Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Введение 6
ГЛАВА 2. Обзор литературы. Изучение роли цитокининов в морфогенетических процессах у растений 9
2.1. Цитокинины: структура, функции и локализация в растении 9
2.2. Основные этапы метаболизма цитокининов: биосинтез и деградация и
2.2.1. Аденилатные и т-рнк изопентенилтрансферазы - основные типы ферментов биосинтеза цитокининов у
Растений 14
2.2.2. Методы изучения функциональной активности изопентенилтрансфераз/лгкяяо 16
2.2.3. Цитокининоксидазы - ферменты деградации цитокининов, их вклад в регуляцию метаболизма цитокининов в растении 19
2.3. Методы изучения роли цитокининов в жизни растения 21
2.3.1. Генетический подход: выявление «цитокининовых» мутантов у высших растений 21
2.3.2. Использование методов генной инженерии для изучения роли цитокининов в морфогенезе растений 25
2.4. Многообразие типов неопластического роста у растений 34
2.4.1. корончатые галлы - опухоли растений, индуцируемые Agrobacterium tumefaciens 35
2.4.2. Генетические опухоли растений 36
2.4.3. Межвидовые гибриды как модель для изучения опухолеобразования. наследование генетических опухолей у межвидовых гибридов рода Nicotiana 37
2. 5. Генетическая коллекция инбредных линий редиса - модель для изучения роли гормонов в опухолебразовании 39
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 52
3.1. Материалы 52
3.1.1. Растительный материал 52
3.1.2. Бактериальные штаммы 52
3.2. Методы 53
3.2.1. Метод агробактериальной трансформации in VIVO 53
3.2.2. Изучение реакции на экзогенные фитогормоны IN VITRO 53
3.2.3. Молекулярно-генетические методы исследования 55
3.2.4. Количественное определение цитокининов и иук в растительных экстрактах 59
3.2.5. статистическая обработка данных 64
ГЛАВА 4. Результаты 65
4.1. Получение коллекции трансгенных растений со вставкой гена биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы {IPT) инеомицинфосфотрансферазы (NPTII) методом агробактериальной трансформации безопухолевой линии №30 IN VIVO 65
4.1.1. Получение растений редиса, трансгенных по генам биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы ipt и неомицинфосфотрансферазы . 65
4.1.2. Получение растений редиса, трансгенных по гену неомицинфосфотрансферазы nptIL 75
4.2. Изучение экспрессии гена ipt у опухолеобразующих и
безопухолевых трансформантов 77
4.3. Изучение чувствительности к фитогормонам in vitro трансгенных растений, содержащих вставку гена IPT. 82
4. 3. 1. Исследование чувствительности трансгенных растений редиса линии №30 к цитокинину in vitro 82
4.3.2. Изучение реакии на цитокинин БАП (6-бензиламинопурин) трансгенных по гену ipt растений редиса , 88
4.3. 3. Оценка чувствительности эксплантов к ауксинам in vitro...,. 91
4.3.3.1. Изучение реакции на ауксин 2,4 Д(10 мг/л) 92
4.3.3.2. Анализ реакции на ауксины: ИУК в концентрации 2 мг/л и ИУКъ концентрации 1мг/л 94
4.4.Количественное определение цитокининов и иук в тканях опухолевых и безопухолевых трансгенных растений по гену IPT. 101
4.4.1. Количественное определение эндогенного уровня ИУК у некоторых трансгенных по гену ipt растений 101
4.4.2. Количественное определение эндогенного уровня основных групп ЦИТОКИНИНОВ у
некоторых семей трансгеиных по гену ipt растений 102
ГЛАВА 5. Обсуждение 107
Выводы 130
Список литературы 131
- Цитокинины: структура, функции и локализация в растении
- Использование методов генной инженерии для изучения роли цитокининов в морфогенезе растений
- Метод агробактериальной трансформации in VIVO
- Получение растений редиса, трансгенных по генам биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы ipt и неомицинфосфотрансферазы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важным фактором в любом научном исследовании является наличие удобных моделей. В большинстве случаев используются хорошо изученные и удобные с генетической точки зрения виды — модельные объекты. В других случаях необходимо создание новых моделей, с помощью которых возможно адекватно воспроизводить и изучать то или иное явление.
Контроль дифференцировки у высших растений представляет собой сложный многоэтапный процесс, а характер и направление дифференцировки клеток в растении определяется балансом основных гормонов, ауксинов и цитокининов. Выход из-под системного контроля, нарушения на разных этапах онтогенетического развития, могут вызвать переход к недифференцированному росту. Одной из таких моделей, позволяющей детально исследовать процессы роста и развития, являются растения с нарушениями морфогенетического развития, в частности, опухолеобразующие растения - своеобразные «гормональные» мутанты.
Феномен опухолеобразования был описан у многих видов и межвидовых гибридов растений (Байдербек, 1981). Индуцированные опухоли вызываются факторами внешней среды, в том числе фитопатогенными организмами (вирусами, прокариотическими бактериями, грибами, нематодами и другими возбудителями). Из этой группы наиболее подробно изучены корончатые галлы,. индуцируемые Agrobacterium (Weiler and Schroeder, 1987; Zambryski et al., 1989). Другая разновидность опухолей - генетические опухоли — возникают спонтанно у растений, имеющих определенный генотип. Все генетические опухоли растений, как и опухоли, индуцированные Agrobacterium, характеризуются сходным гистологическим строением, неорганизованным ростом и способностью к гормоннезависимому росту in vitro. Для большинства генетических и индуцированных опухолей характерно также изменение уровня фитогормонов, в частности - изменение баланса ауксинов и цитокининов (Байдербек, 1981). Наиболее хорошо изученным классическим примером генетических опухолей у растений является опухолеобразование у межвидовых гибридов табака (Ahuja, 1968; Bayer, 1982; Smith, 1968). Однако в связи с полиллоидностью и стерильностью таких гибридов возникают сложности в использовании их в качестве модельного объекта.
В данной диссертационной работе была использована уникальная генетическая коллекция инбредных линий редиса Raphanus sativus L., которая была создана в 60-е гг. XX века и поддерживается до настоящего времени (Нарбут, 1966). Генетическая коллекция инбредных линий редиса является источником гормональных мутантов и аномалий морфогенетического развития, в том числе опухолеобразующих форм. В отличие от гибридов табака, редис - удобный модельный объект, это ллплоидньїй вид, который может быть легко вовлечен в генетический анализ.
В исследованиях, проводимых в нашей лаборатории, показано, что опухолеобразование у инбредных линий редиса сопряжено с изменением гормонального баланса, однако механизм возникновения таких нарушений остается невыясненным до сих пор (Matveeva et al., 2004). Предполагается, что изменение гормонального баланса может быть следствием мутаций растительных генов, контролирующих гормональный метаболизм, или связано с наличием в геноме растений последовательностей, гомологичных агробактериальным онкогенам (Matveeva et al., 2004; Intrieri and Buiatti, 2001).
Классическим подходом, позволяющим изучать роль гормонов в процессе
опухолеобразования, является трансформация клеток растений
агробактериальным вектором, содержащим онкогены, кодирующие ферменты, вовлеченные в гормональный метаболизм (Klee and Romano, 1994). Встраивание в геном растений агробактериалъных генов биосинтеза фитогормонов и их экспрессия приводит к смещению гормонального баланса растения в целом. Изменение гормонального баланса приводит в свою очередь к нарушению дифференцировки и различным морфогенетическим аномалиям, в том числе опухолеобразованию.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является создание модели для изучения опухолеобразования у редиса с помощью трансгенных растений по гену фермента биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы (Apt) и изучение роли цитокинина в процессе опухолевого роста. В задачи работы входило:
-
Разработка метода агробактериальной трансформации редиса in vivo
-
Получение коллекции трансгенных растений редиса, содержащих вставку гена биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы {ipt).
-
Анализ морфологичесюгх и физиологических (чувствительность к гормонам in vitro) признаков трансгенных растений, содержащих вставку гена ipt.
-
Изучение экспрессии гена ipt у трансгенных растений редиса.
-
Определение эндогенного уровня цитокининов и индолилуксусной кислоты у трансгенных растений редиса.
Научная новизна работы. В ходе работы был модифицирован и адаптирован традиционный метод агробактериальной трансформации завязи цветка редиса in vivo. С применением данного метода на основе безопухолевой инбредной линии № 30 была впервые создана коллекция трансгенных растений редиса, содержащих вставку генов ipt и nptll. С помощью молекулярно-генетических методов было показано, что вставка Т-ДНК стабильно наследуется на протяжении четырех поколений. По целому ряду признаков: опухолеобразование. in vivo, измененная реакция на гормоны, способность к формированию вторичных опухолей in vitro, изменение содержания фитогормонов - трансгенные растения со вставкой гена ipt были близки к растениям опухолеобразующих линий, что является результатом повышения уровня цитокининов вследствие встраивания гена ipt в геном редиса. Таким образом нами смоделирован процесс опухолеобразования у редиса и
показана роль основных фитогормонов (цитокининов и ауксинов) в дифференцировке растений.
Практическая ценность. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют значение для понимания механизмов опухолевого роста у растений. Разработан метод агробактериальной трансформации редиса in vivo. Создана коллекция Т-ДНК инсерционных мутантов, содержащих гены ipt и nptU, которая может быть использована для изучения роли цитокинина в опухолеобразовании у редиса.
Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть включены в план учебных курсов: «Генетика развития растений», «Генная инженерия и биотехнология», «Молекулярно-генетические основы растительно-микробных взаимодействий» и других, читаемых на кафедре генетики и селекции СПбГУ.
Апробация работы. По результатам работы сделаны сообщения на следующих конференциях: конференция «Актуальные проблемы генетики», Москва, 20-21 февраля, 2003; 7-й Международный конгресс по молекулярной биологии растений ISPMB, Барселона, Испания, 23-28 июня, 2003; 2-й Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003; 3-й съезд генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня, 2004; Международная конференция «Сохранение генетических ресурсов», Санкт-Петербург, 19-22 октября, 2004; 15-й Конгресс FESPB, 17-21 июля, Лион, Франция, 2006; а также на семинарах лаборатории генной и клеточной инженерии растений БиНИИ СПбГУ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной частії, включающей материалы и методы; результаты исследования, обсуждение результатов, выводов, списка литературы, состоящего из 151 источника. Работа изложена на 146 стратщах и содержит 34 рисунка и 9 таблиц.
Цитокинины: структура, функции и локализация в растении
Цитокинины являются одной из основных групп фитогормонов, которые относятся к регуляторам роста и развития растений. Впервые цитокинины были открыты Скугом и Миллером как факторы, стимулирующие клеточное деление (цит. по; Лугова и др., 2000). В настоящее время известно, что в сочетании с другими фитогормонами цитокинины регулируют различные физиологические процессы в растении. Значение цитокининов в жизни растений трудно переоценить, т.к. они вовлечены практически во все процессы, связанные с онтогенезом: деление клеток, инициация побегообразования и апикального доминирования, фотосинтез, фотоморфогенез, старение, азотный метаболизм и другие (Horgan, 1984; Мок and Martin, 1994). На организменном уровне цитокинины контролируют генетическую программу побегообразования. При повышении уровня гормона наблюдается снятие апикального доминирования, вызванного ауксином. Цитокинины стимулируют прорастание семян, повышают устойчивость растения к неблагоприятным воздействиям, продлевают жизнь срезанных листьев, тормозят рост стебля в длину, влияют на репродуктивное развитие и процессы старения (Полевой, 1982; Кулаева, 1973; Estele, 1998; Haberer and Kieber, 1992).
На клеточном уровне цитокинины стимулируют репликацию ДНК, а также синтез всех типов РНК за счет увеличения активности РНК-полимераз; стимулируют формирование мембранного аппарата хлоропластов, их рост и деление; в клетках семядолей стимулируют образование митохондрий и шероховатой эндоплазматической сети, а также увеличивают активность ряда ферметов и играют роль в мембранном транспорте (Кулаева, 1982, Boerjan et al, 1992, Chaudhary et al, 1993; Chory et al, 1994; Yuetal,1998)
Основу молекулы цитокининов и его синтетических аналогов составляет аденйн, у которого в положении б имеется боковая цепь (рис.1) Замещающая группа может содержать кольца различного строения Наличие циклического радикала в боковой цепи и длина боковой цепи влияют на биологическую активность цитокининов (Brzbohaty et al, 1994)
Первый природный цитокинин - транс-зеатин (t-Z) был выделен из растений кукурузы в начале 60-х гг. прошлого века; с тех пор обнаружено целое семейство гормонов, относящихся к цитокининам (Letham, 1994) (рис 1)
Цитокинины обнаружены главным образом в активно делящихся тканях, корневая и апикальная меристемы, молодые листья и незрелые семена (Letham, 1994) Уровень цитокининов изменяется в зависимости от стадии клеточного цикла. Так, например, наибольшая концентрация цитокининов приходится на G2 и М стадии (Redig et al., 1996). Их уровень временно повышается в период созревания семян (Emery et al., 2000) и понижается в стареющих листьях (Nooden et al., 1990; van Staden et al., 1988). Уровень цитокининов также понижается, если растение испытывает дефицит азота, и повышается при добавлении этого макроэлемента в почву (Sakakibara et al., 1998; Takei et al., 2001; Takei et al., 2002; Taniguchi et al., 1998).
. Механизмы метаболической регуляции уровня растительных гормонов являются важным фактором контроля развитая растения. Концентрация биологически активных цитокининов регулируется благодаря поглощению цитокининов и их компартментализации внутри клетки, регуляции процесса биосинтеза, метаболическим превращениям различных форм, инактивацией и уровнем деградации (рис. 2), (Brandstatter and Kieber, 1998; Brinegar and Fox, 1985; Brinegar et al., 1985; Hooley, 1998; Hutchison and Kieber, 2002; Kaminek et al., 1997). В то время как сайты накопления цитокининов известны и изучены достаточно хорошо, сайты биосинтеза, как и сам процесс, активно изучаются в настоящее время (Miyawaki et al., 2004; Astot et al., 2000). В отличие от растений, биосинтез цитокинина у Agrobacterium tumefaciens изучен в большей степени (Akiyoshi et al., 1984; McGaw and Burch, 1995). Основной биохимической реакцией в пути биосинтеза цитокинина является изопентенилирование аденинового нуклеотида (AMP) с диметилаллилпирофосфатом (DMAPP). Катализатором этого процесса является фермент изопентенилтрансфераза (рис. 3 ).
Использование методов генной инженерии для изучения роли цитокининов в морфогенезе растений
Важную роль в изучении молекулярных механизмов действия цитокинина играют методы генной инженерии растений. Трансгенные растения, содержащие гены биосинтеза или деградации цитокинина, являются моделью для изучения многих процессов, связанных с ростом, развитием и дифференцировкой растений. Более того, изначально эти эксперименты были практически первым и единственным доказательством роли цитокининов в дифференцировке растений. Как было показано в ряде научных работ, связанных с исследованием влияния вставки бактериального гена биосинтеза цитокинина ipt на морфологические и физиологические параметры растений, подобная модификация приводит к изменению эндогенного содержания цитокинина в растении (Chang et al., 2003; Medford et al., 1989; Smigocki, 1991; Smart, 1991; Li et al., 1992). Трансгенные растения с геном ipt из А. tumefaciens характеризуются повышенным уровнем этого гормона в тканях растения. Такое изменение гормонального баланса влияет на многие морфофизиологические параметры трансформантов, подтверждая данные о роли цитокининов в жизни растения.
Для контролируемой экспрессии ipt ген помещают под промотор гена теплового шока hsp 70 дрозофилы (Schmuelling et al., 1993); кукурузы (Medford et al, 1989) и сои (Ainley et al., 1993). Подобными генными конструкциями были трансформированы растения табака и арабидопсиса (Medford et al., 1989).
Эффект трансформации проявляется фенотипически, его можно оценить визуально. Так, у трансгенных растений табака с Phsp-ipt конструкцией наблюдалась карликовость, уменьшение размеров листа и длины междоузлий, редукция корневой системы, менее развитая по сравнению с нормальными растениями сосудистая система и слабо выраженное апикальное доминирование (Smart, 1991). Конструкции, содержащие индуцибельные промоторы, достаточно широко применялись исследователями разных научных групп при изучении влияния сверхпродукции цитокининов на морфофизиологические процессы в растении (Medford et al., 1989; Schmuelling et al., 1989; Smart et al., 1991; Van Loven et al., 1993). Трансформированные растения были способны к формированию нормальной корневой системы, но при этом образовывали большое количество придаточных почек (по сравнению с контрольными нетрансформированными растениями), как в нормальных условиях, так и при индукции. Анализ содержания гормонов показал, что даже при отсутствии воздействия на промотор, т.е. в нормальных условиях, у трансформантов наблюдали повышенный уровень цитокининов по сравнению с контрольными растениями (Ma Mi et al., 2002). Кроме того, при индукции промотора (например, тепловом воздействии), уровень цитокининов продолжал возрастать, однако не всегда это сопровождалось какими-либо морфологическими изменениями (Medford et al., 1989; Smigocki, 1991). Наиболее важное замечание, которое высказывается в некоторых работах, заключается в том, что сам по себе тепловой шок может оказывать влияние на рост растения, таким образом «включая» экспрессию генов (Van Loven et al., 1993). Следовательно, такой тип экспрессии экзогенного гена ipt не может в полной мере объяснить взаимоотношения между сайтом, в котором происходит биосинтез гормона, и морфологическими изменениями у трансформантов по гену биосинтеза цитокинина. Ряд исследователей используют генные конструкции, в которых экспрессия гена ipt находится под контролем промоторов, регулируемых факторами окружающей среды, например, светом (Beinsberger et al., 1992); поранением (Smigocki, 1991) и другими внешними факторами, например, тетрациклином (Redig, 1996; Faiss et al., 1997), а также под контролем тканеспецифичных промоторов (Ma Mi, 2002). Использование таких генетических конструкций для трансформации позволяет более четко оценить эффект произведенной трансформации.
Для усиления экспрессии ген ipt помещают под сильный промотор 35 S вируса мозаики цветной капусты CaMV. Подобные генные конструкции были созданы для картофеля (Hobbie et al., 1994), тыквы (Spena, 1991) и некоторых видов табака (Binns et al., 1987; Spena, 1991).
В работе Фэисс и коллег (Faiss et al,, 1997) растения табака были трансформированы конструкцией, содержащей ген ipt под конститутивным промотором 35S гена вируса мозаики цветной капусты. Транскрипция этого гена в условиях эксперимента подавлялась высоким титром тетрациклинового репрессора. Отмечено, что дерепрессия транскрипции приводила к 50-кратному повышению уровня цитокининов в тканях растения. В различных растительных тканях было отмечено изменение уровня 16 различных цитокининовых метаболитов как следствие повышения ферментативной активности изопентенилтрансферазы (Gatz et al., 1992). Наибольшие изменения касались зеатинрибозида, его концентрация была выше, нежели остальных метаболитов. Кроме того, отмечено повышение уровня зеатина и дигидрозеатина, а также гликозидных производных. У растений контрольной группы подобные изменения не наблюдали. Последствия такого подъема уровня гормона ограничивались главным образом областью его биосинтеза. Авторы в данной работе делают вывод о роли цитокинина как длиннодействующего сигнала паракринной секреции «от корня к стеблю» (Faiss et al., 1997).
Метод агробактериальной трансформации in VIVO
Дл промотором нопалинсинтетазы (nos) (Vlasak a я трансформации был использован штамм A. tumefaciens, любезно предоставленный профессором Т. Шмуллингом (Т. Schmuelling, Institute of Biology, Applied Genetics, Freie Universitat Berlin, Berlin, Germany). Штамм содержит вектор pGV 3850 с геном ipt под конститутивным промотором 35S вируса мозаики цветной капусты, а также селективный маркерный ген nptll, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, определяющую проявление признака "устойчивость к канамицину", под промотором нопалинсинтетазы (nos) (Schell and Van Montagu, 1983). Для контрольной трансформации был использован штамм A. tumefaciens, любезно предоставленный профессором М. Онджеем (М. Ondrej, Institute of Plant Molecular Biology, Czechoslovakia). Штамм содержит вектор pCB 1346 с геном nptll под nd Ondrej, 1992).
Для трансформации использовали разведенную в 10 раз «ночную культуру» агробактерии в жидкой питательной среде Луриа-Бертани (LB) (Maniatis et al., 1989). Свежая ночная культура агробактериального штамма была перенесена при помощи микробиологической петли на рыльце пестика нераспустившихся бутонов. Возраст растений, подвергшихся трансформации (поколение То) составил около 60 дней. Соцветия помещали под изоляторы для завязывания семян путем самоопыления.
С помощью метода асептической культуры изолированных органов растений in vitro была изучена реакция трансгенных растений и родительских линий редиса на экзогенные цитокинины и ауксины.
Для получения асептического материала семена редиса стерилизовали 10 минут в смеси (1:1) 96% этилового спирта и 30% перекиси водорода. Стерильные семена проращивали на среде Мурасиге-Скуга (MS0) без фитогормонов (Сидоров, 1985). В качестве эксплантов использовали семядоли 5-7 дневных проростков, которые помещали на среды MS с добавлением экзогенных фитогормонов.
При изучении чувствительности эксплантов к цитокининам использовали среды MS с добавлением кинетина (10 мг/л) или синтетического аналога цитокинина 6-бензиламинопурина (БАП, 2 мг/л). Для изучения чувствительности к ауксинам использовали среды MS с добавлением соответственно: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 Д, 10 мг/л), нафтилуксусной кислоты (НУК, 2 мг/л) или индолилуксусной кислоты (ИУК, 1 мг/л). В качестве контроля экспланты выращивали на безгормональной среде MS0. Инкубацию проводили при температуре 20-23С и длине светового дня 16 часов. Чувствительность к 2,4 Д и кинетину in vitro оценивали через 30 дней по наличию некротических пятен на поверхности экспланта. Исследование реакции эксплантов на ауксины: НУК (2 мг/л) и ИУК (1 мг/л) проводили по трем параметрам: каллусообразование, корнеобразование и некрозообразование. Интенсивность каллусообразования, корнеобразования и некротизации анализировали визуально, оценивая площадь экспланта, вовлеченную в данный морфогенетический процесс. Оценку производили в баллах, отражающих интенсивность реакции (таблица 6).
Параллельно проводили изучение особенностей регенерации трансгенных растений и родительских линий редиса на среде с цитокинином. Для этого у проростков изолировали «точки роста» (апикальные меристемы проростков с прилежащей частью гипокотиля длиной 1 см) и помещали их для регенерации на среду MS с цитокинином (БАП, 2 мг/л). В качестве контроля использовали «точки роста» на безгормональной среде MSO. После 30 дней инкубации «точек роста» трансгенных растений и инбредных линий редиса на среде с БАП, у молодых растений оценивали образование корнеплодоподобных и опухолевых структур in vitro.
Выделение тотальной растительной ДНК.
Навеску деэтиолированных проростков редиса массой 0,5 г растирали пестиком в фарфоровой чашке, используя жидкий азот. Затем растительную массу помещали в пластмассовую микроцентрифужную пробирку и добавляли 500 мкл 2-кратного СТАВ-буфера для экстракции (состав: 50 мМ трис-НС1, рН=8; 5 М NaCl; 10 мМ ЭДТА; 2% СТАВ) и 10 мкл 20 мМ 2-меркаптоэтанола. После этого инкубировали 1 час в термостате при температуре +56С. Далее, экстрагировали равным объемом хлороформа в течение 0,5 часа и фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 12000 оборотах. Верхнюю фазу отбирали в чистую пробирку и добавляли 0,6 объема изопропанола для осаждения нуклеиновых кислот, после чего оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем центрифугировали в течение 20 минут при 12000 оборотах и удаляли супернатант. Осадок промывали 80% этанолом, высушивали, растворяли в 50 мкл стерильной дистиллированной воды. Хранили при температуре -20С.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Наличие вставки подтверждали методом ПЦР на ДНК из растений Ті - Т4 с использованием праймеров к селективному гену nptll. При анализе экспрессии целевого гена использовали метод ПЦР на матрице кДНК с праймерами к гену ipt
Полимеразные цепные реакции к гену nptll проводили в объеме 50 мкл, при температуре отжига 50С. ПЦР включала в себя 35 циклов. Для реакции использовали: ДНК - 0,100 мкг; каждого нуклеотида 2 ммоль; праймеров -10 мкмоль. ПЦР проводили на термоциклере «Applied Biosystems» с использованием полимеразы Т. aquaticus В работе для проведения всех ПЦР были использованы буфер, нуклеотиды и фермент фирмы «Силекс-М» (Россия), праймеры были синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Активность фермента Taq- полимеразы составила 2,5 единицы.
Получение растений редиса, трансгенных по генам биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы ipt и неомицинфосфотрансферазы прШ
Получение растений редиса, трансгенных по генам биосинтеза цитокинина изопентеншпрансферазы ipt и неомицинфосфотрансферазы прШ, включало в себя несколько этапов: агробактериальная трансформация in vivo растений То; самоопыление растений То, получение семян и получение растений Т1-Т4; анализ потомства на наличие вставки Т-ДНК методами ПЦР и Саузерн-гибридизации. оценку трансгенных растений по ряду морфофизиологических параметров, в том числе по наличию/отсутствию опухоли.
К настоящему времени создана и поддерживается коллекция трансгенных по генам ipt и nptll растений редиса, насчитывающая 4 поколения (пятое поколение - в семенах).
Для трансформации были отобраны 2 цветущих растения редиса линии №30 (далее растения То), у которых было протрансформировано 382 цветка.
В ходе самоопыления растений линии №30 (То) были получены семена, от которых в свою очередь было получено 47 растений Ті. Анализ наличия вставки Т-ДНК был проведен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймером к маркерному гену nptll. Результаты ПЦР-анализа ДНК этих растений показали присутствие фрагментов ожидаемой длины (0,5 kb) у 12 растений (рис. 10). В качестве маркерного гена для ПЦР анализа не был использован ген ipt, т.к. растения содержат в геноме гомологи этого гена (Takei et al., 2001; Kakimoto, 2001; Miyawaki et al., 2004), что могло привести к неоднозначной трактовке результатов трансформации.
Рисунок 10. Результаты полимеразной цепной реакции на ДНК трансформантов с праймерами к маркерному гену nptll A. tumefaciens. Пояснения: ММВ -маркер молекулярного веса, обозначен фрагмент размером 0,5 kb (0,5 т.п.н.); дорожка 1 - положительный контроль (см. «Условия эксперимента»); дорожка 2 - отрицательный контроль (см. «Условия эксперимента»); дорожки 3-Ю; 12-15 -ПЦР-продукты растений Ть 11 - отсутствие вставки маркерного гена у анализируемого растения.
В результате Саузерн-анализа мы наблюдали гибридизацию с меченым зондом ПЦР-продуктов, полученных на матрице ДНК агробактерии (положительный контроль), у части проанализированных трансгенных растений редиса (рис. 11).
Рентгенограмма Саузерн-блот гибридизации ДНК трансгенных растений с меченым Р зондом, полученным на основе ПЦР-продукта к гену nptll A. tumefaciens: ПК - положительный контроль (см. «Условия эксперимента»); НК - негативный контроль (см. «Условия эксперимента»); 1-5 - результат гибридизации с меченым зондом ПЦР-продуктов трансформантов.
Полученные данные подтверждают присутствие в ДНК растений редиса вставки маркерного гена nptll, что доказывает их трансгенную природу. Опухолевый фенотип отмечен у 8 из 12 растений Ті. Это так называемые фенокопии опухолевого роста, наблюдаемые на корнеплоде безопухолевой линии №30 после трансформации вектором, содержащим ген фермента биосинтеза цитокинина изопентенилтрансферазы ipt (рис. 12). У ПЦР-негативных растений случаи опухолеобразования не отмечены, как и у исходной линии №30.
Анализ фенотипа трансформантов также показал присутствие среди нормальных растений форм с отклонениями, а именно: с изменением окраски корнеплода и лепестков венчика (рис. 13).
Путем самоопыления растений Т были получены семена и высажены 62 растения Тг- Для дальнейшей работы нами было отобрано 4 трансгенных растения Ті, которые сохраняли вставку в ходе размножения: опухолеобразующие трансгенные растения (семьи №19, №45), а также растения, не образующие опухоли (семьи №32, №41).
В потомстве (Тг) опухолеобразующего растения Ті №19 было проанализировано 49 растений. По результатам ПЦР анализа вставка сохранилась только у 27 растений, среди которых только 7 были опухолеобразующие (рис. 14 а, б).
В потомстве (Тг) опухолеобразующего растения Ті №45 было получено 9 растений. Вставку Т-ДНК несло 8 растений и только 2 из них характеризовались наличием опухоли (рис. 15 а, б).
Потомство Тг от безопухолевого растения Ті №41 включало всего 3 растения, и лишь одно из них содержало вставку Т-ДНК и было безопухолевым (рис. 16 а, б; таблица 7). Исключение из семьи составило растение №32. Исходно растение №32 со вставкой Т-ДНК было безопухолевым, однако единственное полученное от него растение Тг оказалось опухолеобразующим. От данного растения было получено 9 растений Тз, среди которых только одно формировало опухоль.
