Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1. Генетический контроль развития цветка 7
2. Редукция брактей в семействе Cruciferae 29 Материалы и методы 38
1. Линии Arabidopsis, использованные в работе 3 8
2. Условия выращивания растений Arabidopsis 39
3. Метод сканирующей электронной микроскопии 40
4. Метод окрашивания 40
5. Морфометрия 40
6. Молекулярно-генетическое картирование 41
7. Культура ткани in vitro АА
8. Выделение нуклеиновых кислот 44
9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 45
10. Обратная транскрипция, совмещенная с полимеразной цепной реакцией 45 (ОТ-ПЦР)
11. Секвенирование 49
12. Электрофорез в агарозном геле 50
13. Компьютерные методы анализа 51
Результаты и обсуяадение 52
1. Морфологические особенности мутанта bractea 52
2. Участие гена BRA в процессе редукции брактей у A. thaliana 58
2.1. Взаимодействие гена BRA с генами J AG и ВОР 5 8
2.2. Взаимодействие гена BRA с генами LFY и AGL8, AGL20 60
2.3. Взаимодействие гена BRA с геном FIL 62
3. Взаимодействие гена BRA с генами TLF1, LFYKAPI при формировании соцветия и цветка у A. thaliana
3.1. Взаимодействие гена BRA с геном TLF1 63
3.2. Взаимодействие гена BRA с геном LFY 63
3.3. Взаимодействие гена BRA с геном API 65
4. Взаимодействие гена BRA с генами АВС-модели 66
4.1. Взаимодействие гена BRA с геном ЛР2 67
4.2. Взаимодействие гена 5&4 с геном AG 70
4.3. Взаимодействие гена BRA с генами АРЗ иР1 71
5. Взаимодействие гена BRA с геном /Р 73
6. Анализ аллелизма мутаций ant и 6га и изучение взаимодействия генов ANTuBRA 73
7. Анализ чувствительности мутанта bra к фитогормонам 75
8. Молекулярно-генетическое картирование гена BRA 77
9. Анализ генов-претендентов на роль гена BRA при помощи баз данных 79
10. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов 85 ATMYB32 и GATA-3
Заключение 88
Выводы 90
Список публикаций по теме диссертации 91
Список литературы
- Генетический контроль развития цветка
- Условия выращивания растений Arabidopsis
- Взаимодействие гена BRA с геном TLF1
- Анализ чувствительности мутанта bra к фитогормонам
Введение к работе
Изучение генетической регуляции процессов развития соцветия и цветка и идентификация генов, контролирующих этот процесс, имеют большое значение для совершенствования методов сельскохозяйственной биотехнологии растений и создания новых форм трансгенных растений с изменениями архитектуры соцветия и цветка. Последние 20 лет Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, принадлежащий к семейству Cruciferae, является одним из основных растительных модельных объектов для исследования процессов морфогенеза (Ежова, 1999).
Приоритет открытия этого генетического объекта принадлежит отечественным ученым. В 1932 -1933 г.г. Б.М. Козо-Полянским была организована экспедиция ленинградского ботанического института в район озера Эльтон для сбора растений - эфемеров. Уже в 1935 году вышла работа "Поиски ботанической дрозофилы". Главным выводом была рекомендация использовать A. thaliana в качестве перспективного генетического объекта (Титова, 1935). Благодаря малому размеру генома, самоопыляемости, короткому жизненному циклу и высокой плодовитости A. thaliana в настоящее время стал излюбленным объектом генетических исследований. К 2000 году в результате выполнения многонационального проекта было завершено полное секвенирование генома A. thaliana расы Columbia (Col) (Arabidopsis Genome Initiative, 2000), что во многом упростило работу по идентификации новых генов и генетических систем, включенных в различные стадии морфогенеза растений.
Как и подавляющее большинство видов семейства крестоцветных A. thaliana формирует открытое соцветие без прицветных листьев (брактей). Поэтому генетическому контролю редукции брактей и развитию открытого соцветия у А. thaliana в последнее время уделяется большое внимание, и у этого вида известно несколько одиночных и двойных мутантов, формирующих брактей и ТЦ. Изучение этих мутантов важно для понимания природы процессов, приводящих к формированию абрактеозного открытого соцветия у A. thaliana, а также для выяснения генетических механизмов эволюции морфологических признаков у растений. В последние годы накапливается все больше данных о существовании у растений регуляторных генов, изменения в которых приводят к появлению новых признаков, не свойственных изучаемому виду, роду и даже семейству (Doebley,
Lukens, 1998). Более того, показано, что генетически обусловленные изменения уровней экспрессии таких генов могут лежать в основе различий морфологических признаков, отличающих виды и более крупные таксоны (Baum, 2005; Bowman, 2006). Эти данные свидетельствуют в пользу теории скачкообразной эволюции и актуальности изучения генетического контроля систематических признаков у растений для изучения проблем эволюционной биологии. Особый интерес в этой связи приобретает изучение мутантов, которые характеризуются качественными изменениями основных систематических признаков. Один из таких уникальных мутантов - мутант bractea (bra) (от лат. bractea - прицветный лист) получен с помощью химического мутагенеза с использованием ЭМС на кафедре генетики МГУ. Ранее были начаты работы по морфологическому и генетическому изучению мутанта bra (Ежова, 1999; Ежова, Пенин, 2001; Пенин, 2003). В данной работе было продолжено исследование фенотипа мутанта, локализация гена BRA на молекулярно-генетической и физической картах A. thaliana, изучение механизма действия гена на молекулярном уровне.
Цель диссертационной работы:
Изучение роли гена BRA в регуляции морфогенеза цветоноса у A. thaliana и анализ его взаимодействия с тремя группами генов: инициирующими цветение, участвующими в процессах развития цветка и редукции брактей.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
морфологический анализ мутанта bra;
изучение взаимодействия гена BRA с генами, мутации в которых вызывают формирование брактей у A. thaliana',
изучение взаимодействия гена BRA с генами, контролирующими развитие соцветия и цветка у A. thaliana;
построение схемы генетической регуляции геном BRA процессов развития соцветия и цветка у A. thaliana;
уточнение положения гена BRA на молекулярно-генетической и физической картах 4-ой хромосомы A. thaliana.
Генетический контроль развития цветка
Изучение регуляции развития цветка - одно из самых интенсивно развивающихся направлений биологии. В конце 80-х годов у модельных генетических объектов A. thaliana и Antirrhinum majus были клонированы первые гены, участвующие в развитии цветка. С этого момента достигнут большой прогресс в понимании генетического контроля разных этапов этого сложного процесса, включающего 3 главных стадии: переход к цветению, формирование флоральных примордиев и развитие органов цветка (Weigel, Meyerovvitz, 1993; Krizek, Fletcher, 2005). Были идентифицированы гены, регулирующие пространственную и временную экспрессию генов, контролирующих развитие цветка. Открыты новые механизмы генетической регуляции экспрессии некоторых генов при развитии цветка малыми РНК (miRNA). Технология микроэррэй позволила обнаружить мишени генов, вовлеченных в процессы флоралыюго морфогенеза. В результате в последнее время было охарактеризовано большое количество генов, участвующих в процессах развития цветка (Krizek, Fletcher, 2005).
Ключевые гены инициации цветения. Развитие цветоноса растения -сложный многоэтапный процесс, зависящий от множества факторов внутренней и внешней среды. Среди внешних факторов основными являются продолжительность фотопериода, интенсивность света, температурные условия, питание и влажность, а также стрессовые факторы. Необходимо отметить, что важнейший вклад в изучение влияния фотопериода и температуры на процесс инициации цветения внесли работы выдающегося ученого М.Х. Чайлахяна и его последователей. Ими показано, что растение способно воспринять длину дня как стимул к цветению только после достижения определенного возраста («цветочно-спелого состояния»), т. е. внутренние факторы развития должны привести растение к определенному состоянию. После получения сигнала меристема не сразу образует видимые органы цветка. Этому предшествует период "скрытой подготовки" к цветению - "эвокация" (Чайлахян, 1937, 1988). Индуцированные фотопериодом листья, в соответствии с высказанной М.Х. Чайлахяном гормональной теории развития растений, посылают химические сигналы, инициирующие цветение, в меристему побега («флориген»). Гормональная теория развития растений М.Х Чайлахяна не потеряла своей актуальности и сегодня. Ее основные положения подтверждены современными физиологическими и генетическими исследованиями (Миляева, Романов, 2002; Аксенова и др., 2006).
Основная информация о генетическом контроле инициации цветения получена на A. thaliana. На Рис. 1 представлена схема генетической регуляции морфогенеза цветка у этого объекта (Blazquez, 2001). Видно, что среди основных контролирующих цветение генов, гены инициации цветения составляют большую часть (в верхней части Рис. 1 они окрашены в синий, фиолетовый и оранжево-красные цвета). Эти гены можно разделить на 4 основные группы: 1 группа (обозначены красным цветом) - гены светового пути, в том числе, гены рецепторов красного и синего света и гены световой сигнальной цепи; 2 группа (обозначены синим цветом) - гены, воспринимающие температурные сигналы; 3 группа (обозначены фиолетовым цветом) - гены, участвующие в контроле статуса питания; 4 группа (обозначены оранжевым цветом) - гены синтеза гиббереллина (именно этот фитогормон у A. thaliana играет роль флоригена) и передачи гиббереллинового сигнала. Гормональные сигналы являются основным связующим звеном между разными путями инициации цветения (световым и трофическим), а также осуществляют координацию развития и ответных реакций различных частей растения. Сигналы из внешней и внутренней среды передаются по сигнальным путям на уровень регуляции действия генов, контролирующих развитие ФМ (Blazquez, 2001; Simpson et al., 2002).
Основной мишенью большинства сигнальных путей инициации цветения является ген LEAFY (LFY), присутствующий в геноме в одной копии и кодирующий транскрипционный фактор, который не имеет гомологии ни с одним из известных белков животных и микроорганизмов (Weigel et al., 1992). На стебле мутантов ify вместо цветков формируются боковые побеги в пазухах стеблевых листьев (Рис. 2Г, І2Б). Только на верхних ярусах соцветия могут формироваться цветки (особенно у аллелей с низкой экспрессивностью мутантного признака). Морфология цветков, как правило, аномальная: органы расположены не в виде мутовок, а спирально, число органов цветка редуцировано (Schultz, Haughn, 1991; Weigel etal., 1992).
Экспрессия гена LFY наблюдается в AM при формировании листовых примордиев и усиливается с возрастом растений (Weigel ct а!., 1992; Blazquez et al., 1997; Hempel et al., 1997). Предполагается, что достижение порогового уровня экспрессии гена LFY является тем критическим фактором, который обеспечивает переключение AM растений с процесса формирования примордиев листьев на процесс формирования флоральных примордиев. Важная роль гена LFY в образовании флоральных примордиев была подтверждена и в экспериментах с трансгенными растениями A. thaliana, в которых ген LFY конститутивно экспрессируется под контролем активного промотора гена 35S вируса мозаики цветной капусты (Weigel, Nilsson, 1995). Формирование цветков у трансгенных растений наблюдали значительно раньше, и в тех участках, где у растений дикого типа обычно формировались стеблевые листья с пазушными почками (Рис. 2А). Показано, что ген LFY также играет важную роль в регуляции экспрессии гомеозисных генов APETALA1 (API) и AGAMOUS (AG) (Parcy et al., 1998).
Помимо гена LFY важную роль в индукции флоральных примордиев играют гены UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) и API. Мутанты по гену UFO похожи на мутантов по мягким аллелям гена LFY (Рис. 12Г), хотя вызывают более существенное нарушение в структуре цветков, особенно во 2-ой и 3-ей мутовках. Ген UFO кодирует белок, содержащий F-домен, найденный у ряда белков, связанных с регуляцией клеточного цикла. Поскольку мутантные гены Ify показывают эпистаз по отношению к и/о, гены LFY и UFO могут принимать последовательное участие в процессе, ведущем к формированию ФМ (Levin et al., 1995; Wilkinson, Haughn, 1995; Hepworth et al., 2006).
Условия выращивания растений Arabidopsis
Материал фиксировали в 4% глютаральдегиде в 0.025М фосфатном буфере Na2HP04+NaH2P04 (рН=7.0) при 4С в течение 18 часов, инкубировали в 2%-4% Os04 в течение 24 часов при 4С, 3 раза промывали фосфатным буфером, обезвоживали серией спиртов (30%, 50%, 70%- 10-15 минут, 80%, 96%- 15 минут, 100% - 2 раза по 30 минут) и далее переносили в 100% ацетон на 1 час. Образцы сушили в жидком СОг. Структуры, прикрепленные к подложке, напыляли Pt-Pd в ионном напылителе IB-3 фирмы Eiko (Япония) слоем 15нм. В исследовании использовали СЭМ S-405A фирмы Hitachi (Япония) с ускоряющим напряжением 15 кВ.
4. Метод (ЖУ-окрашивания.
GUS-активностъ определяли используя в качестве субстрата X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl 8-D-glucuronide) фирмы "Duchefa". 20мМ раствор X-gluc в диметилформамиде готовили заранее и хранили при -20С. Рабочий раствор, содержащий 1 мМ X-gluc, 50 мМ фосфатный буфер Na2HP04+NaH2P04 (рН=7.0), 0.01 объемных % Tween-20, каждый раз готовили заново. Образцы инкубировали в течение 24 часов при 37С в темноте. Далее промывали 70% спиртом для удаления хлорофилла, который затрудняет анализ. О наличии ССЯ-активности судили по появлению яркого синего окрашивания (по Jefferson et al., 1987). 5. Морфометрия. При проведении морфометрии учитывались следующие параметры: 1. Число розеточных листьев. 2. Число вегетативных узлов цветоноса. 3. Число генеративных узлов. 4. Общая длина вегетативной части. 5. Общая длина цветоноса.
Каждый параметр измерялся не менее, чем на 15 растениях. Все приводимые для сравнения измерения делались единовременно. Средние значения параметров вычислялись с отбрасыванием максимального и минимального значения признаков. Квадратичное отклонение (число степеней свободы п-1) вычислялось по формуле:
Подсчет средней ошибки (Лакин, 1990), проводился по формуле: т= а у/п. Анализ фенотипов двойных мутантов производился синхронно с анализом растений родительских линий.
6. Молекулярно-генетическое картирование.
В связи с тем, что мутанты bra стерильны, мутация bra поддерживалась с помощью размножения гетерозиготных семей. Характер наследования и взаимодействия мутаций изучали в скрещиваниях, проводимых пыльцой растений нормального фенотипа из семей, выщепляющих гомозиготные растения bra (растение маркировалось индивидуальным номером). В последующем генотип всех маркированных растений проверялся по потомству. В исследование брали только те семена Fj, которые были получены с использованием пыльцы гетерозиготных растений. В F2 исследовали только те семьи, которые содержали растения bra.
Молекулярно-генетическое картирование проводили с использованием CAPS-и dCAPS-маркеров (Рис. 14, Табл. 2), выявляющих рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей ДНК. Этот тип кодоминантных маркеров позволяет провести картирование с необходимой точностью при использовании сравнительно небольших выборок (Ежова и др., 2003). Частоту рекомбинации рассчитывали по формуле (Kornneef, Stam, 1987):
Каллусы получали из листовых и корневых эксплантов растений дикого типа и мутанта bra на среде Мурасиге-Скуга - MS (Murashige, Skoog, 1962), имеющая в своем составе соли MS фирмы «Sigma» (4.62 г/л), витамины по Гамборгу (11.2 мг/л), сахароза 2%, агар-агар - 1%. Концентрации гормонов в среде: 1. НУК - 0.5 мг/л, БАП - 0.1 мг/л, индукция каллусогенеза. 2. НУК - 0.1 мг/л, БАП - 2 мг/л, индукция побегообразования. 3. НУК - 1 мг/л, БАП - 0.1 мг/л, индукция корнеобразования.
Культивирование продолжалось от 1 до 1.5 месяцев. Выборка составляла не менее 15 каллусов для каждого генотипа и варианта среды.
8. Выделение нуклеиновых кислот. Выделение ДНК. Навески ткани 50-150 мг растирали в жидком азоте. Добавляли 500 мкл TES-буфера (ЮОмМ Tris/HCl (рН 8.0), ЮмМ ЭДТА, 2% ДСН). Инкубировали 60 мин. при 60С. Добавляли 0.2 объема 5М NaCl и 0.1 объема 10% ЦТАБ. Инкубировали 10 мин. при 65С. Добавляли 0.75 объема смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), перемешивали. Центрифугировали 10 мин. при 14000g. Верхнюю фракцию переносили в новую пробирку, добавляли 1/3 объема ЗМ ацетата аммония 1/2 объема 96% этанола. Осаждали не мене 2-х часов при -20С. Центрифугировали 60 мин. при 14000g, надосадочную жидкость сливали и промывали осадок 70% этанолом 3 раза. Осадок высушивали и растворяли в деионизованной воде (по Dellaporta et al., 1983; с модификациями).
Выделение РНК. Использовался набор фирмы «Quiagen» (Hilden, Germany). Навеску тканей 50 мг растирали в жидком азоте, добавляли 450 мл RLT-буфера и 10 мкл меркаптоэтанола, переносили в лиловые колонки, центрифугировали 2 мин. при 14000g. В фильтрат добавляли 225 мкл 96% спирта, переносили в розовые колонки, центрифугировали 15 мин. Супернатант сливали, промывали колонку 700 мкл RWl-буфера и дважды 500 мкл RPE-буфера. РНК с колонки смывали 30 мкл воды, свободной от РНК-аз. На финальной стадии выделения добавляли ингибитор РНК-аз фирмы Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). Качество выделенной РНК определяли после электрофореза в 1.5% агарозном геле. Количество РНК определяли спектрофотометрически.
Взаимодействие гена BRA с геном TLF1
Поскольку мутанты Ify, agl8, а также двойной мутант agl8 ag!20 формируют брактеи на оси соцветия (Weigel et al., 1992; Gennen et al., 2005), был проведен сравнительный анализ экспрессии этих генов в растениях дикого типа и мутанта bra при помощи репортерного гена GUS (слитый ген LFY::GUS, Рис. 30) и метода ОТ-ПЦР (гены AGL8 и AGL20, Рис. 25). В результате было показано отсутствие влияние гена BRA на активность генов LFY, AGL8 HAGL20.
Кроме двойного мутанта ag!8 agl20 формирование брактей в базальной части соцветия A. thaliana происходит и у одиночного мутанта ag/8 (Рис. 26А). Кроме этого, у мутанта agl8 происходят сильные нарушения при развитии стручка (Рис. 26А), которые обусловили присвоение мутанту второго названия -fruitful! (Gu et al., 1998), что также характерно и для bra. Поэтому был проведен анализ двойного мутанта bra agl8. У двойного мутанта помимо развития брактей (Рис. 26Б) происходит усиление клеточной пролиферации, что приводит к фасциации верхней части побега (Рис. 26В). Также наблюдались сильные нарушения в развитии плодолистиков (повышенная пролиферативная активность тканей плодолистиков, а также тканей ФМ, расположенных между плодолистиками, ярко выраженные нарушения развития перегородки и слияния плодолистиков, Рис. 26Г, Д). Верхняя часть цветоноса формировалась в виде зонтичной структуры (Рис. 26Е), развитие которой никогда не наблюдали у одиночных мутантов. Фенотип двойного мутанта говорит о комплементарном взаимодействии двух генов и о совместном контроле ими процессов развития плодолистиков, клеточной пролиферации и структуры соцветия у A. thaliana.
Из полученных данных по взаимодействию генов BRA. LFY, AGL8 и AGL20 следует, что ген BRA может являться мишенью активности этих генов или принимать совместное с ними участие в процессах редукции брактей на оси соцвегия у A. thaliana. Кроме этого, гены BRA и AGL8 принимают совместное участие при развитии соцветия A. thaliana. Взаимодействие гена BRA с геном FIL.
У A, thaliana экспрессия некоторых генов обнаруживается в криптических брактеях, дальнейшее развитие которых супрессируется после инициации цветения. Следовательно, среди таких генов (маркеров криптических брактей) могут быть как гены, инициирующие разметку и развитие примордиев листьев (в том числе, брактей), так и гены супрессирующис их дальнейшее развитие. Одним из таких генов-супрессоров может быть ген FIL, при потере функции которого происходит формирование брактей (Sawa et al, 1999; Siegfried el al., 1999; Dinneny et al., 2004). Анализ экспрессии FIL при помощи метода ОТ-ПЦР показал отсутствие различий в активности этого гена в растениях дикого типа и у мутанта bra (Рис. 27), что говорит об их независимом участии в решении судьбы формирования брактей.
Поскольку ген BRA участвует в контроле функционирования AM побега и формирования открытого соцветия, был проведен анализ его взаимодействия с ранее идентифицированными генами-антагонистами, контролирующими этот процесс: TFLI, поддерживающим AM побега в недетерминированном состоянии, и генами API и LFY, инициирующими образование флоральных примордиев на периферических участках AM.
Взаимодействие гена BRA с геном TLF1.
Сравнение уровня экспрессии гена TFLI в растениях bra и дикого типа показало, что у мутанта наблюдается снижение уровня экспрессии TFLI, особенно заметное после инициации цветения (Рис. 29А-В). Из этого следует, что ген BRA положительно регулирует экспрессию TFL1, обеспечивая примерно 70% транскрипции этого гена (Рис. 29Д).
Взаимодействие гена BRA с геном LFY.
Был проведен анализ экспрессии LFУ при помощи слитого гена LFYr.GUS, который показал, что уровень экспрессии LFYодинаков у мутанта bra и растений
Рисунок 29. Экспрессия генов API и TFL1 в растениях дикого типа и мутанта bra на разных стадиях онтогенеза: А) до инициации цветения; Б) после инициации цветения; В) в момент зацветания первого цветка; Г) в цветках; Д) отношение количества мРНК мутанта bra к мРНК растений дикого типа для генов API и TFL1, по оси абсцисс цифрами обозначены стадии развития растения: 1 - до инициации цветения, 2 - после инициации цветения, 3 - в момент зацветания первого цветка, 4 - активное цветение. Условные обозначения на графиках: 1 -АРТ1, Dj; 2 -АРТ1, bra; З - TFL1, Dj; 4 - TFL1, bra; 5 -API Dy,6-APl,bra. дикого типа на всех стадиях онтогенеза (Рис. 30). Следовательно, ген BRA не является регулятором гена LFY, и оба гена вносят совместный вклад в формирование цветка, или ген BRA может быть мишенью активности гена LFY. Проведенный ранее анализ фенотипа двойного мутанта bra lfy-5 (Ежова, Пенин, 2001; Пенин, 2003) не противоречит этому предположению.
Взаимодействие гена BRA с геном API.
Анализ динамики экспрессии гена АРІ в растениях дикого типа и мутанта bra показал, что на стадиях вегетативного роста и инициации цветения активность гена API у мутанта снижена более чем в 4 раза (Рис. 29А-В, Д), то есть на этих этапах онтогенеза в растениях дикого типа ген BRA положительно регулирует ген API, обеспечивая более 70% активности, как и в случае с TFL1. Несмотря на это, в цветках мутанта bra активность API увеличена примерно в 10 раз по сравнению с диким типом (Рис. 29Г, Д). Для выяснения причин этого явления был проведен анализ экспрессии гена API при помощи слитого гена AP1::GUS. Было показано, что в отличие от растений дикого типа, у которых на поздних стадиях развития цветка экспрессия гена API детектируется преимущественно в чашелистиках и, частично, тычинках, у мутанта bra экспрессия наблюдается и в плодолистиках (Рис. 30). Таким образом, ген BRA препятствует экспрессии гена АРІ в апикальной части цветка (зоне формирования генеративных органов). У мутанта bra происходит расширение паттерна экспрессии API, вследствие чего и наблюдается сильное увеличение уровня его экспрессии в цветках. Эктопической экспрессией гена АРІ в области формирования генеративных органов у мутанта bra можно объяснить и нарушения в их развитии.
Анализ чувствительности мутанта bra к фитогормонам
Для анализа чувствительности мутанта bra к фитогормонам, в качестве тестовой системы использовали культуру тканей in vitro. Интенсивность каллусогенеза определяли в баллах. Использовалась градация от 0 до 3 баллов: 0 -отсутствие каллусогенеза; 1 - слабый; 2 - средний; 3 - хороший. Было проанализировано 263 экспланта дикого типа и мутанта bra.
На средах с содержанием гормонов НУК - 0.5 мг/л, БАП - 0.1 мг/л и НУК -0.1 мг/л, БАП - 2 мг/л у дикого типа было получено 23 каллуса с побегами (44% от общего числа) (Табл. 5). На этих же средах у мутанта bra не было получено ни одного каллуса с развитием побегов, что говорит о нарушении у bra чувствительности к фитогормонам. Каллусы мутанта не давали регенерантов и при дальнейшем пассировании на среде того же состава (3 пассажа).
Кроме этого, у мутанта наблюдалась сильная пролиферативная активность клеток каллусов по сравнению с каллусами дикого типа (Рис. 39), что еще раз подтверждает роль гена BRA в регуляции пролиферации клеток в растениях дикого типа.
Полученные результаты могут указывать на нарушение чувствительности к фитогормонам или изменение их эндогенного уровня у мутанта bra по сравнению с диким типом. Однако следует отметить, что у описанных в литературе гормональных мутантов не наблюдалось таких качественных изменений как у мутанта bra. Это указывает на то, что выявленные изменения на действие экзогенных фитогормонов в культуре in vitro являются не причиной многочисленных нарушений онтогенеза мутанта bra, а еще одним проявлением плейотропии.
Ранее ген BRA был локализован в конце правого плеча IV хромосомы в районе маркера САТ2 (Пенин, 2003). Для более точного определения положения гена BRA на молекулярно-генетической карте, а также положение гена относительно маркера САТ2, было проведено молекулярно-генетическое картирование с использованием CAPS- и dCAPS-маркеров.
Ранее было определено, что состояние молекулярных маркеров у расы Dj аналогично линии Ler (Пенин, 2003), поэтому молекулярное картирование проводилось на растениях поколения F2 от скрещивания мутанта bra с расой Col. На первом этапе работы были проведены исследования по поиску новых маркеров, локализованных в нужном районе и выявляющих полиморфизм между расой Col и линией Ler, на основании полиморфизма между которыми создано большинство молекулярно-генетических маркеров. В районе локализации гена BRA был обнаружен CAPS-маркер ATMYB3R, также была продолжена работа с маркером САТ2 (Рис. 14, Табл. 2). Было проанализировано 79 растений по маркеру ATMYB3R (158 хромосом) и 202 растения по САТ2 (404 хромосомы). Обнаружено шесть рекомбинантных хромосом по ATMYB3R (расстояние до гена BRA составило 3.66±0.75 сМ) и впервые обнаружены две рекомбинантные хромосомы по САТ2 (расстояние до гена составило BRA 0,49±0,17 сМ) (Табл. 6). Таким образом, ген BRA тесно сцеплен с маркером САТ2. Для выяснения положения гена BRA относительно маркера САТ2, выявленные рекомбинанты были проверены с использованием дополнительных CAPS-маркеров: PRHA, расположенного слева от САТ2, и JM142, расположенного справа от САТ2 (Рис. 14, Табл. 2). Установлено, что рекомбинанты по САТ2 являются одновременно рекомбинантами по маркеру JM142, но не являются рекомбинантами по маркерам PRHA и ATMYB3R. Следовательно, ген BRA локализован слева от маркера САТ2.
Для уточнения расположения гена BRA на молекулярно-генетической карте были созданы дополнительные маркеры в районе между маркерами САТ2 и ATMYB3R, выявляющие полиморфизм между расами Dj и Col: CAPS-маркер SGCSNP232 и dCAPS-маркер SNP13203 (Рис. 14, Табл. 2). По этим маркерам не было обнаружено рекомбинантных хромосом, что свидетельствует о том, что они тесно сцеплены с исследуемым геном.
Таким образом, ген BRA локализован слева от маркера САТ2 на расстоянии 0.49±0.17 сМ. По нашим данным, полученным для маркеров ATMYB3R и САТ2, 1 сМ на RI-карте в этом районе хромосомы соответствует 206.3 т.п.н. Из этого следует, что ген BRA локализован в пределах 16531-16636 т.п.н. на физической карте и 85-85.5 сМ на RI-карте, что соответствует участку ВАС-клона М4Е13 (Рис. 18). В картированном участке, протяженностью в 105 т.п.н., расположено 33 гена. Полученные результаты позволяют перейти к позиционному клонированию гена BRA.
