двух часов после постановки трансфекции клетки отмывались от ДНК- PEI комплекса, и среда заменялась на DMEM. Через 48 часов трансфицированные клетки фиксировались в растворе 3,5% параформальдегида/lxPBS, рН 6.8 в течение 7 мин при КТ и затем фиксировались экстрагировались при использовании KB буфера (50 тМ Tris-HCl, рН 7.4, 150 тМ NaCl, 0.1% BSA), содержащего 0.2% Triton Х-100 в течение 5 минут на комнатной температуре (КТ), отмывались в течение 5 минут в KB буфере. Наличие в трансфицированных клетках FLAG-рекомбинантного белка определялось с помощью FLAG-моноклональных или поликлональных антител (Sigma, США). Белки МТР (hBUBRl,MADl) окрашивались с помощью поликлональных кроличьих антител, полученных в лаборатории проф. Тима Ена (Chan et al., 1998). Выявление паттерна экспрессии белка CENP-E производилось с помощью как поликлональных (Schaar et al., 1997), так и моноклональных антител (Yen et al., 1991), полученных в лаборатории проф. Тима Ена. МТ окрашивались с помощью моноклональных антител к сс-тубулину (Sigma, США). Для окрашивания центромер использовалась сыворокта больных аутоиммунной склеродермией (ACA)(Earnshaw et al., 1986). Все антитела использовались в конечной концентрации 1 мкг/мл. Ядра клеток и хромосомы выявлялись с использованием 0,1 мкг/мл 4 ,6 -диаминофенилиндола (ДАПИ). Клетки анализировали под микроскопом Nikon Microphot SA с использованием эпифлуоресцентной оптики. Все фотографические изображения были сделаны с использованием объектива 100xNA1.4 и видеокамеры 512F CCD (Dage-MTI).
Анализ изображений производился с помощью пакета программ Metaview (Nicon, США). 4. Микроиньекции ДНК и цейтраферная фотосъемка. Клетки линий HeLa, содержащие GFP-форму гистона Н2В и HeLa, содержищие GFP-форму а-тубулина культивировались на решетчатых 3.5 см чашках со стеклянным дном (MatTek Согр.США) в DMEM среде, с добавлением 10% ФБС и G418 при 37С в присутствии 5% С02 в течение 15 часов до момента проведения микроиньекции. Для проведения микроиньекции ДНК разводилась до конечной концентрации 20 нг/мкл и смешивалась с флуоресцирующим красителем Dextran red в сочетании 9:1. Микроиньекции ДНК производились с использованием полуавтоматического инжектора (модель 5412, Eppendorf Scientific, 1пс,США) и автоматического микроманипулятора (модель 5402 Eppendorf Scientific, Іпс.США). В течение следующих двух дней культивирования производилась синхронизация инъецированных клеток при добавлении в среду ЗН-тимидина до конечной концентрации 2мМ и последующей отмывкой (двойной тимидиной блок). На третий день G1/S синхронизированные инъецированные клетки после последней отмывки культивировались в HEPES DME с добавлением 10% ФБС. Примерно через 6 часов после смены среды клетки переносились в предварительно нагретую до 37С камеру спиндискового микроскопа (Perkin Elmer, США) для проведения цейтраферной фотосъемки с использованием масляного объектива 60xNA1.4. Съемка производилась каждые 5 минут на протяжении 16 часов с использованием RGB фильтра. Время экспозиции 250 мсек. Зернистость изображений - 2. 5. Реакция трансляции in vitro. Фрагменты CENP-E91"1600 п0" дикого типа и содержащий мутации в АТФсвязывающем домене были получены в процессе проведения ПЦР реакции с использованием праймеров 5 -GAATTCCATATGGCGGAGGAAGGAGC-3 и 5 - GGATCCTCTAGAGCCTCAAATTC-3 , содержащие на концах Ndel и BamHI сайты, соответственно. Полученные ПЦР продукты были проклонированы в вектор рЕТЗа (Novagen), что позволило использовать их для проведения реакции трансляции in vitro. 1 мкг каждой из плазмидных линеаризованных ДНК использовался для проведения одной реакции трансляции с использованием набора TNT Т7 Coupled Reticulocyte Lysate System согласно протоколу фирмы-производителя (Promega,ClllA) в присутствие 358-метионина. б.Исследование способности связывать микротрубочки. 50мМ тубулин свиньи полимеризовался в РЕМ буфере (ОДмМ Pipes, 1mm MgS04, 2mM EGTA, pH=6.9) в присутствие 20мкМ таксола и 2мМ GTP в течение 20 минут на 37С. После этого для отмывки несвязавшегося тубулина производилось центрифугирование образца в течение 10 минут 100 000 g при КТ с использованием ротора TLA 100.2 (Backmen США). Осадок ресуспендировался в РЕМ буфере, содержащим 20мкМ таксола, 2мМ GTP, 2мМ дитиотреитола(ДТТ) и 4мМ MgS04 на 37С в течение 30 минут. Полученные ЮмМ МТ использовались для проведения исследования способности связываться с МТками с использованием 3 мкл продуктов каждой трансляции in vitro, что согласно предполагаемой производителями оценке составляет 80 нг рекомбининтного белка. Образцы, содержащие CENP-E1 503 аа- рекомбинантный белок дикого типа и содержащий мутации в АТФ-связывающем домене, ЮмМ МТ, 20мкМ таксол, 2мМ GTP, 2мМ дитиотреитол (ДТТ), 4мМ MgS04 в отсутствие или присутствие ЮмМ АТФ, инкубировались в общем объеме 30 мкл РЕМ буфера при 37С в течение 30 минут. После чего образцы наслаивались на равный объем 4М глицериновой подушки (приготовленной на РЕМ буфере, содержащем 2 мМ GTP, 20мкМ таксол и 2мМ ДТТ) и центрифугировались 30 минут на 50 000g при КТ. Супернатант после центрифугирования ресуспендировался в 5 х буфере для внесения ПААГ (200MMTris-HCL (рН 6.8), 400тМ (3-меркаптоэтанол, 4% SDS, 0.01% бромфеноловый синий, 40% глицерин). Осадок промывался РЕМ буфером и ресуспендировался в 30 мкл 1х буфера для внесения ПААГ. Анализ образцов проводился с использованием 4%-20% градиентных ПААГ гелей методом радиографии. 7. ПААГ и иммуноблоттинг.
Анализ белков проводился с использованием 7,5%, 10% или 4-20% градиентных полиакриламидных гелей. Трансфицированные клетки HeLa лизировались в NP40 лизирующем буфере (50 mM Tris-HCl, рН 8.0, 150 тМ NaCl, 1% NP40, 1 тМ PMSF, и 10 мкг/мл ингибиторы протез [леупептин, апротинин и пепстатин]), и центрифугировались 16,000 g в течение 15 мин на 4С. Концентрация белка определялась с помощью ВСА protein assay (Pierce Chemical Co.). Перенос осуществлялся на мембрану PVDV (Millipore, США). Поликлональные антитела к CENP-E использовали в разведении 1:5,000 в 5% БСА. Моноклональные антитела к тубулину использовали в разведении 1: 4000 в 5% растворе БСА. Поликлональные антитела к hBUBRl и моноклональные антитела к белку FLAG (Sigma, США) использовали в разведении 1:1,000 в 5% растворе БСА. 8. Реакция иммунопреципитации и киназная реакция. Киназа hBUBRl очищалась при помощи реакции иммунопреципитации из нативных лизатов, синхронизированных в Gl/Зфазе клеток HeLa , с использованием соответствующих поликлональных антител. Для этого клетки лизировались в NP40 лизирующем буфере, очищались через центрифугирование на 10,000 g при 4С в течение 15 минут. Концентрация белка определялась с использованием набора ВСА protein assay (Pierce Chemical Co, США). Для проведения реакции иммунопреципитации использовалось 500 мкг клеточного лизата, поликлональные антитела разводились до конечной концентрации 2 мкг/мл. Рекомбинантные формы CENP-E дикого типа или содержащие определенные мутации иммунопреципитировались из лизатов трансфицированных клеток HeLa по сходной методике с использованием моноклональных FLAG антител. Для проведения киназной реакции после отмывки частиц, полученных в реакции иммунопреципитации, в ЫР40-лизирующем буфере, производилась их дополнительная отмывка в буфере lxKB (50mM Tris-HCL рН=7,4, ЮтМ MgCL2, ЮтМ ( -глицерофосфат).
Значение каждого из микротрубочко-связывающих доменов для функционирования CENP-Ein vivo
Как было сказано ранее, CENP-E имеет два биохимически различных МТ-связывающих домена - первый МТ-связывающий район охватывает 540 ИШ-терминальных а.а. и содержит АТФ связывающий домен. Второй располагается в СООН-терминальном конце и содержит 554 а.а., при этом делеция последних 99 их них полностью нивелирует МТ-связывающую активность. При ингибировании внутриклеточной активности CENP-E различными способами (инъекции антител, применение миРНК и тд) было отмечено появление дефектов выравнивании хромосом (появление фенотипа Брюса Шара), оказавшихся в процессе образования веретена деления пространственно в непосредственной близости от полюса деления, вследствие потери МТ-связывающей активности белка (двух МТ-связывающих районов одновременно)(Спап et al., 1998). Однако на данный момент времени не было описано функциональное значение каждого из МТ-связывающих доменов в процессе митоза, в частности в процессе образовании связей между МТ и кинетохорами, а также создании напряженности на кинетохорах сестринских хроматид. Для проведения исследований в данном направлении была использована полноразмерная копия CENP-E, проклонированная в вектор PSHAGFLAGMMCENP-E1 2662 " дикого типа. Методом ПЦР-мутагенеза были получены определенные мутации как в NH2, так и СООН-терминальных МТ-связывающих доменах CENP-E. 2.1 NH2-mepMUHaribMbiu МТсвязывающий домен. Способность белка CENP-E перемещаться вдоль МТ опосредована его АТФ-связывающим доменом, расположенным на NH2-терминальном конце. Было показано, что присоединение к одной из головок димера CENP-E молекулы АТФ изменяет пространственную конформацию последней таким образом, что она оказывается перенесенной в пространстве относительно МТки. После происходит диссоциация АТФ на АДФ до пирофосфата, при этом связь белка и АДФ является энергетически невыгодной, и головка в скором времени высвобождается, оказываясь перенесенной в пространстве. Последующее присоединение данной головки к МТ обуславливает продвижение белка вдоль поверхности МТ на один шаг. На следующем этапе вторая головка CENP-E атакуется новой молекулой АТФ. Как мы видим, для активного (не следует забывать про явление тредмиллинга) передвижения CENP-E вдоль поверхности МТ необходима работа Ш2-терминального АТФ-связывающего района, однако in vivo не было показано, является ли он единственно необходимым, равно как не был оценен вклад этого домена в процесс выравнивания хромосом. В ранних исследованиях на Xenopus было продемонстрировано, что Нетерминальный АТФзависимый домен CENP-E способен передвигаться в направлении плюс концов МТ (в сторону экватора)(\Уоо(1 et al, 1997). Эти данные напрямую совпадают со структурными исследованиями МН2-терминального домена CENP-E, показавшими его сходство с такими кинезинами, обладающими положительно полярностью, как HsEg5 и HsKHC(Garcia-Saez et al., 2004).
Однако данные, полученные с использованием очищенного из клеточных лизатов CENP-E свидетельствуют о минус-направленной активности (Thorower et al., 1995). С другой стороны, более поздние функциональные исследования данного белка не обнаружили никакой моторной активности (DeLuca, 2001). Известно, что независимо от своих биохимических свойств 1ЧН2-терминальный домен является необходимым для правильного функционирования CENP-E in vivo. Так клетки, трансфицированные, лишенным МН2-терминального МТсвязывающего домена, проявляют сходные дефекты выравнивания хромосом, как и в случае полной делеции CENP-E(Schaar et al., 1997). Для ответа на вопрос о значимости КН2-терминально МТсвязыващего домена для функционирования CENP-E in vivo было предложено эксперссировать полноразмерную рекомбинантную форму белка с нарушенной АТФсвязывающей активностью. На первом этапе работы Ш2-терминальный участок CENP-E1 503 ак# был использован в качестве матрицы для проведения ПЦРмутагенеза с использованием пар праймеров TJY1182 и TJY1183, продукт которого содержал замену двух аминокислот в АТФ-связывающем домене Р-петли (замена GXXXXGGK91 на GXXXXGVE91a.a), после чего данный мутантный вариант и дикая форма CENP-E были проклонированы в FLAG-экспрессирующий и РЕТЗа векторы. Для оценки АТФсвязывающей активности рекомбинантного белка FLAGCENP-E1 503 ак было произведено исследование его способности связывать МТ с использованием продуктов реакции трансляции in vitro. Рекомбинантные белки дикого типа и содержащий мутации в АТФ-связывающем районе, полученные в ходе проведения реакции трансляции in vitro, инкубировались с полимеризованными таксолом МТками в отсутствие или присутствие ЮмМ АТФ. Затем производилось ультрацентрифугирование образцов, и белки, связавшиеся с МТ, выпадали в вместе с ними в осадок. Как показали результаты подобного исследования (см рис 10, Б), рекомбинантная форма CENP-E91"1600"-0 дикого типа является чувствительной к наличию АТФ в среде, и при таких условиях не связывается с МТ (однако, при отсутствии в среде АТФ белок способен связывается с МТ), в то время как рекомбинантный белок, содержащий мутацию в АТФ-связывающим районе не реагирует на присутствие АТФ - процент белка, связывающегося с МТ независимо от присутствия или отсутствия АТФ, остается неизменным (см рис 10, Б). Фенотип клеток, трансфицированных FLAG рекомбинантной Ш2-терминальной CENP-E1"503 ак формой белка дикого типа отличается от такового для клеток, трансфицированных рекомбинантной формой, содержащей мутации в АТФ-связывающем районе (NMT). В последнем случае внутриклеточное распределение FLAG-сигнала привносимого белка, ассоциированого с МТ, является нечувствительным к наличию в среде АТФ, что было подтверждено методом иммунофлуоресценции с применением антител к а-форме тубулина (см рис 10, А), в то время как дикая форма белка диффузно распределена в цитоплазме клеток (в данном случае рекомбинантный белок лишен кинетохорсвязывающего района, расположенного на МН2-конце белка). Данные результаты лишний раз свидетельствуют о том, что МТ-связывающая активность белка CENP-E тесно сопряжена с его АТФ-связывающем доменом, нарушения в структуре которого отражаются на способности рекомбинантного белка связываться с МТ веретена деления, изменяя при этом внутриклеточный турновер. На следующем этапе работы мутация, нарушающая структуру АТФ-связывающего района, была получена в полноразмерной копии кДНК CENP-E и проклонирована в вектор pSHAG3xFLAG для получения PSHAG3XFLAGMMCENP-E .
При трансфекции клеток HeLa данным конструктом отмечалось увеличение количества клеток в митозе (МИ=13%) при наличии в них множественных дефектов выравнивания хромосом. Распределение трансфицированных клеток по фазам митоза указывает на накопление их в метафазе (59% от общего числа трансфицированных клеток, находящихся в митозе) (см рис 15). Было отмечено, что в трансфицированных клетках на начальных стадиях митоза рекомбинантный белок связывается с кинетохорами, однако к моменту вступления клетки в метафазу большая часть белка перемещается на полюса деления, вызывая дефекты присоединения МТ. В частности в трансфицированных клетках на этапе метафазы было отмечено появление фенотипа Брюса Шара и фенотипа фрагментации полюсов деления (появление клеток с тремя и более (до восьми) полюсами деления, содержащими множественные моноориентированные хромосомы (подтверждено методом иммунофлуоресценции при использовании антител к тубулину (см рис 10 В)). Мы считаем, что появление мутантных фенотипов обуславливается процессом тредмиллинга рекомбинантного белка с кинетохоров к полюсам, оказавшись у которых мутантный CENP-E не способен диссоцировать в цитоплазму вследствие отсутствия способности связывать молекулы АТФ. При этом локальное увеличение белка в сотни раз на полюсах вызывает их физическое разделение, в то время как отсутствие белка ни кинетохорах вызывает дефекты выравнивания хромосом (связывания МТ). Подтверждение подобному предположению было получено при проведении цейтраферной фотосъемки. В ответ на возникновение анормального фенотипа трансфицированных клеток происходит активация сигнала внутриклеточной МТР. Так, на несвязанных с МТ кинетохорах выявлено увеличение плотности сигнала таких белков МТР, как hBUBRl и MAD1. Увеличение активности МТР обуславливает арест трансфицированных клеток в митозе, что отражается в увеличении МИ популяции (см рис 10В). При этом распределение клеток по фазам митоза говорит о накоплении клеток в метафазе с доминирующим фенотипом фрагментации веретена деления (см рис 15).
