Введение к работе
Актуальность проблемы. Фундаментальным биологическим процессом, осуществляемым цитоскелетом, является деление клетки. Для его выполнения цитоскелет проходит собственный цикл, принимая различные конфигурации соответственно своим изменяющимся функциям на каждой стадии деления. Растительная клетка отличается от животной многообразием структур цитоскелета, сменяющих друг друга в ходе клеточного цикла. Это кортикальные спирали, радиальные пучки, препрофазное кольцо, веретено деления и фрагмопласт (Goddard et al., 1994). В клетках животных и низших эукариот выделяется специальная морфологическая структура, регулирующая процессы динамики цитоскелета в митозе и называемая центросомой, клеточным центром, полюсным организатором веретена. В клетках высших цветковых растений центросома не идентифицирована в качестве морфологической структуры. Концепция центросомы как ключевого фактора в регуляции основных морфологических процессов деления эукариотной клетки была предложена еще Т. Бовери (Boveri, 1901) и активно поддержана Д. Мэзия. Мэзия предложил для растительной клетки теорию «гибкой центросомы» как совокупности мелких микрорубочко-организующих частиц, линейно соединенных между собой гипотетической лентообразной структурой. Изменение конформации этой структуры и определяет, по мнению Мэзия, переход от одной цитоскелетной структуры к другой. Мэзия полагал также, что обнаружение такой центросомной структуры в растительной клетке - дело будущего и зависит от развития методов цитологического анализа (Mazia, 1987). Существует противоположная точка зрения на регуляцию цикла цитоскелета в делении растительной клетки: самосборка стабильных микротрубочковых (МТ) пучков в различные конфигурации посредством активности ассоциированных с ними белков (Smirnova, Bajer, 1998). Центросома как компонента растительной клетки этой моделью не рассматривается.
Согласно современным представлениям, для регуляции динамики цитоскелета необходимы специальные морфологические структуры: микротрубочкоорганизующие центры (МТОЦ), - служащие в качестве затравки для полимеризации микротрубочек. В животных клетках МТОЦ входят в состав центросомы, которая и регулирует динамику цитоскелета. В клетках высших растений МТОЦ сгруппированы на поверхности ядерной оболочки (Lambert, 1993). Совершенно не ясно, как регулируется динамика цитоскелета на тех стадиях деления растительной клетки, где ядерная оболочка отсутствует, а также в зонах цитоплазмы, удаленных от ядра. Механизмы, регулирующие перестройки цитоскелета в делении растительной клетки, представляют собой важнейшую нерешенную проблему в клеточной биологии (Маге, 1997; Baluskaetal., 1998).
Поскольку современные методы цитологического анализа не позволяют визуализировать центросомные структуры в растительной клетке и сделать выбор между гипотезой гибкой центросомы и гипотезой самосборки, актуальной является задача детально изучить процесс динамики цитоскелета в ходе клеточного деления как таковой и представить его в качестве непрерывного и полного процесса перехода из одной конфигурации в другую. До сих пор это не было сделано по причине деполимеризации микротрубочкового цитоскелета на некоторых переходных стадиях цикла.
Для решения этой задачи мы разработали эффективный подход, заключающийся в изучении возможно большего количества аномалий цитоскелетного цикла в делении растительной клетки.
Морфологический анализ аномальных клеточных процессов - весьма информативный способ решения разнообразных задач клдтПЧНПЙ К""~у"" К сожалению, до сих пор использование моЬф^гиА^^А^вАЯ/уій в
1 J СП«ср»«>г
цитологическом анализе ограничивалось лишь несколькими аспектами. Первый из них - анализ фенотипа различных мутаций с целью установить первичный морфологический эффект соответствующего гена и произвести генетическую диссекцию изучаемого процесса (см. обзоры Staiger, Cande 1993, Hoyt, Geiser, 1996). Второй аспект - изучение тех клеточных аномалий, которые приводят к биологически значимым последствиям, например, к формированию нередуцированных гамет в мейозе или капомиксису (в числе прочих см. Werner, Peloquin, 1991; Qu, Vorsa, 1999). Третий аспект использования клеточных аномалий для решения цитологических задач - анализ последствий воздействия на клетку специфических ингибиторов изучаемого процесса или структуры с целью определения роли или функции последних,- предмет экспериментальной клеточной биологии (McCurdy et al., 1991; Karyophyllis et al., 1997; Binarova et al., 1998)
Однако мы убедились, что анализ аномалий самих по себе является также весьма информативным подходом к изучению процессов внутриклеточных преобразований на уровне морфологических структур. Блокируя, замедляя или искажая ход клеточного процесса, аномалии обнаруживают его детали, скрытые в норме. Полностью нарушая или искажая взаимодействие клеточных структур, аномалии обнаруживают роль этих структур в таком взаимодействии и в изучаемом процессе. Такой подход будет тем более успешным, чем большее количество аномалий используется в анализе Заранее предсказать, какую именно новую информацию удастся получить в результате такого анализа, невозможно. Может быть, поэтому этот подход до сих пор не используется в изучении структурного аспекта внутриклеточных процессов. Тем не менее, он имеет ряд существенных достоинств, главные из которых — высокая эффективность, методическая простота, а также возможность получить информацию, недоступную для других цитологических методов исследования. Мы назвалиэтотподходморфологическойдиссекцией.
Прекрасной моделью для изучения деталей и промежуточных этапов динамики микротрубочкового цитоскелета посредством морфологической диссекции является мейотическое деление в материнских клетках пыльцы (МКП). Мейоциты крупны (десятки микрон в диаметре), легкодоступны, многочисленны, синхронизованы по стадиям деления, лишены клеточной стенки. А главное, разнообразные аномалии мужского мейоза у растений могут быть получены в большом количестве. Нарушениями мейотического деления характеризуются отдаленные гибриды, аллоплазматики, гаплоиды, полиплоиды, анеуплоиды и, конечно же, обширная коллекция мейотических мутантов, известная у высших растений (Kaul, 1988). Легкая асинхронность между мейоцитами по длине пыльника позволяет проследить кратковременные переходные этапы каждой стадии мейотического деления. В настоящее время для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки в качестве модели используются клетки различных типов протопласты, эндосперм, меристематические вакуолизированные и лишенные вакуолей, дифференцирующиеся и так далее. Результаты такого исследования, полученные на любом виде делящихся бесцентриолярных клеток, вскрывают прежде всего общие принципы «цикла цитоскелета без центросом» и имеют соответствующее теоретическое значение. Поэтому выбор модели в данном случае диктуется прежде всего ее информативностью. Цикл цитоскелета в ходе мейотического деления МКП практически не отличается от такового в митотическом делении бесстеночных клеток, например, эндосперма - классической модели для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки (Smirnova, Bajer, 1998).
Главные переходные стадии перестроек цитоскелета в ходе деления растительной клетки не были описаны. Анализ характера этих переходов сделает возможным выявить их закономерности и способ регуляции на морфологичском уровне. Полученная информация такого рода представляет собой важный материал для проверки и дальнейшей разработки теории центросомы и клеточного центра эукариотной клетки.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было поставлено выяснение морфологических основ регуляции цикла микротрубочкового цитоскелета в делящейся растительной клетке в отсутствие морфологически идентифицируемой центросомы. Конечной целью было построение модели регуляции динамики микротрубочкового цитоскелета в растительной клетке на морфологическом уровне. Для выполнения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Создать модель для изучения мофологических процессов динамики
микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки, а именно:
- создать обширную коллекцию аномалий различной этиологии по
мобильным стадиям меиотического деления у различных видов однодольных и
двудольных растений, учитывая существующие различия в ходе меиотического
деления у видов с последовательным и одновременным цитокинезом;
- разработать варианты методов визуализации микротрубочкового
цитоскелета - как традиционных, так и иммуноокрашивания,-
оптимапьных для работы с материнскими клетками пыльцы и
адекватных поставленным задачам.
-
Представить цикл динамики цитоскелета в делящейся растительной клетке в виде непрерывного процесса морфологических преобразований со всеми переходными стадиями.
-
Провести детальный цитологический анализ динамики цитоскелета в мейозе у всех аномальных форм для выявления составляющих событий и характеристик этого процесса.
-
Провести анализ цикла цитоскелета в мейозе фертильных отдаленных гибридов первого поколения и прочих форм - продуцентов нередуцированных гамет - для выяснения цитоскелетых механизмов мейотической реституции.
-
На основе полученных данных составить каталог аномалий веретена деления растительной клетки
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан и успешно применен новый подход к цитологическому изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований: морфологическая диссекция, представляющий собой сравнительный анализ возможно большего числа аномалий изучаемого процесса с целью выявления его неизвестных переходных стадий и характеристик. Цитоскелетный цикл в делящейся растительной клетке впервые представлен в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса внутриклеточных морфологических преобразований. Впервые описан ход перестроек цитоскелета в профазе и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца. Впервые описана стадия ранней прометафазы как вход цитоскелета в зону бывшего ядра. Впервые выявлены главные морфологические процессы средней прометафазы: формирование биполярных центральных и кинетохорных фибрилл веретена. Впервые описан механизм формирования подвижного фрагмопласта в мейозе у однодольных видов и предложена модель его центробежного движения. Предложена модель временной регуляции
цитокинеза. Впервые описаны 13 цитоскелетных механизмов мейотической реституции у видов однодольных и двудольных растений. Описаны 24 новые аномалии анастрального веретена в дополнение к 3, известным ранее в литературе. Внесен существенный вклад в понимание морфологических механизмов регуляции цикла цитоскелета в делении растительной клетки в пользу гипотезы самосборки.
Практическая ценность настоящей работы заключается в том, что полученное цельное представление о морфологических механизмах мобильных стадий мейотического деления позволит приблизиться к решению таких проблем селекции, как естественная полиплоидизация, преодоление стерильности отдаленных гибридов первого поколения и апомиксис. Составленный каталог аномалий растительного веретена деления, подавляющую часть которого составляют аномалии, описанные впервые, представляет большую ценность при анализе морфологического фенотипа меиотических мутаций, особенно у сложных для цитологического анализа объектов, таких, например, как арабидопсис. Полученные в настоящей работе сведения о цитоскелетном цикле в делении растительной клетки используются для чтения лекций по цитологии и цитогенетике в Новосибирском и Санкт-Петербургском государственных университетах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзной конференции «Генетика и цитология мейоза» (Новосибирск, 1990), на международном совещании «Fidelity of chromosome transmission and mitosis" (Ленинград, 1990), на 5-м Международном Когрессе по клеточной биологии (1992, Мадрид), на Съездах ВОГИС 1992 и 1994 гг, на 4-м Европейском Конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на международном симпозиуме "Plant Cytoskeleton: A Key for Biotechnology" (Ялта, 1998), на открытом семинаре Вагенингенского университета (Нидерланды, май 2001), на Московском межинститутском семинаре по клеточной биологии (2 апреля 2003 г.), на Международном Сипмозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, октябрь 2003), на I Съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, октябрь 2003), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
Публикации. По теме работы опубликовано 24 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, 6 глав результатов исследований, обсуждение результатов, заключение и перспективы, выводы и список литературы. Работа изложена на 278 страницах машинописного текста, содержит 30 сводных рисунков, 28 схем и 1 таблицу. Список литературы включает 423 источника.
