Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. как модельный объект молекулярно-генетических исследований
2.1.1. Основные характеристики Arabidopsis как модельного организма : 14
2.2. Первые мутанты A thaliana (L.) Heynh. 15
2.1.3. Геном A. thaliana. 16
2.2. Абиотический стресс. Холодоустойчивость. 17
2.3. Убиквитин-зависимый протеолиз. Введение 24
2.3.1. Биохимические механизмы и особенности убиквитин-зависимого протеолиза 24
2.3.2.1. Схема убиквитин-зависимого протеолиза 24
2.3.2.2. Протеосома 26S 25
2.3.2.3. Убиквитин 26
2.3.2.4. Этапы убиквитинилирования 29
2.3.2.5. Характеристика семейства F-бокс-содержащих генов и кодируемых ими белков 31 FBP
2.3.2.5.1. Классификация F-бокс-содержащих белков эукариот (FBP) на основании 32
данных об их структуре
2.3.2.5.2. F-домен 32
2.3.2.5.3. Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков млекопитающих 33
2.3.2.5.4. Вариабельные домены F-бокс-содержащих белков A. thaliana 34
2.3.2.5.5. Функции эукариотических F-бокс белков FBP 35 2.3.2.5.5.1. Функции FBP у растений 36 2.3. Регуляция на уровне экспрессии генов: Транскрипционные факторы. Семейство bHLH. 39
2.4.1. Транскрипционные факторы эукариот 39
2.4.2. Транскрипционные факторы A. thaliana 41
2.4.3. Характеристика семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix-loop- 42 helix (bHLH)
2.4.3.1. История открытия и сравнительная характеристика семейства эукариотических транскрипционных факторов типа Basic helix-loop-helix (bHLH).
2.4.3.2. Структура домена basic helix-loop-helix (bHLH) 43
2.4.3.3. Классификация эукариотических белков семейства транскрипционных 45
факторов по типу basic helix-loop-helix (bHLH)
2.4.3.3.1. Классификация по типу основного домена 45
2.4.3.3.2. Классификации белков семейства транскрипционных факторов по типу bHLH 45 A. thaliana
2.4.3.4. Функции белков семейства транскрипционных факторов по типу Basic helix- 47
loop-helix (bHLH)
2.4.3.4.1. Общие сведения 47
2.4.3.4.2. Функции белков bHLH 47
2.4.3.4.3. Функции белков bHLH A. thaliana 48
2.5. РНК-направленное «замолкание» генов - HDGS - феномен «подавления 48
экспрессии генов с высокой степенью идентичности»
2.5.1. Введение 48
2.5.2. Молекулярные механизмы 49
2.5.3. миРНК-биогенез 53
2.5.3.1. Регуляция активности генов посредством миРНК 53
2.5.3.2. Функционирование миРНК 54
2.5.3.3. миРНК-биогенез у растений 55
2.5.4. Особенности развития PTGS при системном транспорте у растений 56
2.5.5. Вирусные гены - супрессоры PTGS: HYR-зависимая РНК-полимераза RdRp 57
2.5.5.1. История открытия 5 7
2.5.5.2. Свойства РНК-зависимых РНК-полимераз у растений 59
2.5.6. Модель функционирования белковых комплексов, осуществляющих деградацию 59
мРНК с помощью киРНК
2.5.7. Использование метода получения индивидуального «замолкания» гена для молекулярно-генетических исследований
3. Материалы и методы 62
3.1. Линии растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 62
3.2. Штаммы бактерий и плазмиды 62
3.3. Питательные среды 63
3.4. Антибиотики и гербициды, использованные в качестве селективных агентов 64
3.6. Методы получения компетентных клеток Е. coli 65
3.6.1. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих эффективность трансформации 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.6.2. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих эффективность трансформации 106-107 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.6.3. Получение компетентных клеток Е. coli, обеспечивающих эффективность трансформации до 109 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.7. Методы трансформации клеток Е. coli 66
3.7.1. «Быстрая» трансформация клеток Е. coli с эффективностью 103-105 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.7.2 Трансформация клеток Е. coli с эффективностью 10-10 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.7.3 Трансформация клеток Е. coli с эффективностью до 109 колоний на 1 мкг плазмидной ДНК (электропорация).
3.7.4. Отбор клеток Е. coli, несущих рекомбинантные плазмиды. 67
3.8. Метод быстрого «переклонирования» ДНК из одного вектора в другой. 68
3.9. Скрининг бактериальных колоний методом ПЦР 68
3.10. Трансформация клеток бактерий Agrobacteriam tumefaciens 69
3.10.1 Конъюгативный перенос. ' 69
3.10.2. Трансформация клеток A. tumefaciens методом электропорации 69
3.11. Культивирование растений A. thaliana 70
3.11.1. Подготовка семян A. thaliana к посеву: поверхностная стерилизация. 70
3.11.2. Выращивание растений в стерильных условиях на чашках Петри 70
3.11.3. Выращивание растений в открытом грунте 71
3.11.4. Выращивание растений в стрессовых условиях 71
3.12. Агробактериальная трансформация растений A. thaliana 72
3.12.1. Агробактериальная трансформация на ранней стадии развития растения - 72
стадии прорастающих семян.
3.12.2. Агробактериальная трансформация неопыленных бутонов 73
3.13. Отбор трансгенных растений A. thaliana 1А
3.13.1. Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве (in vivo). 74
3.13.2. Отбор трансгенных растений A. thaliana в песке (in vivo). 74
3.13.3. Отбор трансгенных растений A. thaliana in vitro 75
3.14. Методы выделения геномной ДНК из тканей растений A. thaliana 75
3.14.1. Быстрое выделение ДНК из листьев A. thaliana для ПЦР-тестирования на наличие инсерции Т-ДНК.
3.14.2. Получение мини-препаратов ДНК из тканей растений A. thaliana 76
3.14.3. Выделение ДНК A. thaliana для блот-гибридизации 76
3.14.4. Выделение геномной ДНК A. thaliana для последующего клонирования 77
3.15. Методы выделения плазмидной ДНК из клеток бактерий 7 7
3.15.1. Получение мини-препаратов ДНК 7 7
3.15.2. Тепловой метод выделения ДНК 78
3.15.3. Получение препаратов плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей 79
3.15.4. Очистка препаратов ДНК от примесей белков 79
3.15.5. Очистка препаратов ДНК от примесей РНК 80
3.15.6. Хроматографическая очистка препаратов ДНК 80
3.15.7. Очистка препаратов ДНК методом электроэлюции 81
3.15.7.1. Трубчатый электрофорез 81
3.15.7.2. Электроэлюция в диализную плёнку 82
3.15.8. Очистка ДНК при помощи центрифугиро в ания 82
3.15.9 Концентрирование препаратов ДНК с помощью изо-бутанолового спирта 82
3.16. Метод амплификации ДНК для последующего клонирования 83
3.17. Клонирование фрагментов ДНК 8 3
3.18. Метод блот-гибридизации по Саузерну 84
3.19. Анализ мРНК в растительных тканях A. thaliana 85
3.19.1. Реакция обратной транскрипции с поли-Т праймером 85
3.19.2. Реакция обратной транскрипции с гексапраймерами. 85
3.20. Количественный ПЦР в реальном времени (qPCR) 86
3.21. Секвенирование ДНК 86
3.22. Праймеры, использованные в работе. 86
3.23. Определение углеводной и липидной составляющей в семенах трансгенных линий с помощью ЯМР.
4. Результаты и обсуждение. 89
4.1. Предпосылки. Инсерционная мутантная линия №137. 89 4.1.1. Локализация инсерции в гене Atlgl2860 трансгенной линии A. thaliana № 137. 89
4.2. Анализ экспрессии гена Atlgl2860 93
4.3. Поиск in silico генов с высокой степенью соответствия гену Atlgl2860 по нуклеотидному составу .
4.3.1. Сравнительный анализ генов со значимой степенью соответствия первой части гена Atlgl2860.
4.3.1.1. Анализ мутантного фенотипа мутантной линии A. thaliana, содержащей инсерцию в гене Atlgl3200.
4.3.2. Сравнительный анализ гена со значимой степенью соответствия второй части 102
гена Atlgl2860.
4.3. Получение трансгенных линий A.thaliana характеризующихся измененной 106
экспрессией гена Atlgl2860.
4.3.1. Создание векторных конструкций для получения трансгенных линий A.thaliana, 106
характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией первой и второй частей гена Atlgl2860 независимо.
4.3.1.1. ЭТАП 1. Амплификация нуклеотидных последовательностей двух частей гена 108 Atlgl2860.
4.3.1.2. ЭТАПЫ 2-4. Клонирование двух частей гена Atlgl2860 108
4.3.2. Создание векторной конструкции для получения трансгенных линий A.thaliana, 113
характеризующихся повышенной конститутивной экспрессией полноразмерной копии
гена Atlgl2860.
4.3.2.1. Клонирование полноразмерной копии гена Atlgl2860 113
4
t
4.4. Вектор для РНК-направленного «замолкания» гена Atlgl2860. 118
4.4.1. Амплификация уникального фрагмента для РНК-направленного «замолкания» гена Atlgl 2860
4.4.2. Клонирование уникальных фрагментов со второго экзона гена Atlgl2860. 120
4.5. Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana с помощью векторов, 124 специально созданных для определения тонкой структурно-функциональной организации и функции гена Atlgl2860.
4.6. Анализ мРНК гена Atlgl2860 в трансгенных линиях с измененной экспрессией 126 гена Atlgl2860.
4.6.1. Поиск альтернативных форм сплайсирования гена Atlgl2860. 128
4.6.2. Анализ in silico предполагаемой функции продукта гена At5g61270 132
4.8. Поиск мутантного фенотипа трансгенных линий A. thaliana, характеризующихся измененной экспрессией гена Atlgl2860.
4.8.1. Анализ развития трансгенных растений A. thaliana, характеризующихся 133
измененной экспрессией гена Atlgl2860, в стрессовых условиях.
4.10. Сравнение содержания липидов и углеводов в семенах трансгенных растений по 136
сравнению с растениями дикого типа.
5. Заключение 138
6. Выводы 142
7. Публикации. 143
7.1 Научные статьи 143
7.2 Тезисы конференций, устные и стендовые доклады. 144
7.3 Регистрация в базах данных. 145
8. Список литературы
- Основные характеристики Arabidopsis как модельного организма
- История открытия и сравнительная характеристика семейства эукариотических транскрипционных факторов типа Basic helix-loop-helix (bHLH).
- Антибиотики и гербициды, использованные в качестве селективных агентов
- Поиск in silico генов с высокой степенью соответствия гену Atlgl2860 по нуклеотидному составу
Введение к работе
Изучение функций генов у различных организмов до сих пор остаётся одной из наиболее важных и необходимых целей научных исследований. Анализ полученных данных может дать информацию и для сравнительной генетики и для глобального понимания процессов на всех уровнях развития. При изучении функций генов используются методы как прямой, так и обратной генетики. В случае использования подходов обратной генетики проводится отбор кандидатных генов по нуклеотидному составу, схожести последовательностей их белковых продуктов, временному промежутку экспрессии и другим параметрам. Для определения функций генов высших растений основным является метод инсерционного мутагенеза. Основной задачей инсерционного мутагенеза является создание разных типов мутантов, с помощью которых можно наиболее полно охарактеризовать гены и процессы, функция которых каким-либо образом изменена.
Геном растений, и геном A. thaliana в частности, содержит большое число межгенных участков, при попадании в которые инсерция не затрагивает участки, значимые для транскрипции генов. На основании этого факта можно анализировать «суперэкспрессирующие» трансгенные линии и трансгенные растения с РНК-направленным «замолканием» конкретных генов, при встраивании инсерции в данные участки. После завершения в 2000 году глобального проекта по определению нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana, при помощи компьютерных программ in silico было определено множество рамок считывания, предсказаны гены, их структура и функции. Но, несмотря на проделанную биоинформатическую работу, этап экспериментальной проверки полученных данных до сих пор не закончен. Таким образом, экспериментальный анализ структурно-функциональной организации генов, и в частности, поиск и идентификация генов растений, вовлеченных в регуляцию ответа на биотические и абиотические стрессы, на данный момент является актуальной задачей.
В связи с необходимостью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, устойчивость к холодовому стрессу у растений становится одной важнейших задач для генетики и функциональной геномики растений. Ранее были изучены и локализованы гены, такие как ІСЕ1, ESK1 и другие, которые участвуют в регуляции ответа на холодовой стресс. Однако повышенная экспрессия этих генов не приводит сохранению жизнеспособности растений при сильных заморозках. Таким образом, остается актуальной задача идентификации новых генов, участвующих в ответе на холодовой стресс и обеспечивающих морозоустойчивость растений.
Основные характеристики Arabidopsis как модельного организма
На протяжении многих десятков лет растения Arabidopsis thaliana используются учеными для различных исследований, в том числе и изучения структурно-функциональной организации геномов высших растений. Предпочтение A.thaliana другим видам высших растений сложилось в связи с универсальным сочетанием ряда характеристик, отличающих это растение от других. 1) Короткий жизненный цикл 2) Небольшое растение - высота основного побега в среднем около 40 см. 3) Легко культивировать в лабораторных условиях, неприхотливо и занимает относительно маленькую площадь по сравнению с другими растительными объектами. 4) Относительно быстрое развитие, порядка 5- 6 недель от прорастания семян до вызревания семян следующего поколения. 5) Большое число семян (в норме до 10,000 семян с каждого растения) облегчает генетические исследования. 6) Возможность длительного хранения семян A. thaliana без значительной потери их всхожести облегчает создание и поддержание мутантных линий. 7) Возможность получения мутации, в том числе облучением семян или обработкой химическими мутагенами. 8) Возможность самоопыления позволяет быстро получать гомозиготы по рецессивным мутациям (важно отметить, что не все представители этого семейства могут самоопыляться, в связи с тем, что у них активирована система самонесовместимости. Такие представители Arabidopsis содержат инактивирующие мутации в генах SRK и SCR, которые препятствуют самоопылению). 9) Построены физические и генетические карты 10) Один из самых маленьких геномов растительного царства: 115,409;949 пар оснований, распределенных по пяти хромосомам (2п =10) 11) Геном, содержащий порядка 125 м.п.н., распределенных по 5-ти хромосомам был лолностью секвенирован в 2000 году ("The Arabidopsis Genome Initiative", Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana": Nature 408, 796-815, 2000). 12) Возможность использования Agrobacterium tumefaciens для высокоэффективного получения большого количества мутантов (http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress) 13) Крупномасштабное изучение во многих лабораториях мира
Основным подходом при идентификации и изучении функций генов является получение различных типов мутаций, инактивирующих, либо изменяющих экспрессию отдельных генов. Решающую роль в предпочтении Arabidopsis другим объектам, таким как кукуруза, петуния и табак сыграла возможность получения трансгенных растений посредством растительной трансформации, данные о которой были впервые опубликованы в 1986 году, когда был клонирован первый ген Arabidopsis.
Первый.мутант Arabidopsis был описан в 1873 г. Александром Брауном (Alexander Braun), хотя только с 1943 года Arabidopsis стали рассматривать как модельный объект. Ген, детерминирующий мутантный фенотип, был охарактеризован и клонирован в 1990; в настоящее время данный мутант известен как AGAMOUS.
Фредерик Лэйбах (Friedrich Laibach) в 1907 г. опубликовал данные о хромосомном наборе Arabidopsis, а в 1943 году этот род был предложен как модельный объект для изучения высших растений. Эрна Рейнхолз (Егпа Reinholz) в 1945 г. описала первую коллекцию мутантов Arabidopsis, полученную методом радиационного мутагенеза. В то же время Лейбах опубликовал данные о большом количестве экотипов Arabidopsis.
В 1964 г. было зарегистрировано первое общество Arabidopsis Information Service (AIS), которое стало выпускать периодические издания об Arabidopsis. В 1965 году в Геттингене (Германия) провели первую конференцию, посвященную проблематике Arabidopsis.
По данным базы TAIR на апрель 2008 года, всего в геноме A. thaliana представлено 33,282 генов (38,963 моделей), из них 27,235 белок кодирующих генов, 4759 псевдогенов (неэкспрессирующимся последовательностям, гомологичным последовательностям истинных генов (Патрушев Л.И. 2004)) и транспозонов, 1288 РНК-кодирующих генов. Каждый год вносят коррекцию в структуру генов, учитывая новую информацию по кодирующей последовательности, на основании экспериментальных данных; модифицируют экзоны; добавляют информацию о новых генах и новых вариантах сплайсинга генов; вносят изменения по размеру генов (объединяют или разобщают). В итоге для 4330 генов (13%) возможен альтернативный сплайсинг. На данный момент база данных TAIR содержит информацию о 73,527 кДНК и 624,151 ESTs.
На основе информации о некоторых, ранее изученных генах, проводится классификация проанализированных компьютерными программами нуклеотидных последовательностей. Возможность такой интерполяции данных возникает в случае, когда исследуемая нуклеотидная последовательность кодирует продукт, содержащий один или несколько консервативных доменов.
История открытия и сравнительная характеристика семейства эукариотических транскрипционных факторов типа Basic helix-loop-helix (bHLH).
Домен bHLH (basic helix-loop-helix) - аминокислотная последовательность, впервые охарактеризованная в 1989 г. Мюрре, МакКоу и Балтимором в 10 белках, связывающихся с ДНК животного происхождения (Мште С, et al, 1994; Littlewood TD, et al, 1995). Позже у дрожжей также был описан белок 1по4р, содержащий домен bHLH (Garrell, Campuzano, 1991; Ledent V., 2001,) У растений наличие домена bHLH было впервые показано для белка кукурузы Lc, являющегося регулятором антоцианового биосинтеза (Ludvig et al; 1995). Семейство транскрипционных факторов семейства bHLH является одним из наиболее представительных транскрипционных факторов эукариот, известных к настоящему времени (http://datf.cbi.pku.edu.cn/index.php; Toledo-Ortiz G., et al, 2003; Riechmann J.L., et.al., 2000) (Табл. 2.10).
Домен bHLH - это консервативная последовательность аминокислот размером около 60 а.о. с двумя функционально различными мотивами. Во-первых, это - основной мотив (basic)- находящийся в, N-концевом регионе, обогащенный основными аминокислотами, который определяет специфичность ДНК-белкового взаимодействия, состоит из Л 5 а.о. с высоко консервативными позициями. Во-вторых, - мотив HLH (helix-loop-helix) находящийся в С-концевом регионе, обогащенный гидрофобными остатками, которые формируют две амфипатические альфа-спирали, соединенные друг с другом полипептидной петлей, длина которой варьирует (Kim J. et al, 2005). Мотив "спираль-петля-спираль" (HLH) обеспечивает димеризацию факторов и их взаимодействие с ДНК. Во время димеризации альфа-спирализация полипептидных цепей может значительно усиливаться; а после связывания димеров с ДЬЖ основные домены также альфа-спирализуются. Показано, что в димере все четыре HLH-домена ориентированы параллельно друг другу. (Ferre-D Amare А.Е., et al., 1993; Ellenberger Т., et al., 1994; Anthony-Cahill S.J., et al., 1992). Установлено, что некоторые белки могут формировать только гомодимеры, в то время как другие способны образовывать гетеродимеры, взаимодействуя с одним или несколькими близкородственными белками данного семейства (Watson, 1992; http://datf.cbi.pkn.edu.cn/browsefamily.php?familyname=bHLH). Схема образования гетеродимера показана на Рис.2.8.
Белки bHLH распознают мотив ДНК, представляющий собой гексануклеотидную последовательность. К настоящему времени описаны N-боксы (5 -CACGg/aC-3 ) и Е-боксы (5 -CANNTG-3 ), представленные в Табл. 2.13. Одним из наиболее распространенных частных случаев Е-бокса является G-бокс (5 -CACGTG-3 ). Консервативные фланкирующие нуклеотиды в нем обеспечивают специфичность связывания ДНК с белками, а центральные - вариабельные - нуклеотиды отвечают за взаимодействие с элементами, находящимися вне последовательности распознавания (http://datf.cbi.pku.edu.cn/index.php). Кроме того, описано 27 белков, лишенных основного домена, а содержащих только домен HLH. Эти белки не способны связываться с ДНК; они функционируют как регуляторы активности других белков данного семейства.
На основании характера экспрессии и свойств домена HLH, ответственного за димеризацию, все белки типа bHLH у A. thaliana подразделяются на семь групп (Murre С, et al, 1994; Buck M.J., 2003). Кроме того, существует классификация, основанная на анализе критических позиций аминокислот, определяющих способность белка связываться с ДНК и димеризоваться (Heim et al., 2003). Значимыми позициями «основного домена» являются 5-His, 9-Glu,13-Arg, а «домена HLH» - позиция 23-Leu,
консервативная для всех белков данного семейства у A. thaliana. Кроме того, для некоторых белков выявлены дополнительные существенные домены вне ДНК-связывающего участка (Toledo-Ortiz G., et al, 2003, Heim M.A., et al, 2003) (Табл. 2.14.).
Транскрипционные факторы семейства bHLH проявляют активность на протяжении всего клеточного цикла эукариот. К наиболее изученным белкам этого семейства относятся MyoD (регуляторный белок мышц), с-Мус (протоонкоген), BMAL1 -Clock (центральный компонент комплекса, регулирующего циркадные ритмы) (http://en.wikipedia.org/wiki/Basic-helix-loop-helix). Показано, что гомологичные названным транскрипционным факторам растительные белки участвуют в регуляции биосинтеза антоциана (Ramsay N.A., 2003). Установлено также участие белков типа bHLH в сигнальной трансдукции (Abe Н., et al, 2003; Yadav V., 2005; Lorenzo О., 2004) и в формировании ответа на биотический и абиотический стрессы (Anderson J.P., 2004).
Установлено, что белки, лишенные основного домена, а характеризующиеся только наличием домена HLH, являются репрессорами активности других bHLH-содержащих белков (http://web.indstate.edU/thcme/mwking/gene-regulation.htrnl#motifs).
В клетках разных растений была показана коэкспрессия белков, т.е. взаимодействие между транскрипционными факторами, относящимися к разным группам ферментов, например, белка кукурузы (Zea maize) ZmP и белка петуньи (Petunia hybrida) PhANl, которые участвуют в биосинтезе флавоноидов. Другим примером является коэкспрессия группы генов, содержащих домен bHLH, и необходимых для синтеза пурпурного пигмента в кукурузе. (Toledo-Ortiz G., et al, 2003, Heim M.A., et al, 2003).
Антибиотики и гербициды, использованные в качестве селективных агентов
Данные клетки были использованы в качестве реципиентных при трансформации большим количеством плазмидной ДНК для- наработки большого количества.
Культуру бактерий выращивали в течение двух суток на агаризованной среде LB; одну колонию ресуспендировали в 50 мкл охлажденного до 0 С стерильного буфера: 10 мМ Трис-НС1, 50 мМ CaGl2, рН=8,0. Инкубировали в течение 30-60 мин при 0 С. Полученные клетки использовали для трансформации.
Данные клетки использовали в качестве реципиентных при трансформации рекомбинантных плазмид, лигированных по «липким» концам.
Предварительно готовили стерильный раствор «А» (100 мл среды, содержащей 1 г триптона; 0,5 г дрожжевого экстракта; 1 г NaCl), добавляли 5 мл стерильного 25%-ного раствора MgSC 4, 500 мкл стерильного 40%-ного раствора глюкозы. Заражали 200 мкл раствора- «А» ночной культурой Е. coli (DH5a/XLlBlue/JM110), предварительно выращенной в жидкой питательной среде LB. Инкубировали 2 ч при 37 С с аэрацией, охлаждали и осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин. Осажденные клетки ресуспендировали в 1 мл раствора «А» и вносили 2,5 мл охлажденного до 4 С свежего раствора «В» (36% глицерина, 12 мМ MgS04-7H20, 12% PEG 7500). Разливали аликвоты по 200 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70 С.
Данные клетки использовали в качестве реципиентных при трансформации рекомбинантных плазмид, полученных вследствие лигирования фрагментов ДНК по «тупым» концам.
Клетки штаммов Е. coli (DH5a/XLlBlue/JM110) выращивали в жидкой питательной среде- LB до оптической плотности ODeoo=0,6. В 500 мл свежей жидкой среды LB вносили 1-5 мл ночной культуры- и инкубировали до оптической плотности СЮбоо=0,6. Полученную суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин, инкубировали в ледяной бане и промывали осажденные клетки одним литром дистиллированной воды, охлажденной до О С. Повторно центрифугировали при 5000 об/мин-в течение 15 мин при температуре 4 С; промывали в 500 мл охлажденной до 0 С дистиллированной воды, осаждали клетки при 5000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4 С. Вторично промытые клетки ресуспендировали- в 20 мл 10%-ного стерильного раствора глицерина и снова, осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4 С . Осадок клеток ресуспендировали в 4 мл 10%-ного- стерильного раствора глицерина; аликвоты разливали по 50 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70 С.
Для введения плазмид в клетки, штаммов Е. coli использовали метод кальциевого шока (Гловер, 1988). Для этого 0,1-1 мкг плазмидной-ДНК добавляли к клеткам в объеме до 10 мкл, аккуратно перемешивали, инкубировали при температуре 0 С в течение 20-40 мин. Полученную суспензию прогревал» при температуре 42 С в течение 60-90 с в водяной бане, и «подращивали», добавляя 200 мкл жидкой среды LB, в течение 1 ч при температуре 37 С с аэрацией; высевали на агаризованную среду LB с соответствующими антибиотиками.
Замороженные компетентные клетки выдерживали на ледяной бане в течение 30 мин. На 20 мкл суспензии клеток добавляли 5 мкл (до 10 нг) плазмидной ДНК (или смесь после лигирования фрагмента ДНК и векторной молекулы), аккуратно перемешивали пипетированием и инкубировали в течение 40-60 мин на ледяной бане; перемещали в водяную баню (42 С) на 60-90 с (в зависимости от штамма), а затем вновь переносили на лед. Добавляли 600 мкл жидкой среды LB, тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37 С в течение 30-60 мин. Полученные клетки высевали на чашку Петри с 20 мл агаризованной среды LB, содержащей соответствующие антибиотики.
Замороженные компетентные клетки выдерживали на ледяной бане в течение 40-60 мин; добавляли 5 мкл (до Юнг) ДНК и инкубировали в ледяной бане в течение 30 мин. Подготовленную т.о. трансформационную смесь переносили в специальные ячейки, предварительно охлажденные во льду, и, стараясь не нагревать их, быстро переносили в прибор для электропорации (BioRad). Трансформацию осуществляли при импульсе 1,25 кВ в течение 4.0-5.2 мс. Смесь переносили в ледяную баню, добавляли в каждую пробирку по 600 мкл жидкой среды LB, тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37 С в течение 30-60 мин. Клетки высевали на чашку Петри с 20 мл агаризованной среды LB, содержащей соответствующие антибиотики.
Поиск in silico генов с высокой степенью соответствия гену Atlgl2860 по нуклеотидному составу
Таким образом, нами показано, что экспрессия мРНК с последовательности первого экзона гена At lgl 2860 в стандартных условиях развития отсутствует, а экспрессия второго экзона данного гена осуществляется на разных стадиях развития растений A. tha liana, что согласуется с данными, представленными в базе данных Signal-Salk {http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress).
Проведенный нами анализ промоторных участков гена At lgl 2860 A. thaliana в доступных базах данных с помощью программы GENSCAN (http://genes.mit.edu7GENSCAN.html) выявил два промотора, при этом промотор перед вторым экзоном гена Atlgl2860 был идентифицирован только с привлечением базы промоторных последовательностей кукурузы, т.о. выявленная промоторная последовательность охарактеризована только для Zea mats (Рис. 4.5, Табл. 4.3).
Отсутствие сведений в базах данных относительно промоторного участка перед вторым экзоном гена Atlgl2860 может быть объяснено тем, что для A. thaliana данная последовательность промоторной области является нетипичной и не занесена в базу данных GENSCAN, как промотор A. thaliana.
По данным базы GENEVESTIGATOR, полученным с использованием технологии "Microarray", нами были построены сравнительные диаграммы уровней экспрессии на разных стадиях развития растения изучаемого нами гена Atlgl2860 и уровней экспрессии конститутивно-экспрессирующегося гена «домашнего хозяйства» At3gl8780, кодирующего белок актин-2 (Actin-2). Показано, что ген Atlgl2860 экспрессируется на разных стадиях развития растений A. thaliana, достигая максимального уровня на стадии прорастания, однако уровень транскрипции значительно ниже уровня транскрипции гена актина (Рис. 4.6).
Поскольку информация о предположительном белковом продукте гена Atlgl2860 A. thaliana, характеризующегося наличием двух консервативных доменов, отсутствует, актуальной задачей явилось проведение in silico анализа с целью сравнения нуклеотидной последовательности и соответствующей аминокислотной последовательности изучаемого гена с данными, представленными на сервере GenBank. Кроме того, предпринят анализ литературных источников о генах, схожих по первичной структуре с геном Atlgl2860. Собрана также информация о функциях генов, нуклеотидные последовательности которых близки к последовательности изучаемого гена - для оценки предполагаемой функции гена Allgl2860.
Проведен поиск генов, проявляющих высокую степень соответствия последовательности гена Atlgl2860, среди размещенных в базе данных SSDB (www.genome.jp). Предварительно было отобрано 314 генов, белковые продукты которых содержат перекрывающиеся участки, совпадающие с предсказанным белковым продуктом гена Atlgl2860, со степенью идентичности не менее 25% (низкий порог был задан, чтобы выявить максимальное количество ортологов). Наиболее высокая степень совпадения по нуклеотидной последовательности отмечена у гена Q0J605 риса {Oryza sativa). Кроме того, выявлена высокая степень совпадения с предполагаемым белковым продуктом гена Atlgl2860 аминокислотной последовательности белка Os08g0382800 {Oryza sativa). Данный белок состоит из 334 а.о., из которых 322 а.о. идентичны предсказанному белковому продукту гена Atlgl2860. Процент совпадения белка Os08g03 82800 с предполагаемым белковым продуктом гена Atlgl2860 (если транскрипция будет осуществляться с первого промотора) составляет 58%, и в другом случае, если транскрипция будет осуществляться со второго промотора - 83% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Следует отметить, что размер предсказанного белкового продукта гена Atlgl2860 (если транскрипция будет осуществляться с первого промотора) составит 828 а.о., а экспериментально полученная кДНК кодирует белковый продукт, состоящий из 547 а.о. (BG039379 (Sederoff,R, 2000)).
Среди всех генов A. thaliana выявили 588 генов, кодирующих белковые продукты с разной степенью совпадения по аминокислотной последовательности с белковым продуктом гена Atlgl2860. Из них двенадцать генов кодируют белковые продукты со степенью совпадения перекрывающихся участков выше 30% (при условии, что длина перекрывающегося участка более 100 а.о.) (Табл. 4.4).
