Введение к работе
Актуальность проблемы. Абиотические стрессы, такие как засуха, засоление, экстремальные температуры - первопричина уменьшения урожая (Воуег, 1982; Bray et al., 2000). Воздействие стрессовых факторов приводит к серии морфологических, физиологических, биохимических и молекулярных изменений, которые негативно сказываются на росте и продуктивности растений. Для сохранения роста и продуктивности растения должны адаптироваться к стрессовым условиям и включить специфические защитные механизмы. Механизмы молекулярно-генетического контроля толерантности растений к абиотическим стрессам основаны на активации и регуляции специфических генов. Эти гены вовлечены в целый каскад последовательных ответов на стресс, таких как восприятие и передача сигналов, активация транскрипционных факторов, защита мембран и белков, удаление свободных радикалов и токсических компонентов. Большой успех в области исследований стрессовых ответов растений на воздействие стрессовых факторов достигнут с использованием методов молекулярной генетики, которые позволили идентифицировать многие гены, индуцирующиеся во время стрессов. Особое место в этом занимают трансгенные растения, в которых «включаются» защитные механизмы за счет переноса и экспрессии гетерологичных генов, кодирующих функциональные гомологи растительных белков (Kuromori et al., 2009; Piruzian et al., 2006). Трансгенные растения использованы и используются в настоящее время для детального функционального анализа генов стрессового ответа и выяснения физиологической роли их белковых продуктов. Другой основной прорыв в области исследования механизмов стрессового ответа растений последовал в 2000 году после расшифровки генома Arabidopsis thaliana. Эта геномная информация позволила провести мониторинг профиля экспрессии для всех предсказанных генов. Несмотря на значительные успехи, наши познания механизма стрессового ответа на уровне целого растения еще весьма ограничены. Так, идентификация сенсоров и сигнальных путей стрессовых стимулов, понимание молекулярных основ взаимодействия между стрессами различного происхождения, идентификация ключевых факторов, связующих стрессовый ответ и процессы развития, выявление долговременных ответов у растений при множественных стрессовых условиях в природе, остаются первоочередными научными задачами. Решение этих научных задач необходимо для создания полной картины молекулярно-генетических механизмов стрессовых ответов у растений и применения полученных знаний для биотехнологического использования. Таким образом, для решения вышеизложенных задач необходимо создание новых экспериментальных моделей трансгенных растений, экспрессирующих гены, продукты которых могут участвовать в механизмах стрессового ответа растений. В частности, важное значение приобретают исследования по определению физиологической роли генов десатураз - ферментов, отвечающих за образование двойных (С=С) связей в цепях жирных кислот
(ЖК) и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран. Отметим, что ненасыщенные ЖК являются важными компонентами клеточных мембранных структур, и модификация их уровня имеет значение для текучести мембраны, интеграции в мембранах рецепторов, образования вторичных переносчиков и клеточных сигнальных механизмов, которые необходимы для функционирования клеток как в нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов.
Цель исследования: изучить экспрессию гена desk цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 в клетках бактерий (E.colf) и растений {Solarium tuberosum) и выяснить, можно ли изменить толерантность растений картофеля к стрессовым факторам за счет манипуляции ненасыщенностью ЖК липидов мембран, используя гены десатураз. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
Провести анализ нуклеотидной последовательности гена desk с целью оценки эффективности его экспрессии в клетках E.coli и Solarium tuberosum.
Клонировать нативный и сконструировать гибридный гены desk.
Провести сравнительное исследование экспрессии нативного и гибридного генов desk в бактериальных трансформантах.
Сконструировать экспериментальные модели трансгенных растений, экспрессирующие нативный и гибридный гены desk.
Провести сравнительное исследование экспрессии нативного и гибридного генов desk в трансформантах растений.
Исследовать композицию жирных кислот, интенсивность процессов перекисного окисления липидов и толерантность трансформантов растений к стрессовым факторам, а также их взаимосвязь с уровнем экспрессии целевого гена desk.
Научная новизна работы. Автором впервые проведено изучение экспрессии нативных и гибридных генов дельта-12-десатуразы в клетках прокариот (. coli) и эукариот (растения). Впервые продемонстрировано, что значительная достройка в С-концевой области Д12-десатуразы (до 25 кДА) не сказывается на каталитической активности десатуразы, но увеличивает количество продуктов реакции этого фермента в клетках штаммов-трансформантов Е. coli. Автор впервые обнаружил, что гетерологичная ацил-липидная десатураза эффективно экспрессируется в трансформантах растений, стимулирует биосинтез мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенных ЖК, что коррелирует с увеличением устойчивости трансформантов к пониженным температурам и фитопатогенам. Автором разработан новый метод мультиплексной ПЦР для анализа трансформантов картофеля, который позволяет за один цикл амплификации определять в геномной ДНК трансгенных растений последовательности нескольких генов.
Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: Научно-практической
конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях», Москва, 2006; Международной конференции «Генетика в России и мире», Москва, 2006; Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007; 3-й Международной конференции «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений», Минск, 2008; IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, 2008; Международной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты», Минск, 2008; Международной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Звенигород, 2008, и других.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на )i&. страницах машинописного текста, включая .4.Q. таблиц и ^Ррисунков. Список цитируемых литературных источников включает {.^наименования.
