Содержание к диссертации
Введение
1. Структурно-функциональная организация кластора рибосомных генов эукариот 12
1.1 РНК-полимераза I 12
1.2 Организация рибосомных генов в геноме эукариот 14
1.3 Промотор Рої I и структура нетранскрибируемого спейсера 17
1.4 Регуляция количества копий рибосомной ДНК 21
1.5 Инсерции в генах рибосомных РНК 28
2. Эволюционная изменчивость кластера рибосомных генов эукариот 34
2.1 Согласованная (концертная) эволюция повторяющихся структурных единиц кластера рибосомных генов эукариот 34
2.2 Эволюционная изменчивость генов рибосомных РНК 37
2.3 Эволюционная изменчивость транскрибируемых внешних и внутренних слейсеров 42
2.4 Эволюционная изменчивость нетранскрибируемых спейсеров 44
3. Общая характеристика денсовирусов. Денсовирусы как векторы для генетической трансформации насекомых и анализа регуляторных элементов генома 46
Материалы и методы 51
Условия содержания В. дегтапіса в инсектарии 51
Поддержание культуры и наращивание биомассы Tetrahymena pyriformis 51
Выделение и очистка тотальной ДНК 52
A) Инфузорий 52
Б) Тараканов 54
B) Растений 54
Г) Других эукариот, исследованных в данной работе 55
Гель-электрофорез и элюция фрагментов ДНК 56
Выделение нативных амплифицированных копий ДНК Tetrahymena pyriformis 56
Получение и очистка FF-фрагмента 57
Ферментативная обработка ДНК 58
Трансформация В. со// 58
Выделение плазмидной ДНК из В. соН 59
Очистка плазмидной ДНК 59
Введение метки в ДНК 60
Саузерн-блот анализ 61
Полимеразная цепная реакция 62
Методы работы с РНК 63
Методы работы с вирусом 64
Электронная микроскопия 64
Клонирование вирусной ДНК 64
Секвенирование ДНК 65
Методы статистической обработки 66
Эксперименты на вьюнах (Misgurnus fossilis) 67
Стимуляция созревания ооцитов и получение оплодотворенной икры 67
Микроинъекции ДНК в зиготы вьюна 68
Определение активности р-галактозидазы 69
Результаты и обсуждение 70
1 . Анализ in siuco генов рибосомных рнк эукариот 70
1.1 28S-подобные гены рибосомных РНК 71
1.2 18S- подобные гены рибосомных РНК 74
2 . Создание универсальных праимеров и зондов, позволяющих методами пцр и блот гибридизации анализировать структуру рибосомной днк эукариот 81
2.1 Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК Tetrahymena pyriformis . 81
2.2 Демонстрация применимости полученных универсальных праимеров и зондов для анализа структуры рДНК эволюционно отдаленных таксонов животных и растений. 85
2.3 Анализ различий структуры кластера рибосомных генов двух видов близнецов: Drosophila melanogaster и Drosophila simulans 87
2.4 Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного (Pisum sativum^ 91
2.5 ПДРФ рДНК на секомых отряда тараканы 91
3. Клонирование, секвенирование и описание структуры полноразмерного повтора рднк рыжего таракана bla ttella germanica 1 00
4. Внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спеисера рднк blattella germanica 110
4.1 Выявление и описание ПДРФ рДНК 110
4.2 Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК 117
4.3 Анализ генетической структуры лабораторных линий рыжего таракана 122
4.4 Анализ генетической структуры природных популяций рыжего таракана 129
5. Анализ эволюционной изменчивости рибосомной днк отряда blattodea 142
5.1 Построение филогенетического древа отряда Blattodea на основе нуклеотидных последовательностей генов 28S рРНК 152
5.2 Анализ эволюционной изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов BlatteHa и Periplaneta 164
- Эволюционная изменчивость внутренних транскрибируемых спейсеров 164
- Эволюционная изменчивость внешних транскрибируемых спейсеров 180
5.3 Анализ эволюционной изменчивости 5.8S генов у представителей отряда Тараканы 185
6. Дєнсовирус рыжего таракана blattella germanicai обнаружение последовательность нуклеотидов и организация генома 187
6.1 Обнаружение и электронно-микроскопическое исследование вируса 189
6.2 Клонирование вирусной ДНК 193
6.3 Последовательность нуклеотидов генома вируса и структура концевых инвертированных повторов 195
6.4 Структура генома 204
- Характеристика открытых рамок считывания и сравнительный анализ белковых последовательностей. 204
- Промоторы 205
- Сигналы полиаденилирования 205
Выводы 211
Приложение 213
Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под
Контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (mlsgurnus fossilis l.) 214
Список литературы 223
- Промотор Рої I и структура нетранскрибируемого спейсера
- Эволюционная изменчивость генов рибосомных РНК
- Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК Tetrahymena pyriformis
- Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК
Введение к работе
Актуальность проблемы
Геном эукариот представляет собой сложноорганизованную систему генов, регуляторных и структурных элементов. Неотъемлемой частью генома любого (за исключением ряда простейших [Yao, 1982]) эукариотического организма является кластер рибосомной ДНК (рДНК), представляющий собой тандемно повторенные гены рибосомных РНК, разделенные рядом спейсерных последовательностей [Gerbi, 1985].
Молекулярно-генетическая организация рДНК различных эукариот во многом сходна, в то же время каждый вид обладает рядом структурных и функциональных особенностей, характерных для данного участка генома. С нашей точки зрения, для комплексного понимания всего разнообразия генетических процессов, лежащих в основе функциональной активности и эволюционной изменчивости живых организмов, принципиально важным является молекулярно-генетическое исследование новых, ранее не исследованных видов, то есть традиционно не являющихся "модельными".
Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов рДНК эукариот
может рассматриваться как эффективный подход к изучению закономерностей
эволюционного процесса [Hillis & Dixon, 1991]. Характерной особенностью рДНК
является то, что различные структурные элементы данного участка генома
эволюционируют с разной скоростью. Наиболее эволюционно консервативны гены
рибосомных РНК (18S, 5.8S и 28S) - их сравнительный анализ эффективен при
исследовании генетических дистанций между эволюционно отдаленными таксонами.
Внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры (ETS, ITS1 и ITS2)
эволюционируют более активно - их сравнительный анализ эффективен при
исследовании филогенетических взаимоотношений между близкородственными
видами. Нетранскрибируемый спейсер (NTS) является наиболее изменчивой частью
рДНК - в пределах одного генома может содержаться несколько типов NTS - анализ
изменчивости данного района рДНК, с нашей точки зрения, позволит проследить
первые этапы эволюционного процесса, то есть возникновение индивидуальных,
внутрипопуляционных и межпопуляционных генетических различий,
предшествующих возникновению нового вида. — t
і еос. НАЦ(,0НДЛЫ,АД 1
Кроме того, кластер рДНК является классическим примером мультигенного семейства и, следовательно, представляет собой удобную модель для анализа механизмов изогенизации ("согласованной" эволюции) членов мультигенного семейства. Основные генетические процессы, лежащие в основе изогенизации, были описаны на примере рДНК различных эукариот [Dover, 1982].
Промотор, обусловливающий экспрессию генов рибосомных РНК (промотор РНК полимеразы I), в отличие от промоторов РНК полимеразы II, обусловливающих транскрипцию большинства генов, кодирующих информацию о белках, и РНК полимеразы III обладает рядом уникальных особенностей. Во-первых, данный промотор обусловливает гиперзкспрессию РНК. Клетки эукариотических организмов синтезируют около 10000 различных типов РНК, при этом около половины транскрипционной активности направлено на синтез только одного типа РНК, а именно рибосомной РНК [Paule & Lofquist, 1996]. Во-вторых, данный промотор не обладает тканеспецифичностью и активно работает во все типах клеток на всех стадиях развития организма. В-третьих, он является видоспецифичным [Sollner- Webb & Tower, 1986]. С нашей точки зрения, вышеперечисленные особенности позволяют предположить, что промотор, обусловливающий экспрессию генов рибосомных РНК, может быть использован как уникальный инструмент для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии. В частности, для исследования функциональной значимости конкретных генов методом "нокаута", посредством экспрессии двунитивой РНК (то есть транскрипции соответствующей палиндромной последовательности ДНК), комплементарной изучаемому гену, под контролем промотора РНК полимеразы I.
Отметим, что методы генетической инженерии, получившие в последние десятилетия большое развитие, позволяют не только генетически модифицировать живые организмы, но и, что с нашей точки зрения особенно важно, изучать биологическую роль конкретных генов посредством специфического подавления функциональной активности соответствующих РНК. В этой связи особенно актуальными представляются исследования, направленные на разработку новых векторных систем, позволяющих переносить чужеродный генетический материал в геном исследуемого объекта. Для получения трансгенных насекомых одним из подходов является использование денсовирусов [Carlson et al., 2000].
Цели и задачи исследования
Сравнительный анализ молекулярно-генетической организации рДНК различных видов организмов необычайно важен для понимания - механизмов функционирования и эволюции живых организмов. В этой связи одной из целей данного исследования была разработка "универсальных" методических подходов, позволяющих исследовать структуру рДНК любых эукариотических организмов вне зависимости от видовой принадлежности.
Второй целью данного исследования являлось описание и выявление особенностей структурной организации и эволюционной изменчивости рДНК нескольких видов насекомых (на примере отряда Blattodea).
Третья цель - характеристика открытого нами нового вида денсовирусов - BgDNV - потенциальной векторной системы, позволяющей экспрессировать чужеродную генетическую информацию в клетках насекомых под контролем мощного промотора генов рибосомных РНК.
В соответствии со сказанным выше были сформулированы следующие основные задачи данного исследования.
2)
3)
4)
1) Посредством анализа in silico рДНК эукариот выявить универсальные
праймеры и молекулярные зонды, позволяющие исследовать методами ПЦР и блот-гибридизации рДНК любых эукариотических организмов, привести экспериментальные доказательства "универсальности" предложенных методических подходов.
Клонировать и секвенировать полноразмерный повтор рДНК рыжего таракана Blattella germanica, описать структурно-функциональные элементы данного участка генома.
Описать внутривидовой полиморфизм различных структурных элементов рДНК рыжего таракана. На основе выявленного полиморфизма исследовать генетическую структуру природных популяций этого вида.
На основе анализа изменчивости нуклеотидов 28S генов рРНК определить генетические дистанции между представителями различных родов отряда Blattodea. Провести анализ эволюционной
изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов Blattella и Periplaneta.
5) Клонировать, секвенировать и описать структуру ДНК обнаруженного
нами денсовируса рыжего таракана BgDNV.
Научная новизна и практическая ценность работы
В работе впервые разработан новый методический подход исследования структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов эукариот, основанный на использовании универсальных праймеров и зондов. На примере нескольких таксономических групп эукариот (насекомых и растений) продемонстрирована эффективность данного подхода, позволяющего клонировать нативные повторы рДНК любых эукариотических организмов, первичная структура рДНК которых не определена, а также исследовать полиморфизм длин рестриктных фрагментов рДНК на популяционном и видовом уровнях. Впервые дано полное описание структурно-функциональной организации нативного повтора рДНК рыжего таракана.
Впервые проведен комплексный анализ различий структурных элементов рДНК (генов 28S- и 5.8S рРНК, внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров) у различных видов отряда Тараканы, - как близкородственных,- так и эволюционно удаленных друг от друга. Показано, что степень эволюционной изменчивости описанных структурных элементов рДНК сильно различается, что отражает двойственную природу эукариотического генома [Алтухов, 2003]. Сравнительный анализ структуры двух внутренних транскрибируемых и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК у близкородственных видов тараканов двух родов - Blattella и Periplaneta - выявил внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома.
В связи с активным использованием антибиотиков на животноводческих фермах особую озабоченность вызывает способность тараканов переносить микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам, которые используют как для ветеринарных целей, так и в медицинской практике [Schal & Hamilton, 1990]. Нами впервые разработаны молекулярно-генетические маркеры ДНК, позволяющие дифференцировать популяции тараканов и определять генетические дистанции и уровень миграции между ними. Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов из животноводческих ферм в населенные пункты и, соответственно, сфокусировать санэпидемиологический надзор в правильном направлении.
Открыт, клонирован и описан новый вирус рыжего таракана Blattella germanica (SgDNV). Показано, что исследованный вирус принадлежит семейству Parvoviridae, род Densovirus. Клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.
Результаты, полученные в настоящем исследовании, были использованы для разработки методологии и оригинальных экспериментов при изучении различных видов насекомых на Кафедре энтомологии Государственного университета Северной Каролины (США). Полученные данные и обобщения следует учитывать при проведении работ в области популяционной генетики, молекулярной эволюции и структурно-функциональной организации генома, а также использовать при чтении соответствующих курсов лекций в ВУЗах.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова (Саратов, 1994); Евроазиатском симпозиуме "Текущие тенденции в биотехнологии" (Анкара, 1995); на международной конференции "Генетические манипуляции с насекомыми" (США, 1999); на международной конференции "Биология насекомых" (Москва, 2002); на второй конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова (Москва, 2003); на научных семинарах Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН; на научных семинарах кафедры генетики Государственного университета Миннесоты (США, 1999), кафедры генетики и кафедры энтомологии Государственного университета Северной Каролины (1997,1999,2000).
Объем и структура работы. Публикации
Промотор Рої I и структура нетранскрибируемого спейсера
Уникальной особенностью промотора рДНК (Рої I) является его видоспецифичность. За исключением ряда близкородственных видов, например, мышь - крыса [Kishimoto et al., 1985; Mishima et al.t 1982], человек - обезьяна [Learned and Tjian, 1982] промотор Pol I неактивен в клетках организма другого вида, другими словами, рДНК одного вида не может быть транскрибируема белковыми компонентами другого вида [Grummt et al., 1982 ]. Кроме того, за исключением очень близкородственных видов практически никогда не удается выявить значимого сходства между проследовательностями рДНК, соответствующих промоторным областям [Reeder, 1989; Hoshikawa et al., 1983; Financsek et al,, 1982]. На рисунке 2 изображены области инициации транскрипции различных эукариот - грибов, простейших, животных и растений. Нуклеотидное выравнивание данных последовательностей {данные не представлены) не выявляет никакого значимого сходства. В тоже время, почти у всех исследованных организмов перед стартом транскрипции расположены ТАТА-Ьох"-подобные последовательности; а за стартом - G/C богатые районы (Рисунок 2). Общая "архитектура" промоторной области рДНК и нетранскрибируемого спейсера в целом у эукариотических организмов имеет много общих черт - даже низший эукариоты имееют регуляторные элементы сходные с таковыми позвоночных животных. Общий план строения нетранскрибируемого спейсера и промотора эукариот изображен на рисунке 1в. Основной промотор (core promoter) обнаружен у всех исследованных к настоящему времени эукариотических организмов; обычно он расположен в области - +10 пн и - -40 пи от сайта инициации транскрипции. Этот промотор можно условно разбить на две области: первая ответственна за инициацию транскрипции и непосредственно окружает сайта инициации, вторая локализуется в "-" области и ответственна за взаимодействие с одним или несколькими транс-активирующими белковыми факторами [Bateman et al., 1985; lida et al., 1985; Kownin et al., 1985; Clos etal. 1986; Tower etal., 1986; Jones et al., 1988; Kownin eta!., 1988; Musters et al., 1989; Firek et al., 1990; Tanaka et al., 1990; Tyler, 1990].
На растоянии -150 нуклеотидов от основного промотора в "-" (upstream) области находится дополнительный регуляторный элемент (upstream control element -UCE) [Skinner et al., 1984; Haltineretal., 1986; Windle and Sollner-Webb, 1986a, 19866; Nagamine et al., 1987; Musters et al., 1989]. Исследования in vivo и in vitro показали, что данный регуляторный элемент не является необходимым для инициации транскрипции, но значительно усиливает уровеныранскрипции. Показано, что с UCE связываются те же транс-активиругащии белковые факторы, что и с основным промотором [Milleretal., 1985].
Показано, что в пределах NTS находится субповторы, выполняющие роль энхансеров. Как правило, это относительно короткие субповторы длиной - 50 - 400 пн. Их количество сильно вырьирует в зависимости от типа NTS и может различаться в пределах различных NTS одного организма. Примерами таких последовательностей могут служить повторы 60 пн и 81 пн, обнаруженные в NTS Xenopus [Busby and Reeder, 1983; Reeder, 1984; Labhart and Reeder, 1984], повтор 140 нп, обнаруженный у мышей [Pikaard et al., 1990; Kuhn et al., 1990], 240 нп и 330 нп повторы Drosophifa [Grimaldi and Di Nocera, 1988; Grimaldi et al., 1990], повтор 140 нп обнаруженный у Acanthamoeba [Yang et al., 1994] и представленная единичной копией последовательность 200нп у дрожжей [Elion and Warner, 1986]. Данные последовательности названы "энхансерами", так как обладают теми же свойствами, что и "типичные" энхансеры промоторов Pol II: они проявляют свои свойства на различных, даже значительных расстояниях от промотора, в ряде случаев было показано, что они сохраняют свои свойства в любой ориентации, локализуясь как "слева" (upstream), так и "справа" (downstream) от промотора [Labhard and Reeder, 1985]. Показано, что энхансеры не являются необходимыми элементами для инициации транскрипции, однако значительно усиливают процесс транскрипции. Интересным является наблюдение, сделанное в экспериментах на дрожжах - было показано, что энхансеры Рої I и Pol II у этих организмов являются взаимозаменимыми, то есть могут усиливают транскрипцию, обусловленную любой из этих РНК-полимераз [Lorch et al., 1990]. Нетранскрибируемые спейсеры многих эукариот содержат функционально значимые последовательности, названные спеисерными промоторами (spacer promoter - SP). имеющие значительное сходство с основным промотором и UCE [Moss and Birnstiel, 1979; Morgan et al., 1984; Murtif and Rae, 1985; Cassidy et at., 1987; Kuhn and Grummt, 1987; Grimaldi and Di Norcera, 1988; Tower et al., 1989; Smith et al., 1990]. Было показано, что с данных промоторов может происходить инициация транскрипции [Pruitt and Reeder, 1984], однако транскрибируются очень короткие последовательности РНК, так как почти всегда за SP располагается другой функционально значимый структурный элемент NTS - проксимальный терминатор транскрипции (proximal transcription termination sequence - PT) [Grummt et al., 1986; Henderson and Sollner-Webb, 1986; McStay and Reeder, 1986; Henderson et al., 1989], терминирующий синтез РНК со спейсєрного промотора. Показано, что с SP взаимодействуют те же транс-активирующие белковые факторы, что и с основным промотором [Smith et ah, 1990). При исследовании многих эукариотических организмов было установлено, что спейсерный промотор усиливает транскрипцию с основного промотора [De Winter and Moss, 1986; Grimaldi and Di Nocera, 1988; Grimaldi et a!., 1990]. По-видимому, основная роль спейсерных промоторов заключается в "притягивание" молекул РНК-лолимеразы I и транс-активирующих белковых факторов, что приводит к увеличению локальной концентрации этих молекул в непосредственной близости от основного промотора и тем самым приводит к усилению транскрипции рРНК.
Эволюционная изменчивость генов рибосомных РНК
Гены рибосомных РНК являются наиболее эволюционно консервативными последовательностями кластера рДНК. Сравнительный анализ данных последовательностей более 20 лет является одним из популярных подходов при изучении филогенетических взаимоотношений между таксонами. В настоящее время накоплено огромное количество информации о последовательностях нуклеотидов генов рибосомных РНК представителей различных таксонов и разработаны специальные компьютерные программы, позволяющие на основе сравнительного анализа данных последовательностей делать наиболее вероятностные заключения о эволюционной близости между таксонами. В силу относительной эволюционной консервативности этих генов, сравнительный их анализ может быть использован для изучения наиболее древних этапов эволюции живого, то есть для выявления филогенетических взаимоотношений между эволюционно отдаленными таксонами. Так сравнительный анализ генов рРНК позволяет изучать происхождение многоклеточных (Metazoa), эволюцию внутри Metazoa и Protozoa, эволюцию двусторонне-симметричных (Bilateria) и радиально-симметричных (Radiate) животных, происхождение вторичнополостных (Coelomala) и первичнополостных (Acoelomata), а также касаться других проблем, связанных с поисками общих предков для всех классов и других крупных таксонов животного и растительного мира [Hiilis and Davis, 1986; Mindell and Honeycutt, 1990; Hillis and Dixon, 1991; Алешин и др., 1995; Hillis et al., 1996; Pennisi, 1998; Adoutte et a!., 1999]. В тоже время данный методический подход был неоднократно использован для анализа филогенетических взаимоотношений между менее эволюционно отдаленными таксонами, например, между различными родами насекомых [Wiegmann et al., 2000]. В рамках данной диссертационной работы сравнительный анализ протяженных (—1200 нп) фрагментов генов 28S рРНК был использован для реконструкции филогенетических взаимоотношений между представителями различных таксонов отряда Тараканы.
В наши дни трактовка анализа данных по рибосомным маркерам, особенно описывающим ранние этапы эволюции живого мира, подвергается серьезной критики. К этому положению привели следующие обстоятельства.
1) Отказ от идеи "молекулярных часов" после появления многочисленных данных, не подтверждающих ее [Антонов, 2000]. Так, сравнение эволюционной изменчивости рибосомных генов и времени эволюции ископаемых остатков фораминифер дает разницу до двух порядков величин [Pawlowski et al., 1997]. В тоже время предпринимаются усилия по построению моделей, в которых учитываются возможности ошибок при сравнении "далеких ветвей" [Bruno et al., 2000] и возможности неодинаковых скоростей замен в разных сайтах [Hwang et. al., 1998].
2) За время эволюции может происходить насыщение мутациями (повторные замены) одного сайта, которое очень трудно тестировать. Очевидно, что если это так, то истинная скорость мутирования может быть больше, чем видимая экспериментально. Эффект насыщения влияет, по-видимому, на структуру всех филогении, построенных по генам рРНК эукариот [Forterre and Phillipe, 1999]. 3) В большинстве работ с использованием рДНК в качестве маркеров эволюции ограничиваются сравнением небольших участков генов рРНК, в то время как число признаков для анализа в наиболее часто используемых программах, по некоторым оценкам, должно быть не менее 1000, чтобы избежать вероятности неправильных результатов [Cumming et al., 1995].
4) Несмотря на огромные достижения в области компьютерного моделирования и построения филогенетических древ, идут постоянные поиски усовершенствований с учетом различных допущений и условий, при которых мог бы происходить реальный процесс эволюции. В свою очередь, моделирование вариантов течения эволюционного процесса само по себе вызывает критику: одна из статей Янга [Yang, 1997] называется "Как часто неправильные модели дают лучший филогении?", где автор утверждает, что сложность проблемы реконструкции филогенетических деревьев в полной мере еще не осознана и требует огромной теоретической разработки и обоснования.
Одной из отличительных черт эволюционной изменчивости генов рибосомных РНК является тот факт, что степень вариабельности различных участков этих генов сильно различается. В пределах последовательности 18S и 28S генов рРНК выявляются сверхконсервативные домены протяженностью от нескольких десятков до сотни и более нуклеотидных пар, которые практически идентичны при сравнении соответствующих генов у представителей различных таксонов. Именно это обстоятельство позволило нам выявить сверхконсервативные домены в последовательности 18S и 28S генов рРНК Tetrahymena pyriformis и на их основе і предложить "универсальные" праймеры, способные в результате полимеразной цепной реакции амплифицировать фрагменты рДНК всех эукариотических организмов. Детальное изложение этого подхода приводится в разделе "Результаты и их обсуждение" данной диссертационной работы.
Природа данных сверхконсервативных доменов становится понятной, если учесть, что рибосомы - органеллы с высококонсервативной функцией -формируются в результате сложных взаимодействий между белками и рибонуклеиновыми кислотами. Участки рРНК, соответствующие местам связывания с белками, безусловно, проявляют эволюционный консерватизм. Более того, для правильного формирования рибосомы, необычайно важным является соответствующая вторичная структура рРНК, которая, в свою очередь, обусловлена соответствующими доменами, являющимися сверхконсервативными.
Эволюционно консервативные домены последовательностей 18S и 28S генов рРНК чередуются с относительно вариабельными областями этих генов [Hillis and Dixon, 1991], Однако степень вариабельности этих участков является во многом относительной. Для правильного формирования вторичной структуры рРНК важной является вся последовательность гена (во всяком случае, не только сверхконсерватиеные домены), поэтому при сравнительном анализе рРНК ряда видов были выявлены и описаны так называемые компенсаторные мутации, то есть согласованное возникновение в разных местах последовательностей генов рРНК нуклеотидных замен, одновременное появление которых не приводит к изменению вторичной структуры рРНК [Hancock et al., 1988; Linares eta!., 1991]. Возникновение компенсаторных мутаций, если и универсальное правило эволюционной изменчивости генов рРНК, но не единственный механизм, обуславливающий правильность пространственной укладки рРНК, необходимой для формирования рибосом. У многих видов описано возникновение скрытых разрывов рРНК [например, Melen et al., 1999]. Суть скрытых разрывов заключается в том, что РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА нуклеотидная последовательность рРНК при формировании рибосомы ферментативно расщепляется на две части, что обеспечивает возможность независимого формирования вторичных структур каждой из частей. Разрывы называются "скрытыми" поскольку при анализе рРНК, экстрагированных из рибосом, методом электрофореза в нативных условиях расщепление выявить не удается. Однако при электрофорезе в денатурирующих условиях, то есть когда все типы взаимодействия между частями молекулы РНК, кроме ковалентных связей, не действуют, наблюдается миграция не единой молекулы, а двух фрагментов.
Гены рибосомных РНК являются наиболее эволюционно консервативными последовательностями кластера рДНК. Сравнительный анализ данных последовательностей более 20 лет является одним из популярных подходов при изучении филогенетических взаимоотношений между таксонами. В настоящее время накоплено огромное количество информации о последовательностях нуклеотидов генов рибосомных РНК представителей различных таксонов и разработаны специальные компьютерные программы, позволяющие на основе сравнительного анализа данных последовательностей делать наиболее вероятностные заключения о эволюционной близости между таксонами. В силу относительной эволюционной консервативности этих генов, сравнительный их анализ может быть использован для изучения наиболее древних этапов эволюции живого, то есть для выявления филогенетических взаимоотношений между эволюционно отдаленными таксонами. Так сравнительный анализ генов рРНК позволяет изучать происхождение многоклеточных (Metazoa), эволюцию внутри Metazoa и Protozoa, эволюцию двусторонне-симметричных (Bilateria) и радиально-симметричных (Radiate) животных, происхождение вторичнополостных (Coelomala) и первичнополостных (Acoelomata), а также касаться других проблем, связанных с поисками общих предков для всех классов и других крупных таксонов животного и растительного мира [Hiilis and Davis, 1986; Mindell and Honeycutt, 1990; Hillis and Dixon, 1991; Алешин и др., 1995; Hillis et al., 1996; Pennisi, 1998; Adoutte et a!., 1999]. В тоже время данный методический подход был неоднократно использован для анализа филогенетических взаимоотношений между менее эволюционно отдаленными таксонами, например, между различными родами насекомых [Wiegmann et al., 2000]. В рамках данной диссертационной работы сравнительный анализ протяженных (—1200 нп) фрагментов генов 28S рРНК был использован для реконструкции филогенетических взаимоотношений между представителями различных таксонов отряда Тараканы.
В наши дни трактовка анализа данных по рибосомным маркерам, особенно описывающим ранние этапы эволюции живого мира, подвергается серьезной критики. К этому положению привели следующие обстоятельства.
1) Отказ от идеи "молекулярных часов" после появления многочисленных данных, не подтверждающих ее [Антонов, 2000]. Так, сравнение эволюционной изменчивости рибосомных генов и времени эволюции ископаемых остатков фораминифер дает разницу до двух порядков величин [Pawlowski et al., 1997]. В тоже время предпринимаются усилия по построению моделей, в которых учитываются возможности ошибок при сравнении "далеких ветвей" [Bruno et al., 2000] и возможности неодинаковых скоростей замен в разных сайтах [Hwang et. al., 1998].
2) За время эволюции может происходить насыщение мутациями (повторные замены) одного сайта, которое очень трудно тестировать. Очевидно, что если это так, то истинная скорость мутирования может быть больше, чем видимая экспериментально. Эффект насыщения влияет, по-видимому, на структуру всех филогении, построенных по генам рРНК эукариот [Forterre and Phillipe, 1999]. 3) В большинстве работ с использованием рДНК в качестве маркеров эволюции ограничиваются сравнением небольших участков генов рРНК, в то время как число признаков для анализа в наиболее часто используемых программах, по некоторым оценкам, должно быть не менее 1000, чтобы избежать вероятности неправильных результатов [Cumming et al., 1995].
4) Несмотря на огромные достижения в области компьютерного моделирования и построения филогенетических древ, идут постоянные поиски усовершенствований с учетом различных допущений и условий, при которых мог бы происходить реальный процесс эволюции. В свою очередь, моделирование вариантов течения эволюционного процесса само по себе вызывает критику: одна из статей Янга [Yang, 1997] называется "Как часто неправильные модели дают лучший филогении?", где автор утверждает, что сложность проблемы реконструкции филогенетических деревьев в полной мере еще не осознана и требует огромной теоретической разработки и обоснования.
Одной из отличительных черт эволюционной изменчивости генов рибосомных РНК является тот факт, что степень вариабельности различных участков этих генов сильно различается. В пределах последовательности 18S и 28S генов рРНК выявляются сверхконсервативные домены протяженностью от нескольких десятков до сотни и более нуклеотидных пар, которые практически идентичны при сравнении соответствующих генов у представителей различных таксонов. Именно это обстоятельство позволило нам выявить сверхконсервативные домены в последовательности 18S и 28S генов рРНК Tetrahymena pyriformis и на их основе і предложить "универсальные" праймеры, способные в результате полимеразной цепной реакции амплифицировать фрагменты рДНК всех эукариотических организмов. Детальное изложение этого подхода приводится в разделе "Результаты и их обсуждение" данной диссертационной работы.
Природа данных сверхконсервативных доменов становится понятной, если учесть, что рибосомы - органеллы с высококонсервативной функцией -формируются в результате сложных взаимодействий между белками и рибонуклеиновыми кислотами. Участки рРНК, соответствующие местам связывания с белками, безусловно, проявляют эволюционный консерватизм. Более того, для правильного формирования рибосомы, необычайно важным является соответствующая вторичная структура рРНК, которая, в свою очередь, обусловлена соответствующими доменами, являющимися сверхконсервативными.
Эволюционно консервативные домены последовательностей 18S и 28S генов рРНК чередуются с относительно вариабельными областями этих генов [Hillis and Dixon, 1991], Однако степень вариабельности этих участков является во многом относительной. Для правильного формирования вторичной структуры рРНК важной является вся последовательность гена (во всяком случае, не только сверхконсерватиеные домены), поэтому при сравнительном анализе рРНК ряда видов были выявлены и описаны так называемые компенсаторные мутации, то есть согласованное возникновение в разных местах последовательностей генов рРНК нуклеотидных замен, одновременное появление которых не приводит к изменению вторичной структуры рРНК [Hancock et al., 1988; Linares eta!., 1991]. Возникновение компенсаторных мутаций, если и универсальное правило эволюционной изменчивости генов рРНК, но не единственный механизм, обуславливающий правильность пространственной укладки рРНК, необходимой для формирования рибосом. У многих видов описано возникновение скрытых разрывов рРНК [например, Melen et al., 1999]. Суть скрытых разрывов заключается в том, что РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА нуклеотидная последовательность рРНК при формировании рибосомы ферментативно расщепляется на две части, что обеспечивает возможность независимого формирования вторичных структур каждой из частей. Разрывы называются "скрытыми" поскольку при анализе рРНК, экстрагированных из рибосом, методом электрофореза в нативных условиях расщепление выявить не удается. Однако при электрофорезе в денатурирующих условиях, то есть когда все типы взаимодействия между частями молекулы РНК, кроме ковалентных связей, не действуют, наблюдается миграция не единой молекулы, а двух фрагментов.
Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК Tetrahymena pyriformis
Из рисунков 4а, б видно, что наиболее протяженные высококонсервативные домены 26S рДНК Т. pyriformis локализованы ближе к 3 концу изучаемой последовательности в районе между 2000 и 3000 нуклеотидами. Эта область была выбрана для создания зонда, позволяющего выявлять последовательности рДНК различных таксономических групп методом блот-гибридизации. В пределах последовательности 17S рДНК Т. pyriformis характер распределения высококонсервативных последовательностей иной - относительно короткие домены равномерно распределены по всей длине гена (смотрите Рисунок 5). Поэтому, а также учитывая относительно небольшой размер этого гена (1752 н), для создания зонда, гомологичного 18S- подобным рДНК, клонировали фрагмент рДНК, содержащий полноразмерный ген 17S рРНК Т. pyriformis.
Как известно, в процессе созревания макронуклеуса инфузорий происходит амплификация локализованной в хромосоме копии рДНК, причем, в макронуклеусе кластер рибосомальных генов представлен в виде лалиндромной последовательности длинной около 20 т.п.н. (Рисунок 7). В зрелом вегетативном ядре Tetrahymena содержится около 1 х 104 копий таких палиндромных последовательностей [Engberg, 1985].
Показано, что при последовательной денатурации - ренатурации ДНК палиндромные последовательности образуют структуры типа "шпильки"; в случае автономно реплицируемых палиндромных структур при этом должны образовываться молекулы половинной длины. Это было показано при использовании высокоочищенных препаратов рДНК Tetrahymena termophila. Нами был разработан новый метод (описание метода см. в разделе "Материалы и методы"), позволяющий выделить и использовать для дальнейшего анализа амплифицированные копии рДНК половинного размера, причем, в качестве исходного материала можно использовать не только очищенные молекулы рДНК, но и тотальную ДНК Т. pyriformis. Как было описано выше, в основе метода лежит обработка препарата тотальной ДНК кислым фенолом (рН 4,5) и нуклеазой S1. На рисунке 8а представлен результат электрофореза тотальной ДНК Т. pyriformis в 0,7 % агарозном геле, на рисунке 86 - тот же препарат после обработки кислым фенолом и нуклеазой S1. Как видно из сравнения рисунков 8а и 86, после описанной обработки тотальной ДНК Т. pyriformis, четко выявляется фракция ДНК с молекулярной массой около 9,5 т.л.н., названная нами FF -фрагмент, представляющая собой амплифицированные копии рДНК половинного размера.
Второй подход, используемый нами для выделения амплифицированных копий рДНК Т. pyriformis, был основан на методе пульс-электрофореза, при этом тотальную ДНК предварительно экстрагировали в особо мягких условиях (смотрите "Материалы и методы") для сохранения нативных размеров и лучшего фракционирования мультикопийных линейных молекул - рДНК и митохондриапьнои ДНК. Результат пульс-электрофореза тотальной ДНК Т. pyriformis представлен на рисунке 9. Рибосомальная ДНК T.pyriformis являлась предметом изучения многих авторов и к настоящему времени составлена подробная рестриктная карта этих молекул и определена полная последовательность нуклеотидов 17S, 5S и 26S рДНК [Engberg, 1985]. На рисунке 7 представлена схема, иллюстрирующая расположение сайтов узнавания рестриктаз Hind\\\ и BgiW на палиндромной молекуле рДНК Т. pyriformis. Отметим, что при обработке рДНК Т. pyriformis рестриктазой Hind 111 в числе прочих образуется фрагмент ДНК {1212 н.п.), соответствующий последовательность 26S рДНК с 1989 -го по 3201 -й нуклеотид, то есть фрагмент, содержащий оысококонсераагивную зону 26S рДНК Г. pyriformis (см. Рис. 7 и Рис. 4), а при последовательной обработке рестриктазами Hind\\\ и Вд!\\ - фрагмент, содержащий полноразмерный ген 17S рРНК Т. pyriformis (см. Рис. 7).
Очищенную ДНК FF -фрагмента (в некоторых экспериментах использовали полнораэмерные амплифицированные молекулы рДНК Т. pyriformis) обрабатывали рестриктазой НШ III, или последовательно рестриктазами Hind ill и Bgf II. Полученный препарат использовали для создания миниклонотек на основе вектора pUC19. Рекомбинантные молекулы были отобраны на основе анализа 1) инактивации гена lacZ в векторе и 2) задержки электрофоретической подвижности [Sambrook et at., 1989]. В результате было отобрано несколько рекомбинантных клонов, содержащих вставки различной длины. Рестриктазныи анализ полученных рекомбинантных молекул позволил отобрать искомые клоны, то есть плазмидные молекулы, содержащие последовательность 26S рДНК Т. pyriformis с 1989 -го по 3201 -й нуклеотид (плазмида названа pFF(H-H)1212) и полноразмерный ген 17S рРНК (плазмида названа p17S(H-B)1752). Фланги клонированных фрагментов были частично секвенированы в составе описанных плазмид и показана полная идентичность ранее описанным последовательностям.
Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК
Для анализа наследования различных структурных вариантов рДНК было поставлено несколько индивидуальных скрещиваний. На рисунке 24а представлен результат блот-гибридизации тотальной ДНК рыжего таракана, обработанной ферментом рестрикции Hind III, с зондом №1 (см. Рисунок 22). На дорожках представлен результат блот-гибридизации с ДНК, выделенной из индивидуальных особей: дорожки, обозначенные как Р«шка и РсаМец - самка и самец, соответственно (родители); слева от дорожек с ДНК родителей - восемь дорожек (1-8) самок первого поколения, справа - десять дорожек (1-10) самцов первого поколения. Известно, что кластер рибосомных генов у В. germanica локализован в Х-хромосоме; самки содержат в геноме две Х-хромосомы, самцы - одну [Ross and Cochran, 1975]. Как видно на рисунке, обе хромосомы Рсамш содержат кластеры рДНК, у которых после рестрикции HindlW и блот-гибридизации с соответствующим зондом выявляются фрагменты одинаковой длины. X хромосома самца (Рсзмцз) содержит кластер рДНК, отличный от такового самки; после рестрикции H/ ndlll и блот-гибридизации выявляется один фрагмент большего размера, чем у Рсам. Очевидно, что все самцы первого поколения должны содержать одну из хромосом самки (Рсаши), а самки первого поколения одну из хромосом самки (Рсамкя) и одну от самца (Рсзмцз). Отметим, что кластеры рДНК, локализованные на гомологичных хромосомах самки теоретически могут содержать различное число повторов рДНК (обычно несколько сотен). Поскольку количество тотальной ДНК, наносимое на одну дорожку в данных экспериментах строго не нормировалось, сравнивать количество копий на гомологичных хромосомах Рсаш можно только по яркости сигнала гибридизации относительно рДНК Рсамца у самок первого поколения. К сожалению, количество самок первого поколения ограничено физиологией объекта исследования - в данном опыте было проанализировано 8 самок (смотрите рисунок 24а). У всех восьми
ОСОбеЙ СООТНОШеНИе ЯРКОСТИ СИГНаЛОВ, СООТВеТСТВуЮЩИХ X ХрОМОСОМе Рсамца и одной из X хромосом Рсаши примерно одинаковы, то есть с вероятностью 99,6% МОЖНО утверждать, что обе X хромосомы содержат одинаковое число повторов рДНК.
На рисунке 246 представлен результат блот-гибридизации ДНК поколения F2. Как видно на рисунке самцы F2 содержат одну из родительских X хромосом (одну из трех), а самки F2 две хромосомы в разных сочетаниях. Отметим, что все исследованные самцы F2 не содержали рекомбинантных X хромосом, то есть X ХрОМОСОМ, Образованных В результате реКОМбИНаЦИИ МеЖДУ ХрОМОСОМаМИ Рсаши и Рсамца в районе кластера рибосомных генов. Поскольку обнаружение таких рекомбинантов являлось для нас принципиальным для определения "островного" или "мозаичного" типа строения рДНК рыжего таракана (смотрите рисунок 22) мы проанализировали 100 самцов F9 (смотрите рисунок 24в) - рекомбинантов также не 118 было выявлено. По-видимому, рекомбинация в районе ядрышкового организатора между гомологичными хромосомами затруднена, что характерно для многих видов эукариот. В тоже время, изменения в структуре кластера рибосомных генов в ряду поколений были выявлены. Сравнение относительной яркости сигналов гибридизации, соответствующих рДНК, локализованных на X хромосомах Рсамки и Рсамца у самок F2 выявляет резкое изменение числа копий рДНК на X хромосоме Рсамца (рисунок 246, сравните дорожки 1 и 3 - самки F2).
Кластер рибосомных генов, как известно (смортрите "Обзор литературы"), типичный пример мультигенных семейств, повторяющиеся единицы которых эволюционируют согласованно благодаря механизмам молекулярного драйва, описанным в. На разных биологических объектах показано, что генетической основой молекулярного драйва могут являться: неравный кроссинговер, межхромосомная генная конверсия (затрагивающая как гомологичные, так и негомологичные 120 хромосомы), внутрихромосомная генная конверсия и сестринские хроматидные обмены. Кроме того, все перечисленные генетические процессы могут обуславливать изменение числа копий в мультигенном семействе. По-видимому, для каждого вида организмов можно выделить один (или несколько) из перечисленных механизмов, которые будут являться основными факторами, обусловливающими характер согласованной эволюции членов мультигенных семейств. Отметим, что "конечный результат" изогенизации в значительной мере зависит от конкретного генетического механизма, лежащего в его основе. Так, межхромосомная генная конверсия предполагает изогенизацию повторов, локализованных на гомологичных хромосомах, тогда как внутрихромосомная генная конверсия или сестринские хроматидные обмены допускают наличие на гомологичных хромосомах различных типов повторов, особенно если рекомбинация между гомологами затруднена. По-видимому, именно внутрихромосомная генная конверсия и/или сестринские хроматидные обмены являются основными факторами, обусловливающими согласованный характер эволюции повторов рДНК В. дегтат са. Более того, обнаружение особей во втором поколении с резко измененным числам копий повторов рДНК на одной из родительских X хромосом, указывает, что один либо оба этих процесса идут в районе ядрышкового организатора В. дегтат са достаточно активно.
