Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание экспериментальных моделей трансгенных растений для функциональной геномики, как и успех в создании новых форм растений с заданными свойствами или использовании их в качестве продуцентов, зависит от эффективности экспрессии перенесенных (гетерологичных) генов. Эффективность экспрессии гетерологичных генов регулируется на разных этапах: транскрипции, трансляции, и стабильности их белкового продукта. Несмотря на значительные успехи в области генной инженерии растений, в настоящее время исследователи могут строго контролировать уровень экспрессии гетерологичных генов только на этапе транскрипции за счет использования хорошо изученных промоторов. При этом в большинстве случаев отмечается отсутствие корреляции между уровнем мРНК гетерологичного гена и уровнем белкового продукта гетерологичного гена. Это, вероятно, обусловлено тем, что не все мРНК гетерологичного гена эффективно транслируются. Несмотря на существование такой проблемы, генетические детерминанты (факторы), которые важны для эффективной трансляции мРНК гетерологичных генов (такие как 5'-нетранслируемые области, 5'-НТО) у растений, практически не изучены.
Следует также отметить, что отсутствие корреляции между уровнем мРНК гетерологичного гена и уровнем его белкового продукта может быть обусловлено и различием в стабильности белковых продуктов гетерологичных генов. В настоящее время для увеличения стабильности белковых продуктов гетерологичных генов, исследователи, в основном, используют подходы, которые основаны на изменении локализации синтезирующихся белковых продуктов. Например, за счет тканеспецифичных промоторов можно экспрессировать гетерологичный ген в разных тканях (таких как семена) или за счет лидерных последовательностей направить белковый продукт в разные компартменты растительной клетки (такие как хлоропласты, эндоплазматический ретикулум, апопласт). В этом случае увеличение стабильности белкового продукта гетерологичного гена обусловлено меньшей активностью протеолитических ферментов в таких тканях или компартментах. Однако, для многих исследователей ткане специфичная экспрессия гетерологичного гена или локализация его белкового продукта в различных компартментах растительной клетки зачастую не удовлетворяет как подход для увеличения стабильности белковых продуктов, в частности, при создании экспериментальных моделей растений для изучения физиологической роли генов. В связи с этим, необходим поиск дополнительных подходов, за счет которых можно изменять стабильность белковых продуктов гетерологичных генов у растений, в частности, использование белок-стабилизирующих партнеров.
В настоящее время имеется огромный объем геномной и экспрессионной информации, в том числе и по растениям, которые размещены в соответствующих базах данных. Следует отметить, что сейчас имеется
возможность, используя геномные и экспрессионные данные провести биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей, и выявить структурно-функциональные закономерности для генов, в том числе и выявить генетические детерминанты, за счет которых потенциально возможно модулировать эффективность трансляции мРНК гетерологичных генов и стабильность их белковых продуктов.
В связи с вышеизложенным, поиск генетических детерминант, важных для оптимальной экспрессии переносимого гена в растениях на уровне трансляции и стабильности белковых продуктов является актуальным направлением исследований.
Цель исследования — поиск и изучение ключевых генетических
детерминант, обеспечивающих высокоэффективную экспрессию
гетерологичных генов у растений, на уровне трансляции мРНК и стабильности их белковых продуктов. Для достижения этой цели нами были сформулированы следующие задачи:
-
Сконструировать экспрессионный вектор для транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растениях, несущий ген, кодирующий белок-супрессор «замолкания» генов в составе единой экспрессионной кассеты.
-
Определить характеристики 5'-НТО для растительных генов с разным уровнем экспрессии и вывести консенсусную последовательность 5'-НТО для растительных генов с высоким уровнем экспрессии.
-
Определить, можно ли за счет такой консенсусной последовательности 5'-НТО изменить уровень накопления белкового продукта гетерологичного гена в растениях.
-
Оценить новый алгоритм модификации кодонового состава гетерологичных генов для обеспечения эффективности их экспрессии в растениях.
-
Проанализировать частоты встречаемости триплетов, кодирующих вторую аминокислоту в зависимости от её функциональной роли (стабилизирующей или дестабилизирующей), у всех генов модельных растений.
-
Выяснить вклад кодона, соответствующего второй аминокислоте, в модуляцию уровня накопления белкового продукта гетерологичного гена за счёт изменения его стабильности.
-
Апробировать термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum в качестве белок-стабилизирующего партнёра, влияющего на стабильность белковых продуктов гетерологичных генов в растениях.
Научная новизна. Впервые на основе биоинформатического анализа большого числа генов растений с различным уровнем экспрессии выявлена консенсусная последовательность 5'-НТО, и экспериментально подтверждена ее эффективность в качестве генетической детерминанты позитивно влияющей на уровень накопления белкового продукта гетерологичного гена. Экспериментально доказана применимость нового алгоритма модификации кодонового состава гетерологичных генов для обеспечения эффективности их экспрессии в растениях. Впервые выявлено, что у всех генов модельных
растений частоты встречаемости триплетов, кодирующих вторую аминокислоту, сходны: при этом, триплет, кодирующий аланин (стабилизирующий аминокислотный остаток) и триплет, кодирующий аргинин (дестабилизирующий аминокислотный остаток), представлены в генах растениях с самой высокой частотой. Получено экспериментальное подтверждение функциональной роли второго аминокислотного остатка в модуляции уровня накопления белкового продукта гетерологичного гена за счёт изменения его стабильности. Доказано, что термостабильная лихеназа является эффективным белок-стабилизирующим партнёром и увеличивает стабильность белковых продуктов гетерологичных генов в растениях.
Практическая значимость. Сконструированные вектора и разработанные подходы могут быть использованы для экспрессии различных гетерологичных генов в растениях.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы», Минск, 2012 г.; 12-я и 13-я научные конференции молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2012 и 2013 гг.; IV Всероссийский симпозиум «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность». Москва, 2012 г.; Всероссийская научная конференция с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений». Москва, 2013 г.; X Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Казань. 2013.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц и 53 рисунка. Список цитируемых литературных источников включает 235 наименований.
