Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Обзор литературы 6
2.1. Генетический контроль клеточного цикла у растений 7
Циклин-зависимые протеинкиназы (CDK) 11
CDKA : 11
CDKB 12
Другие группы CDK растений 13
Циклины 13
Циклины класса D 15
Циклины класса А 17
Циклины класса В 18
Другие классы циклинов 19
Регуляция активности комплексов СіЖ-циклин киназой WEE1 20
и фосфатазой CDC25
Регуляция активности комплексов CDK-циклин белками САК и ICK 21
Белок RB 21
Транскрипционные факторы E2F 22
Вышележащие пути регуляции клеточного цикла у растений 24
Регуляция экспрессии генов клеточного цикла Муб-семейством 24
транскрипционных факторов
Участие М4Р-киназного каскада в регуляции клеточного цикла у растений 25
Фитогормональная регуляция клеточного цикла 26
2.2. Регуляция развития меристем 28
Гены KNOX класса 1 32
Гены ШХ класса II 35
Взаимодействие транскрипционных факторов KNOX с другими белками 36
Регуляция экспрессии генов KNOX различными семействами 36
транскрипционных факторов
Фитогормональная регуляция экспрессии генов KNOX 37
Взаимодействие генов STMи WUS 39
Подсемейство генов WOX: ген WUS 40
Мишени транскрипционного фактора WUS 40
Регуляция экспрессии гена WUS 41
Подсемейство генов WOX: гены WOX2, WOX5, WOX8nWOX9 42
Подсемейство генов BELL 43
Подсемейство генов HD-ZIP 44
Фитогормональная регуляция развития меристем 45
2.3. Опухоли высших растений как модель в генетике развития 46
2.3.1. Опухоли растений, индуцированные бактериями 47
Опухоли растений, индуцированные представителями рода Agrobacterium 48
Онкогены Agrobacterium tumefaciens , 50
Онкогены Agrobacterium rhizogenes 52
Опухоли, индуцированные галлообразующими бактериями 59
2.3.2. Опухоли растений, вызванные вирусами, простейшими, грибами, 63
нематодами и насекомыми
Опухоли растений, индуцированные вирусами 63
Опухоли растений, индуцированные простейшими 64
Опухоли растений, индуцированные грибами 64
Опухоли растений, индуцированные нематодами 65
Опухоли растений, индуцированные насекомыми 66
2.3.3. Генетические опухоли растений 67
Спонтанное опухолеобразование у межвидовых гибридов 67
Спонтанное опухолеобразование у трансгенных растений Nicotiana 76
с супрессией гена CHRK1
Опухолеобразующие мутанты Arabidopsis thaliana 79
Спонтанное опухолеобразование у инбредных линий 87
Общие механизмы индукции опухолеобразования у растений 91
Глава 3. Материал и методы 93
3.1. Материал 93
3.2. Методы 98
3.2.1. Полевые методы 98
3.2.2. Метод асептической культуры изолированных органов растений in vitro 99
3.2.3. Молекулярно-генетические методы исследования 100
Выделение тотальной растительной ДНК...: 100
Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном геле 101
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 101
Выделение ПЦР-фрагментов из агарозного геля 101
Клонирование ПЦР-фрагментов 102
Трансформация бактерий 102
Выделение плазмидной ДНК бактерий 103
Выделение тотальной РНК растений 103
ДНКазная обработка РНК 104
Электорофорез РНК в агарозном геле 104
ОТ-ПЦР 104
Глава 4. Результаты и обсуждение 106
4.1. Изучение особенностей регенерации на средах с цитокининами у инбредных линий редиса 106
4.2. Клонирование и секвенирование ПЦР-фрагментов, полученных 115
при амплификации геномной ДНК редиса с праймерами к генам CycD3,KNATlnARR5
4.3. Изучение экспрессии генов RsCYCD3, RsKNATl и RsARR 118
у инбредных линий редиса
4.3.1. Изучение экспрессии гена RsCYCD3 120
Экспрессия гена RsCycD3 у растений редиса in vivo 120
Экспрессия гена RsCycD3 у растений-регенерантов редиса in vitro 123
4.3.2. Изучение экспрессии гена RsKNATl 127
Экспрессия гена RsKNATl у растений редиса in vivo ...127
Экспрессия гена RsKNA ТІ у растений-регенерантов редиса in vitro 129
4.3.1. Изучение экспрессии гена RsARR 133
4.4. Обсуждение 140
Глава 5. Заключение 142
Выводы 148
Список литературы
- Циклин-зависимые протеинкиназы (CDK)
- Участие М4Р-киназного каскада в регуляции клеточного цикла у растений
- Метод асептической культуры изолированных органов растений in vitro
- Изучение особенностей регенерации на средах с цитокининами у инбредных линий редиса
Введение к работе
Изучение системного контроля деления и дифференцировки клеток эукариот является одной из наиболее актуальных задач современной биологии развития. Большая часть механизмов контроля клеточного цикла высоко консервативна и организована примерно одинаково у всех эукариот. В то же время, растения имеют свои уникальные механизмы контроля деления клеток. У высших растений выявлены три основных уровня контроля деления и дифференцировки клеток (Veit, 2006; Scofield and Murray, 2006; Dodueva et al., 2007). На первом уровне действуют гены, непосредственно участвующие в контроле клеточного цикла. Второй уровень регуляции деления клеток и дифференцировки высших растений связан с работой генов, обеспечивающих поддержание и нормальную функцию меристем - образовательных тканей, включающих в себя пул быстро делящихся стволовых клеток, которые являются источником дифференцированных тканей растения. Третий уровень системного контроля связан с контролем активности регуляторов клеточного цикла и развития меристем, а также с контролем экспрессии их генов. Основную роль на этом этапе контроля играют фитогормоны, в частности цитокинины и ауксины, для которых показано прямое или опосредованное участие в регуляции клеточного цикла и развития меристем. Изменения нормальной функции генов, действующих на любом из этапов системного контроля, нарушает баланс деления и дифференцировки клеток, что может приводить к различным аномалиям морфогенеза.
Одной из возможных моделей для изучения системного контроля деления и дифференцировки клеток является опухолеобразование. Опухолеобразование представляет собой результат выхода отдельных клеток или клеточных популяций из-под системного контроля, что приводит к их неконтролируемой пролиферации. У растений описан ряд примеров спонтанного опухолеобразования, зависящего от генотипа растений (Ahuja, 1998; Frank et al., 2002; Harrar et al., 2003; Lee et al., 2003) и индуцированного опухолеобразования, вызванного взаимодействием с патогенами (Jameson, 2000). Одной из общих характеристик растительных опухолей разного происхождения является изменение баланса цитокининов и ауксинов как основной механизм индукции опухолеобразования (Jameson, 2000; Lee et al., 2003; Frank et al., 2000; Harrar et al., 2003; Matveeva et al., 2004), а также изменение уровней экспрессии генов, участвующих в контроле клеточного цикла и регуляции развития меристем при переходе к опухолевому росту (Bird and Koltai, 2000; Wang et al., 2001; Harrar et al., 2003; Lee et al., 2004; Stieger et al., 2004; Osipova et al., 2006). За последние годы при изучении спонтанных и индуцированных опухолей у разных видов растений было получено множество новых данных о генах, участвующих в контроле деления и дифференцировки клеток (Wang et al., 2001; Frank et al., 2002; Harrar et al., 2003; Lee et al., 2003; Moriuchi et al., 2004; Stieger et al. 2004; Da Costa et al., 2006; Smyczynski et al., 2006). Таким образом, подробное исследование уже имеющихся и привлечение новых моделей для изучения опухолевого роста у растений открывает возможность для выявления ключевых механизмов системного контроля деления и дифференцировки растительных клеток.
Темой данной работы является изучение механизмов спонтанного опухолеобразования у инбредных линий редиса (Raphanus sativus var. Radicula Pen.). Уникальная генетическая коллекция редиса поддерживается в лаборатории генетики растений БиНИИ СПбГУ более 40 лет и является источником мутантов с различными нарушениями морфогенеза, а также ценных для селекции форм (Нарбут, 1966; Лутова и др., 1994; Lutova et al., 1997; Матвеева и др., 2000; Бузовкина и др., 2000; Карпинская и др., 2005; Osipova et al., 2006). Десять из тридцати линий генетической коллекции редиса формируют опухоли на корнеплоде в период цветения с частотой 50% и более (Нарбут и др., 1995); у одной линии отмечен другой тип опухолевого роста - израстание завязи, связанный с развитием эктопических меристем из тканей стенки завязи (Мельников, 1998). К достоинствам данной модели для изучения опухолеобразования у высших растений относятся диплоидность, высокий уровень гомозиготности и генетическая однородность материала, полученные в результате длительного инбридинга, а также близкое родство Raphanus sativus с ; модельным объектом генетики Arabidopsis thaliana, которое облегчает идентификацию генов, участвующих в контроле опухолеобразования у инбредных линий редиса, по гомологии с соответствующими генами арабидопсиса.
Целью работы являются изучение связи экспрессии гена СусОЗ, участвующего в контроле клеточного цикла, гена KNAT1, участвующего в контроле развития меристем, а также гена первичного ответа на цитокинины ARR5 с опухолеобразованием у инбредных линий редиса in vivo и морфогенетическими реакциями на цитокинины in vitro. В задачи работы входило:
1. Анализ морфогенетических реакций на цитокинины разного типа строения у опухолеобразующих и безопухолевых инбредных линий редиса.
2. Поиск в геноме редиса генов CycD3, KNAT1 и ARR5 по гомологии с соответствующими генами арабидопсиса.
3. Изучение экспрессии генов RsCycD3, RsKNATl и RsARR у опухолеобразующих и безопухолевых линий редиса на разных стадиях развития in vivo.
4. Изучение экспрессии генов RsCycD3, RsKNATl и RsARR у опухолеобразующих и безопухолевых линий редиса при ответе на цитокинины in vitro.
Циклин-зависимые протеинкиназы (CDK)
CDK относятся к серин-треониновымм протеинкиназам. В состав их молекулы входит высоко консервативная каталитическая коровая часть (около 300 амнинокислотных остатков), наиболее консервативным элементом которой является циклин-связывающий домен. Консенсусные последовательности этого домена, принимающие непосредственное участие во взаимодействии с молекулой циклина, различаются у разных CDK (Joubes et al., 2000). У дрожжей обнаружена единственная CDK - Cdc28 у Sacharomyces cerevisiae или Cdc2 у Schizosaccharomyces pombe, которая имеет консенсусную последовательность PSTAIRE в циклин-связывающем домене (Mendenhall and Hodge, 1998; цит. по: Oakenfull et al., 2002). У животных имеется несколько типов CDK, взаимодействующих с разными типами циклинов, CDK1 животных является ортологом cdc2. У арабидопсиса в настоящее время обнаружено семь типов CDK (Menges et al., 2005).
Ортологом cdc2 у растений является циклин-зависимая киназа CDKA, которая взаимодействует со всеми типами циклинов. Ген, кодирующий CDKA, имеет " конститутивно высокий уровень экспрессии на протяжении всего клеточного цикла, но киназная активность CDKA не является постоянной и имеет два пика: на переходах G1-S и :: G2-M (Menges et al., 2005). По-видимому, CDKA является основной CDK растений, и участвует в контроле клеточного цикла на всех стадиях. В геноме арабидопсиса выявлен один ген CdkA, продуктом которого является циклин-зависимая киназа CDKA (Menges et al., 2005). Максимальный уровень экспрессии гена Cdka наблюдается в меристематических тканях. Кроме того, его экспрессия на более слабом уровне имеет место также в дифференцированных тканях. Показано, что арест деления клеток в суспензионной культуре клеток Nicotiana tabacum существенно не влияет на уровень экспрессии гена Cdka (Hemerly et al., 1993). Предполагается, что CDKA может участвовать в контроле тотипотентности растительных клеток, а также, возможно, влиять на определение судьбы клеток. Об этом свидетельствует тот факт, что дедифференцировка тканей стеблевых эксплантов табака при каллусообразовании на среде с цитокининами зависит от уровня экспрессии гена Cdka (Boucheron et al., 2002). Повышение активности CDKA у трансгенных растений табака со сверхэкспрессией одного из генов, кодирующих САК, приводило к ингибированию органогенеза у эксплантов на средах с фитогормонами и резкому усилению каллусообразования (Yamaguchi et al., 2003). Наоборот, снижение активности CDKA у трансгенных растений арабидопсиса вызывало дифференцировку инициальных клеток в апикальной меристеме корня (Umeda et al., 2000). Таким образом, определенный уровень активности CDKA необходим для ингибирования дифференцировки пула стволовых клеток в меристемах. Уровень экспрессии гена CDKA в листьях повышается при поранении; в апикальной меристеме побега уровень экспрессии гена Cdka зависит от интенсивности освещения; кроме того, на экспрессию этого гена влияют фитогормоны (Hemerly et al., 1993). В промоторе гена Cdka имеются две последовательности auxRE (Auxin Responsive Element), характерные для ауксин-регулируемых генов, одна последовательность, характерная для генов, регулируемых абсцизовой кислотой, а также три консервативные последовательности для связывания А/уй-семейства транскрипционных факторов, которые, вероятно участвуют в одном из путей регулировки экспрессии гена Cdka (Chung, Parish, 1995).
CDKB
К основным CDK растений также относится CDKB - уникальная CDK растений, значительно отличающаяся от CDK других эукариот. В то же время, у растений отсутствуют группы CDK4 и CDK5, консервативные для животных (Joubes et al., 2000). По-видимому, функция CDKB - контроль перехода G2-M. У разных видов растений (арабидопсис, табак, люцерна, львиный зев) показано наличие двух групп киназ CDKB -CDKB1 и CDKB2, различающихся по строению белковой молекулы, а также по динамике -киназной активности и времени экспрессии соответствующих генов (Oakenfull et al., 2002). Две группы CDKB различаются по консенсусной последовательности в циклин-связывающем домене (PPTALRE у CDKB1, PPTTLRE у CDKB2) (Menges et al., 2003). Максимум киназной активности CDKB1 приходится на переход G2-M (Sorrel et al., 2001), CDKB2 - на начало фазы G2 (Menges et al., 2005). В геноме арабидопсиса имеются четыре гена CdkB - два из них кодируют белки CDKB1 и два - CDKB2 (Menges et al., 2005). Экспрессия генов CdkBl в клетках синхронизированной суспензионной культуры табака начинается в фазе S и продолжается до фазы М, экспрессия генов CdkBl начинается с перехода G2-M (Menges et al., 2005). Таким, образом, вероятно, что две группы CDKB участвуют в контроле разных этапов клеточного цикла. Установлено, что CDKB1 арабидопсиса не взаимодействуют с циклинами D-типа, которые играют основную роль в контроле перехода Gl-S (Healy et al., 2001), a CDKB2 - взаимодействуют (Копо et al., 2003). У растений не обнаружено ингибиторов CDK, взаимодействующих с CDKB (de Jager et al., 2005).
Другие группы CDK растений Остальные группы CDK растений, по-видимому, играют вспомогательную роль в контроле клеточного цикла. Циклин-зависимые киназы CDKD и CDKF осуществляют функцию активаторов CDK (САК) (Joubes et al., 2000), для белков CDKC, CDKE (Joubes et al., 2000, Joubes et al, 2001) и CDKG (Menges et al., 2005) точная функция не установлена, белки взаимодействующие с этими CDK, не выявлены. Гены киназ CDKC, CDKE и CDKG экспрессирутся на постоянном, но низком уровне на всех стадиях клеточного цикла (Menges et al., 2005). В геноме арабидопсиса также обнаружено 15 СТЖ-подобных (CDK-like или CKL) последовательностей с невыясненной функцией. Их экспрессия носит циклический характер, что характерно для генов клеточного цикла. Для некоторых CKL отмечена строгая тканеспецифичность экспрессии: например, CKL12 экспрессируется только в корнях, CKL3 - в опухолях, индуцированных агробактериями и в каллусах (Menges et al., 2005). Возможно, разные CKL принимают участие в контроле деления и определения судьбы клеток в разных тканях.
Циклины
Протеинкиназная активность и субстратная специфичность CDK зависит от каталитических субъединиц CDK - циклинов. У эукариот имеется несколько групп циклинов, которые контролируют клеточный цикл на разных стадиях. Точная функция некоторых из них до сих пор не установлена. У животных обнаружено 13 классов циклинов (классы A-L и Т) (Wang et al., 2004). Первые циклины растений были открыты в 1991 г. (Hata et al., 1991); к настоящему времени выделены классы А-, В-, С-, D-, Н-, Л8, GT, L-, Р-, Т- и [/-циклинов растений (Wang et al., 2001; Wang et al., 2004; Barroco et al., 2005). Циклины растений в пределах каждого класса демонстрируют высокий процент гомологии и одинаковый характер экспрессии, что позволяет предположить их функциональное сходство (Wang et al., 2004). У разных видов однодольных и двудольных, а также голосеменных было выявлено более 150 циклиновых генов (Wang et al., 2004). Так в геноме арабидопсиса обнаружено 49 генов, кодирующих циклины десяти разных классов (Wang et al., 2004) и около пяти генов циклин-подобных белков (Azumi et al., 2002; Menges et al., 2005); в геноме Oryza saliva обнаружено 44 гена, кодирующих циклины (Wang et al., 2004). Циклиновые гены растений более разнообразны, чем циклиновые гены животных, что, вероятно, связано с особенностями развития растений. Например, в геноме человека присутствуют два гена циклинов класса А и три гена циклинов класса В, тогда как у арабидопсиса их, соответственно, 10 и 9 (Wang et al., 2004). Некоторые классы циклинов уникальны для растений. Пять классов циклинов, обнаруженных у растений, встречаются у всех эукариот, четыре класса циклинов имеются только у растений, один класс (tZ-циклины) обнаружен у растений и простейших, но отсутствует у животных (Wang et al., 2004).
Участие М4Р-киназного каскада в регуляции клеточного цикла у растений
Один из механизмов регуляции экспрессии генов, продукты которых участвуют в контроле клеточного цикла, связан с Л й-семейством транскрипционных факторов. Для промоторов ряда генов растений, экспрессирующихся преимущественно на переходе G2-М, характерно наличие так называемой последовательности MSA (M-phase Specific Activator). Например, последовательность MSA выявлена в промоторах 20 из 93 генов арабидопсиса, которые экспрессируются на переходе G2-M, в частности, генов циклинов класса В, играющих ключевую роль в контроле перехода G2-M и митоза (Araki et al., 2004). Три последовательности MSA обнаружены в промоторе гена Cdka арабидопсиса; показано, что их деления приводит к снижению уровня экспрессии гена Cdka (Chung and Parish, 1995).
С последовательностью MSA взаимодействуют транскрипционные факторы семейства Myb, консервативные для животных и растений. У позвоночных МуЬ белки играют роль в контроле перехода Gl-S (Weston, 1998, цит. по: Araki et al., 2004), у растений они контролируют переход G2-M (Araki et al., 2004). В геноме арабидопсиса обнаружено более 130 генов, кодирующих Myb белки, в геноме табака - около 80 таких генов (Araki et al., 2004), В то же время, только три Myb белка Nicotiana tabacum (NtMyb белки) имеют три повтора в Myb-домепе, характерные для Myb белков животных. Именно для этих белков табака показано взаимодействие с последовательностями MSA и способность регулировать экспрессию генов, связанных с контролем клеточного цикла. Было показано, что два NtMyb белка активируют экспрессию генов циклинов класса В и один репрессирует их экспрессию (Araki et al., 2004). Экспрессия генов NtMyb приурочена к переходу G2-M. Активность транскрипционных факторов NtMyb регулируется на посттрансляционном уровне путем фосфорилирования Myb белков комплексами CDK-циклин - таким образом, существует и обратная связь между циклинами и Myb белками. Было показано, что повышение уровней экспрессии циклинов классов А и В повышают активность транскрипционных факторов NtMyb табака (Araki et al., 2004). ";
Участие МАР-киназного каскада в регуляции клеточного цикла у растений
Имеются данные об участии в контроле деления клеток у растений М4Р-киназного каскада сигнальной трансдукции. MAP (Mitogene Activated Protein Kinase) киназный каскад - один из наиболее распространенных сигнальных механизмов, который участвует в контроле многих процессов, связанных с регуляцией роста, развития и ответа на стресс у всех эукариот. Он включает в себя последовательную активацию трех компонентов: МАР-киназу (МАРК) фосфорилирует киназа М4Р-киназы (МАРКК), которая в свою очередь является субстратом для киназы МАРККК. Активация МАРККК происходит при ее фосфорилировании вышележащими компонентами; киназа МАРК фосфорилирует нижележащие белки. У животных М4Р-киназный каскад играет важную роль в контроле процессов роста, развития и ответа на стресс (Gustin et al. 1998; цит. по: Krysan et al., 2002). В геноме арабидопсиса обнаружено 25 генов, кодирующих МАРККК, для двух из них ранее показано участие в сигнальной трансдукции при ответе на этилен и стрессовом ответе (Тепа et al., 2001; цит. по: Krysan et al., 2002). Путем Т-ДНК-инсерционного мутагенеза у арабидопсиса были получены мутанты по генам, кодирующим МАРККК ANPl, ANP2 и ANP3 (Arabidopsis NPKl-like Proteins,). Мутанты по любому из этих генов фенотипически не отличались от дикого типа, двойные мутанты демонстрировали серьезные аномалии развития, тройные мутанты характеризовались полным блоком деления клеток и не развивались дальше зиготы (Krysan et al., 2002). Полученные данные свидетельствуют о том, что М4Р-киназный каскад участвует контроле деления клеток у растений. При этом М4Р-зависимый контроль деления клеток не связан его с гормональным контролем: все мутанты по ANP не отличались от дикого типа по чувствительности к основным группам фитогормонов (Krysan et al., 2002).
Фитогормональная регуляция клеточного цикла
Фитогормоны, в частности ауксины и цитокинины, играют важную роль во многих аспектах развития растений, в том числе - в контроле деления и дифференцировки клеток. Функция цитокининов как стимуляторов пролиферации клеток была продемонстрирована на ряде мутантов и трансгенных растений с измененным метаболизмом этих гормонов (Medford et al., 1989; Werner et al., 2001; Helliwell et al., 2001; Frank et al., 2000, 2002). Так пониженное содержание цитокининов в тканях трансгенных растений табака со сверхэкспрессией одного из генов цитокинин-оксидаз приводит к сниженному количеству клеточных делений, редукции SAM и формированию очень мелких листьев (Werner et al., 2001). Противоположный фенотип характерен для мутанта amp (altered meristem program) арабидопсиса, который имеет повышенное содержание цитокининов в тканях (Helliwell et al., 2001) и трансгенных растений табака, несущих ген биосинтеза цитокининов ipt А. tumefaciens (Medford et al., 1989). Экспрессия генов регуляторов клеточного цикла изменена у ряда фитогормональных мутантов. Например, мутант арабидопсиса przl (proporzl), который формирует быстро пролиферирующий каллус в ответ на экзогенные ауксины и цитокинины, демонстрирует повышенный уровень экспрессии генов CDKB1J и E2Fc (Sieberer et al., 2003). Предположительно, функцией продукта гена PRZ1 является связь фитогормонального сигнала с контролем клеточного цикла (Sieberer et al., 2003).
Экспрессия некоторых генов, кодирующих регуляторы клеточного цикла у растений, находится под фитогормональным контролем. Среди гормон-регулируемьгх генов клеточного цикла можно отметить гены Cdka (Chung and Parrish 1995), CycA (Roudier et al., 2003) и CycD3 (Riou-Khamlichi et al., 1999). Например, в промоторе гена Cdka арабидопсиса имеются две последовательности, характерные для ауксин-регулируемых генов, и одна последовательность, характерная для генов, регулируемых абсцизовой кислотой. Было показано, что делеция этих последовательностей приводит к снижению уровня экспрессии гена Cdka (Chung and Parish, 1995). Последовательность auxRE присутствует также в промоторе гена СусА2;2 люцерны (Roudier et al., 2003). Экспрессия генов циклинов класса D повышается в ответ на цитокинины, ауксины, гиббереллины и брассиностероиды и понижается при добавлении абсцизовой кислоты и жасмоновой кислоты (Riou-Khamlichi et al., 1999; Ни et al., 2000; Gaudin et al., 2000; Rashotte et al., 2003).
Помимо регуляции экспрессии генов, фитогормоны могут участвовать в контроле активности и стабильности регуляторов клеточного цикла. Недавно было обнаружено, что ауксины позитивно регулируют аккумуляцию и стабильность транскрипционного фактора E2Fb в клетках арабидопсиса (Magyar et al., 2005). Циклический паттерн экспрессии, который является особенностью генов регуляторов клеточного цикла, был продемонстрировн для нескольких генов, продукты которых участвуют в передаче сигнала цитокининов, ауксинов и этилена (Menges et al., 2005), что позволяет предположить роль этих генов в контроле клеточного цикла у растений.
Итак, в настоящее время известно достаточно много о последних этапах регуляции клеточного цикла, в частности о системе СШГ-циклины, которая активирует RB-E2F путь регуляции экспрессии генов. В то же время, наука располагает гораздо меньшим количеством информации о вышележащих регуляторных путях, контролирующих ключевые этапы клеточного цикла. Получены данные об участии транскрипционных факторов семейства МуЬ (Araki et al., 2004), MAP каскада сигнальной трансдукции (Krysan et al., 2002) и фитогомонов (Chung and Parish, 1995; Riou-Khamlichi et al., 1999; Hu et al., 2000) в регуляции экспрессии генов клеточного цикла. Вероятно, помимо этого существует много путей регуляции экспрессии этих генов. Изучение мутантов растений с нарушением организменного контроля клеточных делений позволило выявить некоторые регуляторные механизмы.
Метод асептической культуры изолированных органов растений in vitro
Апексы семидневных проростков помещали на один из трех вариантов сред на основе MS с добавлением одного из цитокининов в следующих концентрациях: ТДЗ - 1 мг/л, бензиламинопурин БАП - 2 мг/л, кинетин - 2 мг/л. Концентрация каждого из цитокининов является минимальной, но достаточной для проявления физиологического эффекта и выявления различий между линиями (Бузовкина и др., 1993; Ильина и др., 2006). В качестве контроля использовали растения-регенеранты на безгормональной среде (MS0). В среднем от каждой линии на цитокинин-содержащих средах было проанализировано по 20 эксплантов, на среде MS0 - по 6. Инкубация проводилась при температуре 20-23С и длине светового дня 16 часов.
На 30-й день культивации проводили учет регенерантов по диаметру КС, относительной площади вторичных опухолей, количеству побегов и придаточных корней. Для вторичных опухолей провели тест на гормон-независимый рост путем культивации изолированных опухолей на среде MS0 (3 пассажа по 30 дней). В качестве критерия гормон-независимого роста принимали визуально различимое увеличение опухоли в размерах. Статистическая обработка данных включала в себя подсчёт средних показателей морфогенетических реакций на цитокинины и ошибки среднего (Ивантер и Коросов, 1992).
ДНК была выделена из молодых асептических растений редиса и арабидопсиса с использованием СТАБ-метода (Rogers and Bendich, 1985). Навеску растительного материала помещали в микроцентрифужную пробирку фирмы Eppendorf и гомогенизировали с жидким азотом при помощи стеклянной палочки. К растертой массе добавляли 2-кратный СТАБ-буфер для экстракции (0.1 М трис-НС1; 1.4 М NaCI; 10 мМ ЭДТА; 2% СТАВ) и инкубировали 1 час в термостате при температуре 65С. Экстракт очищали от белков с помощью смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1). Фазы разделяли центрифугированием, верхнюю фазу отбирали в чистую пробирку. Затем повторяли экстракцию 5-кратным СТАБ-буфером (350 мМ ЭДТА, 5% СТАВ) в течение 10 мин при 65С, экстракцию хлороформом и разделение фаз с помощью центрифугирования. Водную фазу переносили в чистую пробирку и осаждали ДНК 2х-кратным СТАБ-буфером для преципитации (50 мМ трис-НС1,10 мМ ЭДТА; 1 % СТАВ) в течение ночи при комнатной температуре. Осадок растворяли в буфере HSE (ЮшМ трис-НС1, 1 тМ ЭДТА, 1 М NaCI) и переосаждали 96% этанолом в течение 20мин. при -70С, затем осадок растворяли в воде и проводили второе переосаждение 0.75 М ацетатом аммония в 80% этаноле. Полученный осадок промывали холодным 80% этанолом, высушивали под струей воздуха и растворяли в дистиллированной воде. Выделенную ДНК хранили при температуре -20.
Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном геле
Для оценки количества и качества выделенной ДНК, а также разделения фрагментов разной длины после проведения ПЦР использовали электрофорез в 1%-агарозном геле на основе 1-кратного буфера ТАЕ рН=8 (Дрейпер и др., 1991); в расплавленный гель для визуализации ДНК добавляли бромистый этидий (0.01%). Электрофорез проводился в 1-кратном буфере ТАЕ при напряжении электрического поля 100 Вольт.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Для подбора праймеров к генам KNAT1, CYCD3 и ARR5 редиса мы использовали нуклеотидные последовательности этих генов у других родственных редису видов, имеющихся в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Например, последовательности этих генов известны у арабидопсиса Arabidopsis thaliana и некоторых других видов, относящихся, как и редис, к семейству Brassicaceae. Праймеры к консервативным последовательностям данных генов были сконструированы с помощью программы Primer Quest (Integrated DNA Technologies). Были использованы следующие последовательности праймеров: CYCD31: GGA CTCAGC TGTCTC GATGATGTT CYCD3 2: АСА ТАС TTTGTC ТСС ТССАСС TGC KNAT1: TAG САА ТТС ССТ CTG AAG CCG СТА KNAT2: ТСТ GAC ТСС TGC САС АСА ACT САА ARR51: TTG CGTСССGAGATG ТТА GA ARR5 2: АТС CAG ТСА ТСС CAG GCA ТА В работе были использованы Taq-полимераза и буфер фирмы Силекс-М (Россия). Результаты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Выделение ПЦР-фрагментов из агарозного геля
При проведении ПЦР на матрице ДНК редиса с использованием сконструированных нами праймеров во всех случаях были получены продукты ожидаемого размера. Амплифицированпые фрагменты были выделены из агарозного геля с помощью легкоплавкой агарозы по следующей методике (Дрейпер, 1991):
Проводили электрофорез ПЦР-смеси в 0.8% геле из легкоплавкой агарозы на основе буфера ТАЕ. С помощью бритвы аккуратно вырезали нужный фрагмент, помещали в микроцентрифужную пробирку и плавили на водяной бане при температуре 60С в течение 30 мин. Проводили тройную экстракцию полученной смеси - водонасыщенньш фенолом, смесью фенола с хлороформом (1:1) и хлороформом. После каждой экстракции разделяли фазы центрифугированием и переносили водную фазу в чистую пробирку. Осаждали ДНК 0.3 М ацетатом натрия в 80% этаноле в течение ночи при -20С. Осадок промывали холодным 80% этанолом, высушивали под струей воздуха и растворяли в стерильной дистиллированной воде.
Клонирование ПЦР-фрагментов Полученные ПЦР фрагменты были клонированы в векторе pTZ57R/T (рис. 9). Постановку лигирования проводили по инструкции к набору InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit (Fermentas). Трансформация бактерий В работе использованы химически компетентные бактерии штамма DH5a. Компетентные клетки были приготовлены по следующей процедуре (Дрейпер, 1991): Ночную культуру DH5a выращивали в среде SOB при 18С и скорости 250 об/мин в течение суток до достижения оптической плотности Абоо=0.6, охлаждали во льду в течение 10 минут и осаждали клетки центрифугированием при 4С. Ресуспендировали клетки в холодном ТВ буфере (ЮтМ Hepes, 55тМ МпСЬ, 15 тМ СаСЬ, 250 тМ КС1), инкубировали 10 минут во льду и осаждали центрифугированием при 4С. Снова ресуспендировали клетки в холодном ТВ буфере и добавляли 90% диметилсульфоксид (DMSO) до конечной концентрации 7%. Инкубировали во льду 10 минут, разливали по предварительно охлажденным микроцентрифужным пробиркам и замораживали на -70С.
Изучение особенностей регенерации на средах с цитокининами у инбредных линий редиса
Ранее в работах сотрудников лаборатории генной и клеточной инженерии растений изучение регенерации растений из изолированных апексов опухолеобразующих и безопухолевых линий редиса на средах с цитокининами позволило обнаружить различие линий по регенерационным признакам (Бузовкина и др., 1993а). Для ряда линий была продемонстрирована способность к образованию корнеплодоподобных структур (КС) в нижней части гипокотиля растений, регенерированных из апексов редиса на средах с цитокининами (растений-регенерантов). Кроме того, у растений-регенерантов некоторых линий наблюдалось подавление апикального доминирования и интенсивное побегообразование (Бузовкина, 1993; Бузовкина и др., 1993). Была обнаружена корреляция между особенностями морфогенеза линий редиса in vivo и регенерацией in vitro: линии, образующие крупный корнеплод in vivo, формируют КС большого размера in vitro, линии с подавлением апикального доминирования in vivo характеризуются интенсивным побегообразованием in vitro (Бузовкина, 1993). На КС опухолевых линий отмечено формирование опухолей, способных к гормон-независимому росту при изоляции от материнского растения (Бузовкина, 1993; Бузовкина и др., 19936). Показано, что опухоли, которые образуются на КС растений-регенерантов редиса, сходны по анатомической структуре и происхождению с опухолями in vivo: оба типа опухолей образуются за счет гиперпролиферации клеток ксилемной паренхимы (Ильина и др., 2006). В дальнейшем мы будем называть индуцированные опухоли, образующиеся на КС инбредных линий редиса in vitro в ответ на экзогенные цитокинины, вторичными опухолями.
Одной из задач данного этапа работы было изучение реакции растений-регенерантов опухолеобразующих и безопухолевых линий редиса на синтетические цитокинины разного типа строения: тидиазурон (ТДЗ), 6-бензиламинопурин (БАП) и 6-фурфуриламин (кинетин) (рис. 8). По литературным данным цитокинины разного типа строения могут взаимодействовать с разными рецепторами и, возможно, индуцировать разные пути ответа (Spichal et al., 2004), а также по-разному влиять на регенерацию растений (Akasaka et al., 2000; Falasca et al., 2004). В связи с этим, мы ожидали, что инбредные линии редиса также могут различаться по морфогенетической реакции на ТДЗ, БАП и кинетин.
Кроме того, в задачи работы входило изучение влияния цитокининов разного типа строения на экспрессию генов CycD3, KNAT1 и ARR5 у растений-регенерантов редиса. По литературным данным, экспрессия генов циклинов класса D и KNOX генов класса I повышается в ответ на цитокинины (Riou-Khamlichi et al., 1999; Rupp et al., 1999). Было показано, что гены CycD3 и KNOX гены класса I принимают участие в контроле опухолеобразования у высших растений (Frank et al., 2000, 2002; Harrar et al., 2003; Lee et al., 2004). В связи с этим мы ожидали обнаружить взаимосвязь экспрессии генов CycD3 и KNAT1 с опухолеобразованием in vivo и in vitro у инбредных линий редиса.
Для оценки особенностей регенерации инбредных линий редиса на средах с цитокининами апексы 7-дневных проростков помещали на среды, содержащие цитокинины (ТДЗ 1 мг/л, БАП 2 мг/л или кинетин 2 мг/л), а также для контроля на безгормональную среду MS0. На 30 день культивации у растений-регенерантов проводили учет по следующим морфогенетическим признакам: диаметр КС, процент площади КС, занятый вторичными опухолями (в баллах), количество побегов и количество корней.
Вторичные опухоли изолировали от материнского растения и помещали на безгормональную среду для оценки способности к гормон-независимому росту (рис. 11).
Контрольные апексы всех линий при культивации на среде MS 0 через 7 дней эксплантации формировали корневую систему и розеточные листья (рис. 10А). Интенсивного побегообразования, образования КС и опухолей у растений-регенерантов на безгормональной среде не наблюдалось. Различий по морфогенетическим признакам между растениями-регенерантами разных линий на среде MS0 не отмечено.
В то же время, культивация на средах с ТДЗ, БАП и кинетином вызывала разные морфогенетические реакции у растений-регенерантов редиса: образование КС, образование вторичных опухолей, интенсивное побегообразование и корнеобразование (рис.9).
Формирование КС в нижней части гипокотиля было отмечено у растений-регенерантов всех изученных линий, за исключением линии 30, при культивации на всех вариантах сред с цитокининами. У линий редиса ТДЗ наиболее сильно стимулировал формирование КС, кинетин - наиболее слабо (рис. 10, 13 А). Инбредные линии редиса различались между собой по диаметру КС: формирование КС большого размера было характерно для растений-регенерантов линий 32, 6 и 34 (рис. 10 Б-Г, 12). В то же время, у растений-регенерантов опухолеобразующей линии 19 развивались КС - небольшого размера (рис. 10 Б-Г, 12).
Формирование вторичных опухолей было отмечено у всех проанализированных линий (за исключением линии 30, у которой не развивались КС) при культивации растений на всех вариантах сред с цитокининами и было наиболее сильно выражено на средах с ТДЗ и БАП (рис. 10, 13 Б). При этом опухолеобразующие линии 13 и 19 характеризовались небольшим размером вторичных опухолей. В то же время, линии 32, 6 и 34 формировали вторичные опухоли большего размера. Таким образом, формирование вторичных опухолей сильнее проявлялось у линий, для которых было характерно формирование КС большого размера. Вторичные опухоли всех линий демонстрировали гормон-независмый рост в течение 2-3 пассажей по 30 дней на среде MS0 (рис. 11).
При культивации на средах с цитокининами у растений-регенерантов всех линий происходило подавление апикального доминирования, что проявлялось как образование 2 и более побегов. В наибольшей степени признак «интенсивное побегообразование» проявлялся на средах с ТДЗ и БАП у линий 6 и 32, для которых характерно интенсивное побегообразование in vivo (рис. 10,13 В).
Корнеобразование у растений всех линий отмечено только на MS0 и среде с кинетином, при этом на среде с кинетином корнеобразование могло сочетаться с формированием КС и вторичных опухолей. На среде MS0 наиболее интенсивное корнеобразование мы наблюдали у линий 6 и 32, у остальных линий достоверных различий по количеству корней на MS0 не обнаружено. В то же время, на среде с кинетином наиболее интенсивное корнеобразование отмечено у линий 6 и 13. У линий 19 и 32 наблюдалось резкое снижение количества корней у растений-регенерантов на среде с кинетином по сравнению с другими линиями (рис. 13 Г).
При культивации на цитокинин-содержащих средах растения разных линий демонстрировали разную жизнеспособность. Растения линии 19 характеризовались самой низкой жизнеспособностью на средах с цитокининами, что наиболее ярко проявлялось на среде с ТДЗ. Через 20-30 дней культивации на средах с ТДЗ растения линии 19 начинали покрываться некротическими пятнами (рис. 12А), особенно сильно выраженными в базальной части растения, и погибали примерно после 40 дней культивации. Растения-регенеранты остальных исследованных линий сохраняли жизнеспособность на средах с цитокининами и оставались зелеными в течение 40 дней и более (рис. 12Б).
Типы морфогенетических реакций растений-регенерантов редиса на цитокинины: А - отсутствие видимой морфогенетической реакции (линия 30, БАП), В - образование КС (линия 34, БАП), В - интенсивное побегообразование (линия 6, БАП), Г -корнеобразование (линия 30, кинетин), Д - формирование КС и вторичных опухолей (линия 32, ТДЗ).
Итак, цитокинины разного типа строения различались по способности вызывать разные типы морфогенетических реакций у растений-регенерантов редиса. Например, ТДЗ сильнее других цитокининов стимулировал образование КС и вторичных опухолей, БАП вызывал интенсивное побегообразование, только кинетин вызывал образование корней у растений-регенерантов (рис. 13). Сходные данные существуют для других видов растений (Akasaka et al., 2000; Falasca et al., 2004). По литературным данным, цитокинины разного типа строения преимущественно связываются с разными рецепторами и предположительно индуцировать разные пути ответа (Spichal et al., 2004). Кроме того, для тидиазурона получены данные о положительном влиянии на биосинтез цитокининов и ИУК (de Melo Ferreira et al., 2006).
