Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1 Состояние проблемы. 11
2.2 Определение взаимосвязи между последовательностями ДНК и их функциями 13
2.2.1 Инсерционный мутагенез. 14
2.2.1.1 Индукция инсерционных мутаций при помощи транспозонов 14
2.2.1.2 Индукция инсерционных мутаций при помощи Т-ДНК 15
2.2.1.3 Векторы для трансформации растений 19
2.2.1.4 Энхансеры. 22
2.2.1.5 Векторы специального назначения на основе фаговых систем рекомбинации. 25
27
2.3 Использование Arabidopsis thaliana в качестве модельного объекта молекулярно-генетических исследований высших растений.
2.3.1 Общие характеристики 27
2.3.2 Коллекции инсерционных мутантов A.thaliana 28
2.3.2.1 Коллекции loss-of-fimction мутантов 28
2.3.2.2 Коллекции gain-of-function мутантов 31
2.3.3 Морфологические мутанты. 33
2.4 Методы агробактериальной трансформации растений 34
2.5 Идентификация генов, меченных с помощью Т-ДНК 36
37
2.5.1 Амплификация методом ПЦР последовательностей ДНК, нуклеотидный состав которых неизвестен.
3.5.1 Метод инвертированного ПЦР (inverse PCR). 38
3.5.2 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с адаптерами. 40
3.5.3 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с вырожденными праймерами. 42
2.6 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК. 45
2.6.1 Интернет базы данных. 45
2.7 Итоги 47
Экспериментальная часть 48
3.Материалы и методы 48
3.1 Растительный материал i 48
3.2 Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе 48
3.2.1 Бактериальные штаммы 48
3.2.2 Плазмиды 49 3.3. Среды, использованные в работе. 50 3.3.1 Среды для культивирования бактерий. 50 3.3.2. Среды для выращивания растений A. thaliana. 51
3.3.2.1 Среда для выращиваниг растений A.thaliana in vitro 51
3.3.2.2 Среда для скрининга инсеционных мутантов A.thaliana in vitro 51
3.3.2.3 Среда для выращивания растений A.thaliana in vitro в присутствии A. tumefaciens 51
3.3.3 Антибиотики, использованные в работе. 52
3.4 Приготовление компетентных клеток E.coli 52
3.4.1 Приготовление клеток E.coli с низкой компетентностью. 52
3.4.2 Приготовление клеток E.coli со средней компетентностью. 53
3.4.3 Приготовление клеток Е.соИ с высокой компетентностыо для электропорации. 53
3.5 Трансформация штаммов E.coli 54
3.5.1 Быстрая трансформация клеток с низкой компетентностыо. 54
3.5.2 Трансформация клеток со средней компетентностью. 55
3.5.3 Трансформация клеток с высокой компетентностью (электропорация). 55
3.5.4 Отбор рекомбинантных плазмид. 55
3.6 Метод быстрого клонирования. 56
3.7 ПЦР-скрининг бактериальных колоний. 57
3.8 Трансформация A. tumefaciens. 57
3.8.1 Конъюгативный перенос. 57
3.8.2 Прямой перенос. 58
3.8.3 Трансформация при помощи электропорации. 58
3.9 Поверхностная стерилизация семян A. thaliana. 59
3.9.1 Быстрая стерилизация 59
3.9.2 Долгая стерилизация 59
3.10 Выращивание растений A. thaliana 59
3.10.1 Выращивание растений A. thaliana в стерильных условиях. 59
3.10.2 Выращивание растений A. thaliana в открытом грунте. 60
3.10.3 Выращивание трансгенных линий A. thaliana в стрессовых условиях. 60
3.11 Агробактериальная трансформация A. thaliana 61
3.11.1 Трансформация прорастающих семян. 61
3.11.2 Трансформация неопыленных бутонов взрослых растений. 61
3.12 Отбор трансгенных растений A. thaliana. 62
3.12.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana in vitro. 62
3.12.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana с помощью гербицида Баста. 63
3.12.2.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве. 63
3.12.2.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana на песке. 63
3.13 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana. 64
64
3.13.1 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana для ПЦР-тестирования. 64
3.13.2 Мини-препаративное выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana 64
3.13.3 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для клонирования и блот-гибридизации.
3.13.4 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для получения FST. 65
3.14 Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий. 66
3.14.1 Мини-препаративное выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток. 66
66
3.14.2 Препаративное выделение плазмидной ДНК из штаммов E.coli тепловым
методом.
3.14.3 Выделение плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей. 67
3.15 Очистка ДНК от примесей белков. 68
3.16 Очистка ДНК от примесей РНК. 68
3.17 Уменьшение объема пробы изо-бутанолом 69
3.18 Хроматографическая очистка ДНК 69
3.19 Очистка ДНК от агарозы. 70
3.19.1 Очистка ДНК при помощи трубчатого электрофореза. 70
3.19.2 Очистка ДНК при помощи электроэлюирования. 71
3.19.3 Очистка ДНК при помощи центрифугирования. 72
3.20 Стадии клонирования: рестикция, модификация и лигирование фрагментов ДНК.
3.20.1. Клонирование ПЦР-фрагментов 72
3.20.2. Приготовление Т-вектора. 73
3.21 Блот-гибридизация по Саузерну. 73
3.21.1 Рестрикция геномной ДНК. 73
3.21.2 Электрофорез и перенос на мембрану переваренной геномной ДНК. 74
3.21.3 Приготовление меченного зонда. 74
3.21.4 Гибридизация и радиоавтографирование. 74
76
3.22 Тестирование ДНК растений при помощи ПЦР. 74
3.23 ПЦР-амплификация области геномной ДНК A. thaliana, примыкающей к Т-ДНК инсерции. 3.23.1 Модифицированный метод ПЦР для локализаций инсерции. 77
3.24 Выделение РНК из растений 78
3.25 Синтез кДІ IK (обратная транскрипция). 78
3.25.1 Реакция обратной транскрипции. 78
3.25.2 Получение EST гена At3gJ8780 (геп «домашнего хозяйства», актин) 78
3.25.3 Получение EST гена At5gl0080. 79
3.25.4 Получение EST гена Atlg33390. 79
3.25.5 Получение EST гена At5g 13760. 79
3.25.6 Поучение полноразмерной кДНК гена At J g33390 79
3.26 Секвенирование ДІ IK. 80
3.26.1 Секвенирование в лаборатории 80
3.26.1.1. Подготовка стёкол 8 Г'
3.26.1.2. Приготовление геля. 81
3.26.1.3. Заливка ' 81
3.26.1.4. Форез 81
3.26.1.5. Послефорезная обработка 81 3.26.1.6.Автограф 82
3.26.2 Автоматическое секвенирование 82
3.27 Активизация гена Сге в трансгенных линиях A.thaliana 82
3.27.1 Обработка дексометазоном в стерильных условиях. 82
3.27.2 Обработка дексометазоном в открытом грунте. 82
3.28 Тестирование растений на наличие эмбриональных леталей 82
4. Результаты и обсуждение. 83
4.0. Постановка задачи 83
86
4.1 Создание системы векторов для индукции супер-экспрессии генов у двудольных растений.
4.1.1. Создание вектора pEnLox для получения индуцирующих инсерционных мутаций . 86
4.1.1.1. Проверка вектора pEnLox 90
4.1.1.2. Свойства вектора pEnLox 91
93
4.1.2. Создание вспомогательного вектора рСге для реверсий мутаций супер-экспрессии генов, вызванных действием энхансера.
4.1.2.1. Проверка вектора рСге 94
4.1.2.2. Свойства вектора рСге 94
4.1.3. Система векторов pEnLox/pCre. 97
4.2 Расширение коллекции инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana. 98
4.2.1. Трансформация растений Arabidopsis thaliana. 98
4.3 Анализ инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana. 100
4.3.1. Отбор трансгенных растений. 100
4.3.2. Установление наличия и количества инсерций. 101
4.3.2.1. Анализ расщеплений в ТЗ поколении 101
4.3.2.2. Проверка при помощи блот-гибридизации по Саузерну 102
4.3.2.3. Проверка наличия энхансера Т-ДНК, интегрированной в геном методом ПЦР 103
4.3.3. Установление точной локализации инсерций в геноме. 104
4.3.3.1. Модифицированный метод RC-PCR (miPCR) 104
4.3.3.2. Амплификация примыкающей к бордеру последовательности не известной
геномной ДІIK
4.3.3.3. Определение нуклеотидной последовательности ПЦР фрагментов 111
4.3.3.4. Компьютерный анализ полученных данных. 111
4.4. Проверка работоспособности системы векторов pEnLox/pCre. 113
4.4.1. Скрещивание Е-линий с С-линиями. 113
4.4.2. Отбор мутантов по двум селективным маркерам. 114
4.4.3. Удаление энхансера из состава интегрированной в геном Т-ДНК. 115
4.4.4. Проверка эффективности удаления методом ПЦР 115 4.5 Морфологические мутанты Arabidopsis thaliana 116
4.5.1. Поиск мутантов с измененной морфологией. 116
17
4.5.2. Идентификация генов, супер-экспрессия которых влияет на морфогенез Arabidopsis thaliana.
4.5.2.1 Линия Е9 , 118
4.5.2.2. Компьютерный анализ гена At5gl0080 118
4.5.2.3 Линия Е78 120
4.5.2.4. Компьютерный анализ гена Atlg33390. 120
4.5.2.5. Линия El34 122
4.5.2.6. Компьютерный анализ гена At5gl3760. 122
4.5.2.7. Поиск возможных гомологов исследуемых генов A.thaliana. 124
4.5.2.8. Поиск информации об экспрессии исследуемых генов. 125
4.5.2.9. Проверка уровня экспрессии близлежащих к инсерциям генов. 128
4.5.3. Реверсия Е-мутантов к фенотипу дикого типа. 129
4.5.4. Обсуждение проблемы дистального действия энхансеров 132
5. Заключение 134
6. Выводы 135
7. Публикации 136
8. Тезисы конференций, устные и стендовые доклады 137
9. Зарегистрированные данные 140
10. Список литературы
- Определение взаимосвязи между последовательностями ДНК и их функциями
- Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе
- Агробактериальная трансформация A. thaliana
- Создание вектора pEnLox для получения индуцирующих инсерционных мутаций
Введение к работе
1.1 Актуальность темы.
Расшифровка полной нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana в конце 2000 года позволила реально перейти к решению центральной проблемы молекулярной генетики высших растений1 -идентификации функции генов: Для определения функций генов-используются методы как прямой, так и обратной генетики. В» случае использования подходов прямой генетики создается коллекция мутантов, среди которой проводится отбор-кандидатных генов по»фенотипу. Подход обратной генетики используют уже полученные данные о состоянии генома, о наличии и локализации.мутаций. В этом случае возможен перенос-данных, полученных на любых растениях.
При изучении таких объектов, как микроорганизмы и животные для определения функциональной значимости отдельных генов, широко используется ген-направленный мутагенез, связанный с замещением интактных генов мутантными путем гомологичной рекомбинации (Bouchez, Hofte, 1998; Rijkers et al., 1998). Однако у высших растений применение такого подхода затруднено, если вообще возможно. Это связано с относительно низкой эффективностью гомологичной рекомбинации (Klutstein et al., 2008) и, напротив, высокой эффективностью незаконной рекомбинации в соматических клетках (Puchta, Hohn, 1996). В этой связи основным методом при определении функциональной значимости генов у і высших растений, и в первую очередь у A. thaliana, является метод инсерционного мутагенеза (Огаркова и др., 1997; Томилов и др., 1999).
Несмотря на то, что кроме A. thaliana существует ряд других видов высших растений, изучение структурной организации генома которых активно ведется во многих лабораториях мира, A. thaliana остается самым удобным объектом для функциональной геномики. Так, например, размеры геномов Arabidopsis thaliana и Oryza sativa отличаются в 4 раза, тогда как общее количество генов в гаплоидном состоянии у этих двух растений приблизительно одинаковое. Таким образом, эффективность, использования, инсерционного мутагенеза на О. Sativa значительно ниже.
В последние 15-20 лет были разработаны методы для эффективного массового получения инсерционных мутантов Л. thaliana (Feldmann et. al., 1987, Bechtold et. al., 1993). В результате были созданы представительные коллекции мутантных линий A. thaliana, семена, которых собраны в коллекционных центрах ABRC (http://www.arabidopsis.org/abrc/), NASC (http://arabidopsis.info/); SALK (http://signal.salk.edu/), SAIL (http://www.tmri:org/en/partnership/sair collection.aspx) и GABI (http ://www. gabi-kat.de/).
Анализ этих коллекций приводит к тому, что число идентифицированных генов стремительно растет (D. Bouchez, Н. Hofte, 1998). Если в начале 90-х годов их число исчислялось десятками, то в конце 90-х годов число таких генов составило уже около 1000 (Meinke, Koornneef, 1997), а в начале 2008г. в интернет базе данных TAIR содержалась информация о функциях более чем 6400 генов, разделенных" на 866 семейств (http://www.arabidopsis.org/info/genefamily/genefamily.html).
Однако большинство созданных коллекций, инсерционных мутантов содержат линии, несущие /ш/-мутации, или так называемые loss-of-function мутации, которые позволяют определять функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития растений генов. Этот факт заранее .свидетельствует о том, что исследовать функции всех генов, используя только loss-of-function тип мутаций-, невозможно. Это ограничение спектра инсерционных мутаций является осложняющим моментом при исследовании связи между событиями в ДНК хромосомой их фенотипическим выражением. В частности, инсерционные мутации этого типа в генах, функционирующих в экстремальных условиях среды, в стандартных условиях не приводят к проявлению мутантного фенотипа. В этой связи актуальной является задача расширения спектра мутаций, вызванных инсерцией в геном клеток растений. Этим обусловлен интерес к индукции мутаций другого типа, например, мутаций, вызывающих суперэкспрессию генов. Индукция мутаций такого рода достигается с помощью векторов, Т-ДНК которых содержит около одного из бордеров сильный промотор (или энхансер транскрипции). Инсерция Т-ДНК в этом случае может вызывать увеличение во много раз экспрессии как близлежащих генов, так и, в некоторых случаях, генов, располагающихся за несколько тысяч пар оснований нуклеотидов (Weigel et al., 2000). Такой тип мутаций получил название gain-of-function мутаций.
Однако когда структура инсерции содержит энхансер транскрипции, при ее встраивании в геном растения, могут возникать мутации двух типов: nul-мутации, связанные с инактивацией гена при встраивании в него инсерции, и мутации, обусловленные наличием сильного промотора в структуре инсерции. При массовом получении и анализе инсерционных мутаций, полученных с помощью такого рода векторов, необходимо иметь относительно простую и эффективную систему идентификации loss-of-function и gain-of-function мутаций.
В этой связи в данной работе были поставлены следующие цели и задачи.
Определение взаимосвязи между последовательностями ДНК и их функциями
Для установления связи между структурой и функцией гена нужно изменить экспрессию этого гена. Это достигается несколькими методами, например замена исходного гена на мутантный при помощи гомологичной рекомбинации (Bouchez, Hofte, 1998; Rijkers et al., 1998), однако этот подход не применим в случае высших растений из-за явления: незаконной рекомбинации (Puchta, Hohn, 1996; Klutstein et al., 2008). Во-вторых, использование методов деградации определенных РНК — РНК-интерференция (Kooter, Мої, 1993; Baulcombe, 1996; Gui-Li et al, 2008). Этот метод используется для исследования генов высших растений, но тоже имеет недостатки, связанные с отсутствием полного понимания хода событий, происходящих в клетке при-РНК-сайленсинге (Tissier et al., 1999). Наиболее удобным является метод индукции мутаций, в частности, так называемых инсерционных мутаций (Feldmann, Marks; 1987; Bechtold et al., 1993).
Инсерционный мутагенез подразумевает собой инсерции любых последовательностей ДНК в любой участок генома. Наиболее частое инсерционные мутации встречаются при спонтанных хромосомных перестройках и при миграции мобильных элементов генома. Для изучения структурно-функциональной организации геномов используется инсерционный мутагенез, где в качестве инсерции используются фрагменты ДНК с известной нуклеотидной последовательностью (Bouchez, H6fte,,1998).
Существует два основных природных агента, которые способны вызывать инсерционные мутации. Это мобильные генетические элементы (McClintok, 1948; Speulman et al., 1999; Tissier et al., 1999; Parinov et al., 1999; Wang et al., 2008) и почвенные агробактерии: Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes. Т-область Ті- и Ri-плазмид этих бактерий является звеном природной системой переноса и включения чужеродных растениям генов в их геном, которая широко используется исследователями для получения трансгенных линий высших растений (Feldmann, Marks, 1987; Azpiroz-Leehan, Feldmann 1997; Krysan et al., 1999; Hiei, Komari, 2008).
Мобильные элементы уже давно используются для индукции мутаций в растениях. Для внедрения мобильных элементов в геном исследуемых растений использовались Т-ДНК (Tissier et al., 1999). Из Т-ДЫК удалялись все гены, задействованные при формировании опухоли, и туда помещался мобильный элемент. Для получения коллекций инсерционных мутантов используются мобильные элементы, содержащие маркерные гены, которые позволяют отслеживать перемещение транспозонов в геноме, и контролируемые индуцибельными промоторами гены транспозаз (Finkelstein, Somerville, 1987; Parinov et al., 1999; Tsugeki et al., 1999; Fridborg et al, 1999; Tissier et al., 1999). Использование мобильных элементов в качестве индукторов инсерционных мутаций обладает одним значимым преимуществом, заключающемся в простоте получения ревертантов, за счет эксцизии транспозона по концевым повторам (Tissier et al., 1999; Speulman et al., 1999; Tsugeki et al., 1999). Однако в большинстве случаев, после события эксцизии в исходном сайте инсерции остается, как минимум, несколько нуклеотидов концевого повтора, что зачастую вызывает сдвиг рамки считывания и препятствует реверсии. Этот факт является основным недостатком использования мобильных элементов в инсерционном мутагенезе и, наряду с трудностью получения гемизиготных мутантов, значительно усложняет исследования инсерционных мутантов (Speulman et al., 1999).
После выявления исследователями причин возникновения некоторых типов опухолей у растений, вызванных переносом генов от клеток Agrobacterium в клетки растений, где они интегрировались в геномную ДНК, в составе Т-области специальных агробактериальных плазмид - Ті (tumor inducing) и Ri (root inducing), агробактерии стали широко использоваться для молекулярно генетических манипуляций.
Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе
Для сокультивирования семян A. thaliana с клетками A. tumefaciens использовали среду В5 следующего состава: 2,5 г/л KN03, 150 мг/л СаС12 х 2Н20, 250 мг/л MgS04 х 7Н20, 134 мг/л (NH4)2S04, 150 мг/л NaH2P04 х Н20, 0,75 мг/л KJ, 3,0 мг/л Н3В03, 10,0 мг/л MnS04 х 5Н20, 2,0 мг/л ZnS04 х 7Н20, 0,25 мг/л Na2Mo04 х 2Н20, 0,025 мг/л CuS04 х 5Н20, 37,3 мг/л №2ЭДТА, 27,8 мг/л FeS04 х 7Н20, 0,25 мг/л СоС12 х 6Н20. Витамины: 100,0 мг/л мио-инозита, 1,0 мг/л никотиновой кислоты, 1,0 мг/л пиридоксина-НС1, 10,0 мг/л тиамина-НС1 и 20 г/л сахарозы, рН 5,5 добавлялись в среду перед автоклавированием.
Для введения большого количества плазмидной ДНК в бактериальные клетки E.coli, в случаях, когда не требовалась высокая эффективность компетентных клеток, использовали методику, отличающуюся простотой и не требующую много времени.
Свежую (1-2 суток) колонию с агаризованной среды LB ресуспендировали в 50 мкл охлажденного до 0С, стерильного буфера следующего состава: 50 мМ СаС12, 10 мМ Трис - НС1, рН 8,0. После инкубации суспензии клеток в течение 30 - 60 мин при 0С ее использовали непосредственно для трансформации.
Таким образом, удавалось получить компетентные клетки эффективностью 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДІЖ.
В случаях трансформации рекомбинантными плазмидами, полученными вследствие лигирования по липким концам, использовались бактериальные клетки со средней компетентностью. К 100 мл среды для выращивания (раствор А) компетентных клеток содержащей 1г триптона, 0,5 г дрожжевого экстракта, 1 г NaCl после автоклавирования добавляли 5 мл
25%-го стерильного MgS04, 500 мкл стерильного 40%-го раствора глюкозы и заражали при помощи 200 мкл ночной культуры DH5a, XLlBlue либо JM109 или JM110 выращенной в жидкой среде SOB. Растили на качалке при 37С строго 2 часа, охлаждали и осаждали центрифугированием 10 мин при 5000g. Ресуспендировали осажденные клетки в 1 мл раствора А и добавляли 2,5 мл охлажденного до 4С раствора В (36% глицерина, 12% PEG 7500, 12мМ MgS04 7H20), разливали во льду по 200 мкл по микроцентрифужным коническим пробиркам на 1,5 мл, замораживали в жидком азоте и хранили на -70С.
Таким образом, удавалось получить компетентные клетки эффективностью 10 -10 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
В случаях трансформации рекомбинантными плазмидами, полученными вследствие лигирования по тупым концам, требовалась высокая компетентность бактериальных клеток.
Бактериальные штаммы DH5a, XLlBlue либо JM109 или JM110 выращивались в жидкой среде SOC в небольшом объеме до оптической плотности 0,6 (OD6oo=0,6). Затем 1-5 мл этой ночной культуры добавляли в 5001 мл жидкой среды SOC и снова растили до оптической плотности 0,6 (OD6oo=0,6), приблизительно 3 часа. После достижения необходимой оптической плотности суспензию центрифугировали 5000 об/мин 15 минут, помещали пробирки в ледяную баню и промывали осажденные клетки одним литром охлажденной до 0С Н20. Снова центрифугировали 5000 об/мин 15 минут в центрифуге с охлаждением при 4С. Затем промывали еще один раз при помощи 500 мл охлажденной до 0С Н20. Осаждали клетки центрифугированием 5000 об/мин 15 минут при 4С. Вторично промытые клетки ресуспендировали в 20 мл 10%-огостерильного раствора глицерина и снова осаждали центрифугированием 5000 об/мин 15 минут при 4С Полученный осадок клеток ресуспендировали в 4 мл 10%-ого стерильного раствора глицерина, аликвотили по 50 мкл и замораживали в жидком азоте.
Таким образом, удавалось получить компетентные клетки эффективностью до 109 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
Для быстрого введения нативных плазмид в штаммы Е. со И использовали метод кальциевого шока (Гловер, 1988).
10 мкл пробы, содержащей 0,1-1 мкг ДНК, добавляли в суспензию клеток, перемешивали!и инкубировали при 0С 30 мин, а затем прогревали при температуре 42С на водяной бане в течение 60-90 секунд (в зависимости от штамма). После охлаждения инку бата, проводили регенерацию бактериальных клеток путем подращивания при 37С 1 час с добавлением 1 мл жидкой среды SOC или LB.
Агробактериальная трансформация A. thaliana
Трансгенные линии, полученные с помощью вектора рСге, отбирались из общего семенного пула после трансформации на среде содержащей 30мг/л антибиотика гигромицина. После поверхностной стерилизации семена Рисунок 13. Устойчивое к антибиотику гигромицину высевались на чашки Петри и трапсгешое растение на фоне взращивались в течение двух недель до неустойчивых растений дикого типа. стадии второй пары настоящих листьев, когда устойчивые растения начинали заметно отличаться от неустойчивых (Рис. 13). Затем отобранные трансформанты пересаживали в открытый грунт и растили до сбора семян следующего поколения. Более долгая культивация растений на селективной среде с маркерным антибиотиком недопустима по двум причинам. Даже на устойчивые трансгенные растения гигромицин оказывает токсическое действие, что сказывается на сильном снижении жизнеспособности растений, а также наличие агробактерий, в первом после трансформации поколении, приводит к сильному закисленню среды во время их роста и размножения, что становится критическим после 18 дней культивации. Отбор трансгенных растений A. thaliana с помощью гербицида Баста. Трансгенные линии, полученные с помощью вектора pEnLox, отбирались из общего семенного пула после трансформации на песке или почве с помощью гербицида Баста. Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве.
Для селекции устойчивых к гербициду линий из небольшой выборки семян, растения высевались в почву с плотностью 5-8 семян на см , и проращивались 5-6 дней до стадии Рисунок м Устоичивые к гербщиду полноценных семядолей. Затем Б"ста трансгенные растения на фоне неустойчивых погибших опрыскивали их из пульверизатора растений дикого типа. раствором Баста 250мг/л ( 0,5мМ) 6 раз через 2-3 дня в течении двух недель до появления ярких различий между устойчивыми и неустойчивыми растениями (Рис. 14). Затем трансформанты пересаживались в новую почву и выращивались до сбора семян. Для селекции трансгенных растений из больших выборок семян отбор проводили на песке. В данном случае раствор гербицида 7,5мг/л (38мкМ) Рисунок 15. Устойчивое к гербициду доливался непосредственно в поддон Баста трансгенное растение на фоне неустойчивых растений дикого типа. емкостей с песком, на дно которых добавлялась гидропоника. За счет осмотических сил песок пропитывался раствором и на него высаживались порции семян с большей плотностью до 30 семян на см . Взращивание проводилось в течение 3-4 недель (в песке практически отсутствуют какие-либо питательные элементы и рост происходит в основном за счет эндосперма соответственно более медленно). Затем отобранные линии также1 пересаживали в почву и растили до сбора семян (Рис. 15).
Производилось путем выдавливания клеточного сока из молодых листьев растений через одноразовый пластиковый носик на 200 мкл, укороченный с широкой стороны (для микропипетки) набитый ватой, центрифугированием при 13000 об/мин 10 минут. Полученный раствор затем разводился в 10-100 раз. 25-40 мг ткани растения і замораживали в жидком азоте и дезинтегрировали в присутствии равного количества оксида алюминия А1203. Затем добавляли 400 мкл лизирующего буфера (1М Tris, 5М NaCl, 0,5М EDTA, 10%SDS), перемешивали и инкубировали 20-40 минут на водяной бане при 65С, затем добавляли 200 мкл 5М раствора ацетата калия СН3СООК, перемешивали и инкубировали 20 минут на ледяной бане. Затем центрифугировали микропробирку типа эппендорф (1,5 мл) с лизатом 15 минут на 13000 об\мин. Супернатант объемом 450 мкл переносили в новый эппендорф и осаждали двумя объемами этилового спирта. Средний выход ДНК составлял 1 мкг на 40 мг ткани.
СТАВ - гексадецилтриметиламмониумбромид, ДНК преципитирующий агент, использующийся в этом и следующем методе, позволял получать из тканей растений высокочистые препараты ДНК, пригодные для использования при блот-гибридизации (Rogers, Bendich, 1988). В работе использовали модифицированный метод.
Создание вектора pEnLox для получения индуцирующих инсерционных мутаций
Вектор рСге предназначен для получения трансгенных линий растений, содержащих экспрессирующийся ген рекомбиназы Сге (рис. 31, позиции 4903-3685), которая участвует в сайт-специфической рекомбинации фага Р1. і В Т-ДНК ген сге находится под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (рис. 31, позиции 5839-5071). Синтез рекомбиназы Сге, может идти в клетках агробактерий, так как промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты обладает слабой активностью в бактериальных клетках. Это приводит к нежелательной рекомбинации ДНК векторной плазмиды до трансформации растений. Чтобы блокировать этот процесс, в ген рекомбиназы Сге искусственно введен интрон (рис. 31, позиции 4471-4282). 3 -конец гена сге содержит GR-элемент (глюкокортикоидный рецептор) транскрипционного фактора (рис. 31, позиции 3678-2845), что регулирует функцию рекомбиназы Сге. Из-за неправильной трансляции мРНК этого гена, вследствие отсутствия у прокариот сплайсинга, рекомбиназа не будет функционировать в клетках бактерий. При экзогенной обработке растений (например, опрыскивании пульверизатором) дексометазоном - соединением, взаимодействующим с GR-элементом, этот рекомбинантный белок получает способность проникать через ядерную мембрану и контактировать с геномной ДНК непосредственно для рекомбинации. Наличие в Т-области селективного маркера hygR (рис. 31, позиции 1341-316) дает возможность проводить четкий отбор трансгенных растений, а также значительно упрощает отбор двойных мутантов, получаемых после упрощенного (без кастрации растений-реципиентов) скрещивания линий, несущих этот ген, с линиями, содержащими Т-ДНК вектора pEnLox и устойчивыми к гербициду BASTA. Вектор рСге также был зарегистрирован в международной интернет базе данных NCBI GenBank (Genbank ID: Р064563П. Система двух векторов pEnLox и рСге используется следующим образом. CaMV 35S промотор в составе Т-ДНК плазмидного вектора pEnLox окружен ZoxP-сайтами. Следующее поколение от скрещивания исследуемого инсерционного мутанта, полученного путем трансформации вектором pEnLox, с другой трансгенной линией A. thaliana, несущей, ген сге, высевается in vitro на селективную среду с антибиотиком гигромицином и после отбора устойчивых растений обрабатывается экзогенно дексаметазоном, в результате чего происходит удаление последовательности CaMV 35S промотора. После вырезания энхансера транскрипции, в последовательности Т-ДНК, по прежнему встроенной в геномную ДНК, остается ген гербицид устойчивости с промотором и один из /ш:Р-сайтов. Таким образом этот остаток Т-ДНК преобразуется в обычный тип инсерций, которые используются для получения яи/-мутантов, а сам мутант, после вырезания CaMV 35S промотора, преобразуется в обычного ли/-мутанта. Необходимо еще раз подчеркнуть, что целью создания представленной системы, векторов является получение коллекции инсерционных мутантов с конститутивной экспрессией генов, а так как для индукции суперэкспрессии необходимым требованием является локализация инсерций в межгенном пространстве, то этот остаток впоследствии никак не влияет на функционирование окружающих генов.
При удалении из состава Т-ДНК последовательности CaMV 35S промотора, уровень транскрипции исследуемого гена падает до уровня дикого типа и соответственно исчезает мутантный фенотип. Реверсия к дикому типу не всегда проявляется на 100% в» первом после скрещивания поколении «двойных мутантов» и зависит от стадии развития растения, на которой началась обработка дексаметазоном, но во втором поколении фенотип полностью соответствует дикому типу.
Учитывая тот факт, что вырезание cre-рекомбиназой фрагментов ДНК, заключенных между /ог-сайтами протекает с высокой эффективностью, восстановление инсерционным мутантом фенотипа растения дикого типа происходит уже во втором поколении. Созданная система векторов позволяет индуцировать инсерционные мутации и дифференцировать возможное влияние на мутантный фенотип, которое может быть связано либо с подавлением функции гена при встраивании в него инсерции, либо с суперэкспрессией близлежащих генов за счет наличия в структуре инсерции последовательности энхансера транскрипции.
