Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Генетический контроль функционирования меристемы побега ^
15 17
1.1. Гены shoot meristemles и wuschel 10
1.2. Гены clavata 14
1.3. Knox гены
1.4. Гены cup-shaped cotyledon
1.5. Контроль клеточного цикла *"
2. Фитогормоны в функционировании апикальной меристемы 21
2.1. Цитокинин участвует в поддержании AM 21
2.2. Содержание активного гиббереллина снижается в AM 22
2.3. Высокое отношение цитокинин/ауксин важно для поддержания 24 недетерминированного состояния клеток AM
2.4. Этилен 25
3. Генетический контроль формирования листа 26
3.1. Генетический контроль разметки положения листовых примордиев 27
3.2. Детерминация клеток листовой меристемы 29
3.3. Генетический контроль поляризации примордия 34
3.4. Пространственный контроль меристематической активности примордия 37
3.5. Генетический контроль развития листовой пластинки 38
3.5.1. Развитие листа определяется пролиферацией клеток листовой з 8 пластинки
3.5.2. Развитие листа определяется ростом клеток листовой пластинки 40
4. Вивипария 41
5. Заключение к обзору литературы 43
Материалы и методы 45
1. Растительный материал и условия выращивания растений 45
1.1. Растительный материал 45
1.2. Условия выращивания растений 47
2. Морфометрия 47
3. Сканирующая электронная микроскопия 48
4. Метод тестирования активности репортерного гена GUS 48
5. Выделение нуклеиновых кислот 49
5.1. Выделение ДНК 49
5.2. Выделение РНК 50
5.3. Синтез первой цепи кДНК *1
5.4. Электрофорез в агарозном геле 5 1
6. Полимеразная цепная реакция "*
бЛ.Праймеры ->1
6.2. Условия проведения ПНР 5 *
6.3. Качественная оценка ПЦР продуктов обратной транскрипции -*-6.4.Секвенирование -*2
7. Полимеразная цепная реакция в реальном времени ->2
8. Молекулярное картирование "
Результаты и обсуждение 5 8
1. Морфологическая характеристика мутанта taeniata ^
2. Анализ структуры листа мутанта tae '
3. Характер наследования мутации toe ""
4. Анализ аллелизма мутации tae с другими мутациями сходного фенотипического проявления
5. Анализ взаимодействия гена ТАЕ с генами AS1, SA, KNAT1 и CLV2 на основе изучения двойных мутантов
6. Анализ экспрессии генов в листьях мутанта tae 76
6.1. Анализ экспрессии генов на ранней стадии развития 76
6.2. Анализ экспрессии генов на поздней стадии развития 79
6.3. Анализ экспрессии генов в верхушках цветоносов и цветках мутанта 83
6.4. Анализ экспрессии гомеобоксных генов в листьях разных рас 87
6.5. Анализ экспрессии KNOX генов в разных участьях листа 89
7. Анализ распределения активного ауксина в листьях мутантов tae, asl, sa 90
8. Анализ экспрессии гена KNAT1 в листьях мутантов tae, asl и sa 94
9. Анализ экспрессии гена CYCBIB листьях мутантов tae 96
10. Поиск молекулярных маркеров для картирования гена ТАЕ 97
11. Молекулярно-генетическое картирование гена ТАЕ 100
Заключение юз
Выводы
Приложение
- Гены cup-shaped cotyledon
- Генетический контроль поляризации примордия
- Условия выращивания растений
- Анализ аллелизма мутации tae с другими мутациями сходного фенотипического проявления
Введение к работе
В отличие от животных, растения формируют новые органы на протяжении всей жизни. Эта особенность связана с существованием меристем побега и корня, пролиферация которых поставляет клетки для развития новых органов. Меристемы растений сохраняют активность благодаря тому, что содержат пул стволовых клеток, которые способны к самоподдержанию, с одной стороны, и к образованию дифференцирующихся клеток, с другой. По сути меристемы служат нишами стволовых клеток и обеспечивают поддержание их популяции путем сохранения равновесия между процессами деления клеток и их дифференциацией в формирующиеся примордии латеральных органов растения. Примордип латеральных органов также представлены меристематическими клетками (полумеристемами, Тимонин, 2007), время пролиферации которых определяет форму и размеры латеральных органов (листьев, цветков), а также такие типы вегетативного размножения как вивипария, эмбриоидогения, спорофитный апомиксис и др.
Эксперименты с удалением из апикальной меристемы побега томата стволовых клеток показали, что меристемы способны образовывать новые стволовые клетки, обеспечивая константность развития (Reinhardt et al., 2003). В то же время, стволовые клетки возникают многократно de novo при развитии примордиев корней и побегов, а не являются клонами популяции стволовых клеток, заложенной на определенной стадии эмбриогенеза (Иванов, 2007). Многократное образование стволовых клеток делает возможным длительное сохранение способности растений к открытому морфогенезу и вегетативному размножению, обеспечивает способность к регенерации поврежденных участков, а также объясняет существование у растений разнообразных типов вегетативного размножения. В связи с этим изучение генетического контроля пролиферации меристем и поддержания пула стволовых клеток имеет большое значение не только понимания фундаментальных вопросов генетики развития растений, но и для разработки новых путей создания растений с новыми типами размножения.
Arabidopsis thaliana - модельное растение из семейства крестоцветных, которое является основным объектом исследований генетики стволовых клеток. У A. thaliana идентифицирован ряд генов, которые контролируют формирование
стволовых клеток и поддержание их пула, а, следовательно, и функционирование апикальной меристемы побега и корня. По гомологии с генами этого вида клонированы и исследованы гены, контролирующие пролиферативную активность меристем у таких хозяйственно ценных видов как томаты (Janssen et al., 1998), картофель (Rosin et al., 2003), кукуруза (Volbrecht et al., 2000; Harven et al., 1996), рис (Matsuoka et al., 1993; Kamiya et al., 2003) и др. Эти гены были использованы для создания трансгенных растений с измененной структурой органов. При этом было установлено, что гены, контролирующие пролиферацию меристем, являются высоко консервативными, и усиление их экспрессии приводит к эктопической пролиферации разных типов меристем (листовых, флоральных, побеговых) и к изменениям всех типов органов растения. Так, например, в экспериментах на томатах показано, что увеличение активности собственных генов, контролирующих стволовость, или экспрессия их гомологов из других видов приводит как к появлению хозяйственно перспективных изменений структуры листа, так и к одновременному проявлению признаков недетерминированности' роста плодов (Avivi et al., 2000), которые мешают использованию полученных форм в селекции. Очевидно, что для более эффективного использования генов, контролирующих пролиферацию меристем необходимы дополнительные исследования, направленные на поиск генов, которые способны регулировать разные типы меристем, осуществлять органоспецифический контроль за работой генов, поддерживающих столовость.
Одним из наиболее эффективных методов обнаружения новых генов является мутационный анализ. Для выявления генов, осуществляющих регуляцию пролиферацию меристематических клеток, необходимо исследовать мутанты с измененной активностью меристем. В коллекции кафедры генетики МГУ имеется мутант A. thaliana taeniata (tae), выделенный с помощью мутагенеза из расы Blanes (Янушкевич, 1985), который характеризуется анормальной морфологией и образованием эктопических меристем на листьях розетки (Лебедева, 2004; By, 2006).
Целью диссертационной работы являлось изучение роли гена ТАЕ в регуляции формирования и функционирования меристемы у A.thaliana и его взаимодействия с другими генами, контролирующими этот процесс.
Задачи исследования:
Морфологический анализ мутанта tae.
Изучение взаимодействия гена ТАЕ с генами, участвующими в контроле формирования и функционирования меристемы, на основе изучения фенотипа двойных мутантов и характера генной экспрессии.
Построение схемы генетической регуляции активности меристем с участием гена ТАЕ.
Создание новых CAPS маркеров для картирования.
Локализация гена ТАЕ на генетической карте A.thaliana.
Научная новизна работы
Выявлен ранее не известный ген, контролирующий пролиферативную активность меристем. Установлено, что функция гена ТАЕ заключается в контроле детерминации листовой, побеговой и флоральной меристем в растениях дикого типа A.thaliana. Установлена локализация гена ТАЕ на генетической карте A.thaliana. Показано, что ген ТАЕ играет ключевую роль в контроле пролиферации листвой меристемы путем подавления экспрессии генов KNAT1, KNAT2, KNAT6, STM, WUS, и SYD поддерживающих недетерминированное состояние клеток и пул стволовых клеток. Впервые показано, что ген ТАЕ участвует в регуляции содержания ауксина в тканях листа; накопление ауксина в листьях мутанта tae может являться следствием эктопической экспрессии KNAT генов. Ген ТАЕ является не только регулятором более высокого иерархического порядка по сравнению с ранее описанными негативными регуляторами - генами AS 1,2, CLVl.2,3 и ВОР 1,2, но и, отличается от них особенностями экспрессии. На основе изучения генных взаимодействий и экспрессии генов создана схема генетического контроля детерминации клеток листовой меристемы с участием гена ТАЕ.
Выявлено, что эктопические выросты на листьях мутанта tae возникают в результате процессов, похожих на инициацию примордиев листьев на периферии апикальной меристемы побега (накоплением ауксина на периферии листа и экспрессией гомеобоксных генов в его центре), что позволяет предполагать
участие гена ТАЕ в контроле этого признака у крестоцветных. Впервые выявлен полиморфизм по уровню экспрессии гомеобоксных генов между природными расами A. thaliana, что свидетельствует о роли гомеобоксных генов в процессе развития листа и их влиянии на форму листа.
Практическая значимость работы
Выявлен полиморфизм ДНК между расой Blanes-M и другими расами (Dijon-М, Columbia-M, Koeln-M, Enkhiem-M) и линиями (Ler, КЗ 10, mmlR, mmlL, mm5) no CAPS маркерам, которые разработаны ранее для выявления ДНК-полиморфизма между расой Columbia-M и линией Ler и по новым созданным CAPS и dCAPS маркерам по всем пяти хромосомам. Полученные данные по анализу ДНК-полиморфизма могут использоваться для планирования экспериментов по молекулярному картированию мутаций, которые получены не только на основе расы Columbia-M и линии Ler-M, но и на основе рас и маркерных линий, для которых нет информации о молекулярных маркерах.
Гены cup-shaped cotyledon
У растений гомеобокс-содержащие гены STM {SHOOTMERISTEMLES) и WUS {WUSCHEL), а также гены CLV1, CLV2, CLV3 {CLAVATA) играют основную роль в развитии AM. Гены STM и WUS позитивно регулируют размер AM , кодируя основные регуляторы формирования и поддержания пула стволовых клеток меристемы тогда как гены CLVограничивают пул стволовых клеток AM.
Ген STM относится к подсемейству KNOX, экспрессия гена STM впервые наблюдается на поздней глобулярной стадии развития эмбриона до формирования семядолей, в группе клеток, которые находятся между предполагаемыми семядолями (Long et al., 1996). Потеря функции STM у мутантов приводит к редукции AM вплоть до полного ее отсутствия: эмбрион мутанта stm не имеет AM и не способен формировать вегетативные ткани в постэмбриональный период развития, проростки мутанта stm имеют слитые семядоли. (Barton, Poething, 1993; Long et al., 1996). Мутант warn (waldmester) - аллель stm со слабой экспрессивностью признака, имел многочисленные дефекты развития побега: изменение формы листа, воздушные розетки, фасциацию цветоноса и аномальные цветки. Эктопическая экспрессия гена STM вызывает de novo формирование эктопической меристемы на адаксиальной стороне листа, что свидетельствует о роли гена STM в инициацию AM (Brand et al., 2002; Gallois et al., 2002; Lenhard et al., 2002). STM мРНК накапливают в AM, но подавляются в примордиях органов. Предполагается, что ген STM важен для поддержания популяции центральных недифференцированных клеток, необходимой для дальнейшего развития меристемы. Недавно было показано, что ген STM играет важную роль и в развитие флоральной меристемы, активируя развитие плодолистиков, потеря функции STM подавляет развитие плодолистиков, в результате образуются слитые, недоразвитые гаюдолистиковые плацентарные ткани (Scofield et al., 2007).
Ген WUS начинает экспрессироваться на эмбриональной стадии и важен для возникновения группы стволовых клеток уже на стадии 16-клеточного эмбриона (Mayer et al., 1998). У мутанта wus меристема не развивается во время эмбриогенеза. После прорастания происходит инициация меристемы и повторное прекращение ее развития за счет того, что стволовые клетки быстро теряют состояние стволовости и переходят к дифференцировке, что вызывает исчезновение меристемы (Laux et al., 1996). Эктопическая экспрессия гена WUS в примордиях вегетативных органов вызывает противоположный эффект -появление эктопических стволово-подобных клеток и даже соматических эмбрионов (School et al., 2000; Brand et al., 2002; Zuo et al., 2002; Gallois et al., 2004).
Предполагается, что ген WUS контролирует формирование AM путем поддержания необходимого количества стволовых клеток (Lenhard and Laux, et al., 2003). WUS экспрессируется в маленькой группе клеток под центральной зоной AM. Это свидетельствует о том, что WUS поддерживает пул стволовых клеток путем передачи сигнала через слои клеток. Однако показано, что функционирование гена WUS не . является необходимой для инициации дополнительных меристем, так как мутанты wus способны формировать латеральные и вставочные меристемы.
Также мутация в гене WUS оказывает влияние на флоральную меристему. Флоральная меристема дикого типа образует четыре чашелистика, четыре лепестка, шесть тычинок и два объединенных плодолистика У мутанта wus в цветках отсутствуют органы центральных мутовок - тычинки и плодолистики, часто образуется единичный плодолистик, иногда появляются цветки без плодолистиков или с тремя плодолистиками. Так как мутация в гене WUS в основном действует на центральную часть флоральной меристемы, а периферийные части оказываются функционально способными, предполагается, что экспрессия гена WUS важна для развития центральной части флоральной меристемы (Laux et al., 1996).
Показано, что гены STM и WUS контролируют активность AM независимо друг от друга (Mayer et al., 1998). Спецификация стволовых клеток, контролируемая геном WUS, не требует активности гена STM; с другой стороны, STMподавляет дифференцировку стволовых клеток независимо от WUS (Lenhard et al., 2002). Одновременная экспрессия обоих генов дает комплементарный (синергичный) эффект, усиление экспрессии WUS может частично компенсировать потерю функции STM. Предполагается, что в AM существует «разделение труда» между WUS и STM: активность гена WUS необходима для поддержания группы стволовых клеток в центре, a STM супрессирует дифференциацию в меристеме. позволяя делиться дочерним клеткам стволовых, до того, как они будут включены в какой-либо орган (Lenhard et al., 2002).
Экспрессия гена WUS находится под контролем целого ряда факторов. Во-первых, экспрессию WUS репрессирует киназа CLV1-CLV2, которая активируется секреторным белком CLV3 (см. ниже). К регуляторам экспрессии WUS также относятся гены AG (AGAMOUS), и LFY {LEAFY) которые репрессируют WUS при развитии флоральной меристемы (Lohmann et al., 2001). Показано, что транскрипционные факторы - белок LFY вместе с белком WUS активируют экспрессию гена AG, активность которого необходима для развития генеративных органов цветка. На поздних стадиях развития цветка транскрипционный фактор AG репрессирует активность гена WUS, что обусловливает детерминированное развитие флоральной меристемы (Lohmanm et al., 2001).
Показано, что ген WUSтакже регулируется генами FAS1 (FASCIATA1) и FAS2, которые кодируют элементы гетеротримерного комплекса CAF-1 (CHROMATIN ASSEMBLY FACTOR-1), участвующего в компактизацию хроматина, в том числе, после репликацию ДНК (Kaya et al., 2001; Kirik et al., 2006). Мутанты с потерей функции генов FAS1 и FAS2 характеризуют фасциацией стебля, нарушением филлотаксиса, аномальной структурой и количества органов цветка, рассеченностью листьев (Leyser and Furner et al., 1992).
Недавно был выявлен еще один регулятор WUS - ген SYD (SNF2-class ATPase SPLAYED), кодирующий фактор реконструкции хроматина. В отличие от вышеперечисленных регуляторов этот ген активирует работу гена WUS, т.е. является его позитивным регулятором. Зрелые растения syd характеризуются ранней терминацией AM, и связанным с этим снижением уровня экспрессии WUS и CLV3. Показано, что белок SYD является прямым специфическим позитивным регулятором WUS экспрессии, который обусловливает транскрипцию WUS в определенных участках апикальной и флоральной меристем (Kwon et al., 2005).
Генетический контроль поляризации примордия
Деления инициальных клеток листовой меристемы приводят к появлению листового примордия и дальнейшей детерминации клеток листовой меристемы -разметке листовой меристемы на определенные домены, которые дадут начало разным участкам листа (верхней и нижней, проксимальной и дистальной, медианной и латеральной). Детерминация верхней и нижней стороны листьев (адаксиально-абаксиальная поляризация листа) - важнейший этап развития листа, который предшествует разметке на центральный и латеральные домены и является необходимым условием развития пластинки листа. Поляризация листового примордия связана с действием двух групп генов, которые консервативны, также как и гены, размечающие положение примордия и детерминацию его клеток. Гены семейства HD-ZIP класса III, к которым у A.thaliana относятся PHABULOSA (РНВ), PHAVOLUTA (PHV) и REVOLUTA (REV), устанавливают и поддерживают дифференцировку клеток верхней (адаксиальной) стороны (McConnell et al., 2001; Otsuga et al., 2001). Дифференцировка клеток нижней (абаксиальной) стороны листьев контролируется представителями двух семейств регуляторних генов -KANADI (KAN) и YABBY (YAB) (Sawa et al., 1999; Siegfried et al., 1999; Kerstetter et al., 2001; Eschedetal., 2001).
Доминантные мутации phb nphv вызывают суперэкспрессию генов и приводят к превращению абаксиальных частей в адаксиальные и образованию радиально симметричных листьев (McConnell, 1998; McConnell et al., 2001). Напротив, доминантная мутация rev-10d приводит к нарушению в сосудистой системе в эмбрионе, в результате образуется флоэма, окружающая ксилему. Мутации с потерей функции генов РНВ или PHV не показывают никаких заметных эффектов на полярность латеральных органов (McConnell et al., 2001; Emery et al., 2003). В то же время, мутации с потерей функции гена REV нарушают образование пазушных меристем, но не изменяют полярность листа и сосудистую систему (Talbert et al., 1995). Так как гены РНВ, PHVn REV показывают сходный характер экспрессии, считается, что функция этих генов частично перекрывается в развитии меристемы и поддержании нормальной дифференцировки клеток адаксиальной стороны листа в латеральных органах. Последние работы показали регуляцию экспрессию РНВ, PHV и REV генов с помощью микро-РНК (miPHK - короткие молекулы РНК, размером 21-25 нуклеотидов, которые участвуют в регуляции экспресссии генов на постранскрипционным уровне). Недавно было показано, что гены классы III HD-ZIP регулируются miPHK; обнаружены гомологичные последовательности между генами РНВ, PHVKREV И miR165/166. Показано, что мРНК РНВ и PHV (аллелей дикого типа) расщепляется в том месте, где существует комплементарность с miR165, а мРНК мутанта phv не расщепляются. Расщепление мутантных мРНК восстанавливалось только тогда, когда добавляли синтетические miPHK, полностью комплементарные к последовательности мутантных мРНК. Эти данные свидетельствуют о том, что нарушение способность miR165 расщеплять мутантные мРНК является результатом некомплементарности их последовательностей (Tang et al., 2003). Трансгенные растения A.thaliana с эктопически экспрессирующимся геном REV, имеющим мутацию в сайте комплементарное с miR165, показывают фенотип подобный мутанту rev-10d с суперэкспрессией гена REV. Следовательно, нарушение сайта связывания с miPHK приводит к дерепрессии гена REV и к образованию фенотипа мутанта с суперэкспрессией генов (Emery et al., 2003). Эти данные позволяет сделать вывод о том, что гены РНВ, PHV и REV регулируются тіРНКами, последовательность которых полностью комплементарна последовательности участки мРНК, и регуляция осуществляется путем деградации мРНК.
Мутации с суперэкспрессией генов семейств KAN и YAB приводят к образованию абаксиализированных радикально-симметричных органов (Kerstetter et al., 2001; Esched et al., 2001). Противоположный эффект (превращение абаксиальных частей в адаксиальные) наблюдается у мутантов с потерей функции нескольких генов KAN (Esched et al., 1999; Esched et al., 2004) и YAB (Kumaran et al., 2002). Продукты генов KAN подавляют экспрессию генов HD-ZIP в нижней стороне листового примордия и наоборот. Такая тонкая взаимная регуляция поляризует примордий и создает возможность для развития обеих сторон листа (Esched et al., 2001; 2004).
Одиночные мутанты в двух генах семейства YAB: FILAMENTOUS FLOWER (FIL) и YAB3 не имеют мутантного фенотипа, так как их функции перекрываются, в то же время двойной мутант fil8 уаЬЗ-2 показывает анормальный фенотип, частично теряя характеристики абаксиальной стороны и образуя радиально-симметричные листья и флоральные органы. На листьях двойного мутанта наблюдается бифуркация жилок, по краю листа иногда возникают и эктопические меристемы. Наблюдалось повышение транскрипции генов STM, KNAT1, KNAT2 на листьях мутантов уаЬЗ-2, fil8, fil8 уаЬЗ-2 по сравнению с диким типом (Kumaran et al., 2002). Предлагается, что FIL и YAB3 репрессируют инициацию эктопических меристем через репрессию экспрессии KNOX- генов класса I.
Условия выращивания растений
Для анализа активности GUS разработан ряд эффективных методов. Достаточно простым и информативным методом определения GUS активности является метод окрашивания in situ (гистохимический метод). И качестве субстрата для определения используют X-gluc (5-bromo-4chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide) (Маниатис и др., 1984). 20мМ раствор X-gluc в диметилфосмамиде можно приготовить заранее и хранить при -20С. Рабочий раствор, содержащий ІмМ X-gluc; 50мМ фосфатный буфер Na2HP04 + NaH2P04 - pH 7.0-7.2; 0.01 объемных %Tween-20, каждый раз готовят заново.
Перед окрашиванием отдельные части растения помещают в раствор X-gluc в пробирки Eppendorf, следя за тем, чтобы растительный материал был полностью погружен в раствор. Пробирки закрывают и инкубируют в темноте в термостате при 37С от 5 до 48 часов. О наличии GUS-активности судят по появлению яркого синего окрашивания. Образцы помещают в 70% этанол для удаления хлорофилла, который затрудняет нализ, после чего ткани анализируют с помощью микроскопа. 1. Навеску растительного материала (50 - 150 мг) растирали в жидком азоте, и переносили в пробирку Eppendorf объемом 1.5 мл. 2. Добавляли 500 мкл TES-буфера (состав которого приведен в Табл.2 Приложение) и инкубировали 30-60 минут при 55-60С периодически помешивая (2-Зраза через 15 минут). Общий объем получившейся смеси составлял 700 мкл. 3. Добавляли 0.2 объема 5М NaCl (-140 мкл) и 0.1 объема 10% ЦТАБ ( 70 мкл). 4. Инкубировали 10 мин при 65С 5. Добавляли 0.75 объема смеси хлороформа и изоамилового спирта (24/1) ( 700мкл) и перемешивали. 6. Центрифугировали 10 мин (14000g). 7. Осторожно переносили верхнюю фракцию ( 500 мкл) в новую пробирку 1.5 мл, не допуская попадания других фракций. 8. Добавляли 1/3 объема (-170 мкл) ЗМ ацетата аммония и 1/2 объема 96% этанола (-250 мкл), или 1 объем 5М LiCl в 80 % этаноле. 9. Осаждали не менее 2-х часов при -20С, или 30 мин при -70С. Ю.Смесь центрифугировали 30-60 мин при 14000 g. 11.Сливали надосадочную жидкость и добавляли в пробирку 0.5 - 1 мл охлажденного 70% этанола. Промывали осадок, центрифугировали 10 мин (14000 g). Повторяли процедуру два раза. 12.Сливали надосадочную жидкость PI высушивали осадок ДНК, открыв пробирки, до исчезновения запаха спирта. 13.Добавив 50 мкл стерильной деионизированной воды, растворяли осадок аккуратным встряхиванием или пипетированием. Раствор выделенной ДНК хранили при -20С.
Качество и количество ДНК оценить на геле после электрофореза
Для проведения данной процедуры использовался RNA Easy KIT фирмы QIAGEN (паспорт RNA Easy KIT фирмы QIAGEN) Cat. No. 74904 с дополнительной обработкой ДНКазой с помощью RNase-Free DNase Set (Qiagen, Germany) Cat. No. 79254. 1. Навеску растительного материала (не больше 100мг) растереть в жидким азоте в фарфоровой ступке охлажденным пестиком. Поместить .полученную массу в пробирку Eppendorf, 1.5мкл. 2. Добавить 450 мкл буфера RLT (заранее добавить к нему р-меркаптоэтанол, согласно инструкции), перемещать. 3. Инкубировать при 56С 3 мин до полного растворения. 4. Центрифугировать в лиловых колонках 2 мин при 14 000 об/мин. 5. К полученной жидкости добавить 0.5 объема этанола 96%, перемещать. 6. Перенести в розовую колонку и центрифугировать 15сек при 10 000 об/мин. 7. Добавить в колонку 700 мкл буфера RW1. 8. Центрифугировать 15сек при 14 000 об/мин. 9. Добавить в колонку 500 мкл буфера RPE. 10.Центрифугировать 15секпри 14 000 об/мин. 11.Добавить в колонку 500 мкл буфера RPE. 12. Центрифугировать 2 мин при 10 000 об/мин. 13.Колонку перенести в новую пробирку, добавить 50мкл воды, свободной от РНКаз. 14.Центрифугировать 1 мин при 10 000 об/мин. Качество и количество РНК оценить на геле после электрофореза.
Обратную транскрипцию проводили с использованием набора cDNA Synthesis Kit (first strand) с 15T праймером (Silex, Russia) Cat. No. K0202. В пробирке смешивали 2.5 мкл праймеров oligo-dTi2-i8. Перемешивали, инкубировали смесь 5 мин при +70С, затем помещали на лед. Добавляли следующие компоненты: х10 кратный M-MLV буфер - 5мкл MgCl2 (25 мМ) - Змкл 1.5MMdNTP -8 мкл РНК-аз - 1мкл M-MLV обратная транскриптаза - 1мкл
Инкубировали смесь в течении 60 мин при +37С, останавливали реакцию прогреванием смеси 5 мин при +75С. Хранили получаемый раствор кДНК при -20С (или -70С для долгосрочного хранения).
Анализ аллелизма мутации tae с другими мутациями сходного фенотипического проявления
Для того, чтобы посмотреть как изменяется экспрессии генов контролирующих стволовость клеток на более поздних стадиях развития листа, анализировали уровень транскрипции этих генов в более зрелых листьях с помощью метода ПЦР в реальном времени. мРНК выделяли из полностью развитых листьев розетки растений, сформировавших цветоносы - отдельно из листьев без почек и листьев с почками. В качестве контроля использовали розеточные листья дикого типа (расы Blanes-M).
На этой стадии у мутанта tae опять наблюдается в зрелых листьях, образовавших почки, сильное повышение экспрессии генов, способных к поддержанию стволовости клеток меристемы KNAT 1,2,6, STMa WUS (экспрессия WUS не детектировалась в зрелых листьях дикого типа (рис.22). В зрелых листьях, на которых нет почек, уровень экспрессия всех исследуемых генов, кроме WUS, не отличался от дикого типа (рис.22). Кроме того, как и в предыдущем разделе, обнаружена экспрессия гомеобоксных генов в листьях дикого типа (расы Blanes-М).
Как известно, у дикого типа листовые меристемы отличаются от клеток AM тем, что они пролиферируют ограниченное время, потом дифференцируются в разные типы тканей, AM содержит пул стволовых клеток, обеспечивающих функционирование меристемы и образование всех надземных органов на всем протяжения онтогенеза. Результат анализа показал, что в листьях мутанта с формированием почек эктопически экспрессировались гены, поддерживающие стоволость клеток, что свидетельствует о том, что листовые меристемы мутанта работают как AM и способны к образованию других органов, в результате могут образоваться не только эктопические листья и розетки листьев, но и цветоносы и флоральные органы.
Отличие интенсивности экспрессии гомеобоксных генов в простых листьях и в листьях с почками у мутанта tae так же подтверждают тот факт, что образование дополнительных почек связано с эктопическим повышением экспрессии гомеобоксных генов. В простых листьях экспрессия этих генов не существенно отличалась от дикого типа.
Известно, что ген AS1 и AS2 являются негативными регуляторами гомеобоксных генов KNAT1, 2 и 6. Можно было бы предполагать, что обнаруженное нами увеличение уровня экспрессии гомеобоксных генов у мутанта является результатам снижения уровня их негативных регуляторов AS1 и AS2. Проведенные нами исследования не подтвердили этого предположения (рис. 22). Некоторое повышение экспрессии гена AS J в листьях без почек и обоих генов в листьях с почками у мутанта tae (рис.22), по-видимому, объясняется тем, что доля сосудистых тканей, где экспрессируется AS1 (Iwakawa et al., 2007), выше у мутанта tae по сравнению с диким типом (см. выше).
Кроме того, была исследована экспрессия генов семейства HD-ZIP класса III, кодирующих транскрипционные факторы РНВ, PHV, REV и CNA (рйС.23). Эти гены также участвую,! з регуляции формирования AM и в определении полярности листа (McConnell and Barton, 1998; McConnell et al., 2001; Prigge et al., 2005). Двойной мутант rev phb не способен формировать AM; у двойного мутанта rev phv иногда также наблюдалось отсутствие AM (Prigge et al., 2005). Кроме того, гены семейства HD-ZIP класса III способны регулировать пост-эмбриональную инициацию меристем (Prigge et al., 2005). Установлено, что в простых листьях мутанта уровень транскрипции генов РНВ, PHV, REV и CNA не сильно отличался от дикого типа (рис.23). Но в листьях с формированием почек экспрессия этих генов, кроме РНВ, существенно повышалась (рис.23). Возможно, одна из причин формирования эктопических меристематических очагов на листьях мутанта tae является повышение экспрессии этих генов.
Таким образом, у мутанта tae не наблюдается нарушение полярности листа и не наблюдается понижение уровня транскрипции генов полярности, что отличает этот мутант от мутантов asl и as2 (Fu et al., 2007). Эти данные подтверждают отличие функции гена ТАЕ от функции генов AS1 AS2, которые влияют на поляризацию листа, осуществляя позитивную регуляцию транскрипции генов РНВ, PHKREV.
Так как обнаружена эктопическая экспрессия гена WUS в листьях мутанта tae, которая играет ключевую роль в поддержанию стволового состояния клеток AM, был проведен анализ экспрессии генов - регуляторов гена WUS в листьях мутанта tae и дикого типа.
Показано, что в листях без почек уровень транскрипции генов FAS1, FAS2, ULT1 - негативных регуляторов транскрипции гена WUS не отличался от дикого типа (рис.24). Это свидетельствует о том, что эктопическое повышение уровния экспрессии гена WUS не связано с нарушением работы его нагетивных регуляторов. Уровень экспрессии гена SYD - позитивного регулятора гена WUS достоверно отличался от дикого типа (рис.24). В листьях мутанта с проявлением почек наблюдается существенное повышение экспрессии всех исследуемых генов (рис.24). Таким образом, возможно, в растениях дикого типа ген ТАЕ негативно регулирует экспресию гена WUS через подавление транскрипции гена SYD. У мутанта tae повышение экспрессии гена WUS является следствием высокой экспрессии гена SYD.
Нами проведен анализ в листьях мутанта и дикого типа экспрессии гена TRN2, мутация которого приводит к формированию узких, ассиметричных листьев, напоминающих листья мутанта tae. В листьях мутанта tae обоих вариантов наблюдалась существенное повышение экспрессии гена TRN2 по сравнению с диким типом (рис.25). Следовательно, асимметричность розеточных листьев мутанта tae не связана с нарушением работы гена TRN2 как в случае мутанта tr
