Содержание к диссертации
Введение
Генетический контроль и молекулярные механизмы адаптации фотоспитезирующпх организмов к стрессовым факторам
1. Окислительный стресс и антиоксидаптпые системы защиты б
1.1. Условия развития окислительного стресса и клетках аэробных организмов 6
1.2. Генетический контроль адаптивного ответа на окислительный стресс у энтеробактерин
1.3. Генетический контроль устойчивости к окислительному стрессу
у растений 16
1.4. Системы адаптации к окислительному стрессу у циапобактерніі 18
1.4.1. Изменения в тотальном профиле транскрипции у Synechocystis при гидропероксидном стрессе 19
1.4.2. PerR регулон Synechocystis 20
1.4.3. Изменения в тотальном профиле транскрипции в клетках Synechocystis под действием генератора супероксида MV 22
1.4.4. Контроль устойчивости клеток Synechocystis к MV с участием регуляторного vmaprqR и генов белков-транспортеров 22
2. Молекулярные механизмы адаптации цианобактерий к солевому и гиперосмотическому стрессу 25
2.1. Специфичность адаптивных ответов клеток Synechocystis па солевой и гиперосмотический стресс 25
2.2. Перекрывание адаптивных ответов на солевой и гиперосмотический стресс 27
2.3. Кинетика адаптивного ответа клеток Synechocystis на солевой стресс 28
2.4. Регуляция адаптивного ответа клеток па солевой и пшеросмотический стресс 30
3. Механизмы адаптации клеток Synechocystis к холодовому стрессу 33
4. Системы адаптации фотосинтезирующих организмов к световому стрессу 35
5. Генетический контроль фототаксиса и биогенеза пилей у Synechocystis 37 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
1. Бактериальные штаммы и плазмиды 39
2. Питательные среды и культивирование микроорганизмов 41
3. Определение содержания хлорофилла и каротипоидов в клетках цианобактерий 42
4. Трансформация клеток Е. coli и Synechocystis 42
5. Передача плазмид из Е, coli в Synechocystis с помощью конъюгации 43
6. Тест на чувствительность клеток к ингибиторам роста 43
7. Измерение активности р-галактозидазы в клетках Synechocystis 44
8. Выделение ДНК, определение числа копий плазмид в клетке 45
- Окислительный стресс и антиоксидаптпые системы защиты
- Специфичность адаптивных ответов клеток Synechocystis па солевой и гиперосмотический стресс
- Бактериальные штаммы и плазмиды
Введение к работе
Процессы аэробного дыхания и окенгешюго фотосинтеза сопряжены с образованием активных форм кислорода (АФК), таких как синглстпый кислород, анпон-радпкал суиероксида (Оу"), иероксид водорода и гидрокспльнып радикал. Эти токсичные соединения способны индуцировать в клетке окислительный стресс (ОС), повреждая нуклеиновые кислоты, белки и мембраны (Farr, Kogoma, 1991). У фотоенптезпрующих организмов образование (V" происходит в основном за счет прямого восстановления кислорода фотосистемой I. Мощным ингибитором роста фотоенптезпрующих организмов па свету является гербицид паракват, пли метил виол oi en (MV), способный эффективно акцептировать электроны от фотосистемы I и восстанавливать кислород до Ог~~ (Asada, 1994). Образование ЛФК может также стимулироваться различными факторами внешней среды, в частности, повышенным освещением, экстремальной температурой, а также нарушением водного и солевого режимов (Alschcr et ah, 1997; Giieta-Dahan ct ah, 1997). Цианобактерий и растения обладают эффективными механизмами адаптации к изменению интенсивности света, которые позволяют оптимизировать фотосинтез и ограничить повреждения, связанные с фотоокислением. Одним из таких механизмов является фототаксис цианобактерий и хлоропластов растений, положительный - к свету, и отрицательный - от света высокой интенсивности (Kagawa, Wada, 1999; Castenholz, Garcia-Pichel, 2000).
С помощью геномного анализа и современных методов биоинформатнки у модельной цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis) установлено наличие не менее 15 генов, кодирующих белки с аптиоксидаптпымп функциями (CyanoBase Website). Вместе с тем выявлено около 150 регуляторних генов; почти половина нз них кодирует транскрипционные регуляторы, у большинства из которых функции предполагаемы пли неизвестны. Значительная часть регуляторных генов (80 генов) представляет двух компонентные системы, которые в клетках прокариот контролируют различные адаптивные ответы, такие как хемотаксис, осморегуляцию, азотный и фосфорный метаболизм, споруляцпю, развитие компетентности при трансформации, патогешюсть, вирулентность и др. (Durnford et ah, 1997; Li, Sherman, 2000). В связи с этим идентификация функций генов, вовлеченных в регуляцию работы систем жизнеобеспечения, в том числе защитных, у цианобактерий, является актуальной задачей современной генетики.
В последние годы представления о координированной экспрессии генов фотоенптезпрующих организмов в ответ на стрессовые воздействия существенно расширились благодаря использованию метода ДНК-микрочнпов (мнкроэррэй-аиалпз
5 транскрипции ДНК), позволяющего оценить степень активации или репрессии всех генов организма. С помощью данного подхода исследованы глобальные изменения экспрессии генов Synechocystis при солевом, пшеросмотнческом и холодовом шоке (Kanesaki et ah, 2002; Suzuki et ai, 2001; Inaba et a!., 2003), при адаптации клеток к высокой интенсивности света (Hihara et ai, 2001) и обработке их MV и пероксидом водорода (Kobayashi et ah, 2004; Li et a!., 2004). В результате выявлены целые ансамбли генов, специфически реагирующие па различные стрессовые воздействия.
В пашей лаборатории показано, что в контроль устойчивости клеток Synechocystis к индуктору ОС MV вовлечен геи prqR, кодирующий регулятор транскрипции семейства TetR (Бабыкнн и др., 2003). Этот ген негативно контролирует оперой prqR-prqA, в котором геи prqA кодирует белок с предполагаемой функцией Na+/MV-aHTnnoprepa. Более того, выявлено индуцируемое MV усиление авторспрсссин гена prqR, сопряженное с существенным повышением транскрипции других генов с защитными функциями: sodB, кодирующего супероксидднемутазу, и пптА, кодирующего предполагаемый белок-транспортер токсичных соединений (Нефедова и др., 2003). В данной работе нами показано, что мутация в гене prqR обуславливает отрицательный фототаксис клеток, независимый от интенсивности света, Таким образом, ген prqR вовлечен в контроль систем адаптивного ответа цианобактерий на ОС и изменения интенсивности света.
С целью изучения механизмов генетической регуляции защитных систем клетки с участием гена prqR и генов, входящих с ним в одни кластер, были поставлены следующие основные задачи исследования:
1. Молскулярпо-генетический анализ авторегуляторной функции гена prqR с помощью сайт-направленного мутагенеза и генов-репортеров,
2. Выявление стрессового фактора или возможного индуктора, стимулирующего экспрессию оперопа prqR-prqA, истинная защитная роль которого в клетках цианобактерий требует выяснения.
3. Анализ методом ДНК-микрочипов изменений в тотальном профиле транскрипции у мутантов с нарушенной функцией prqR для обнаружения новых генов, экспрессия которых контролируется геном prqR.
4. Функциональный анализ генов, входящих в один кластер с геном prqR (sll0887, sll0886 и prqA), для установления их роли в регуляции фототаксиса у цианобактерий.
Окислительный стресс и антиоксидаптпые системы защиты
Причиной развития ОС является избыток в клетке АФК, которые могут повреждать практически все известные биомолекулы. Атмосферный кислород, О2, представляет собой бнрадикал в триплстной форме, то есть имеет два неспаренных электрона с параллельными спинами. Такая структура делает его мало реакциопноспособпым в отношении большинства органических соединений. Активация кислорода может происходить двумя различными путями: либо в результате переворота спина одного из неспаренных электронов с образованием сипглетпого кислорода, 02, либо при последовательном одноэлектропном восстановлении триплетного кислорода до воды (Farr, Kogoma, 1991; Blokhina et ai, 2003) (рис. 1). Восстановление 02 катализируется в клетке несколькими ассоциированными с мембранами ферментами дыхательной цепи (Кулинский, 1999; Farr, Kogoma, 1991; Imlay, 2003). Реакционноспособность восстановленных форм кислорода возрастает по мере акцепции одного, двух и трех электронов. В результате образуются следующие АФК: анион-радикал супероксида - Огг, гидропероксид - Н2О2 и гидроксильный радикал - НО»; восстановление последнего приводит к образованию молекулы воды. Первая реакция с образованием Огг -эндотермическая, последующие реакции этой цепи экзотермические (рис. 1).
Анион-радикал супероксида может образовываться в результате автоокисления ферментов, таких как NADH-дегидрогеназы, сукцинат дегидрогеназы, D-лактат дегидрогеназы, глутатион редуктазы, а также при автоокислении убихинонов, катехолов, тиолов и флавинов (Farr, Kogoma, 1991; Imlay, 2003). У фотосинтезирующих организмов образование Огг может происходить в результате взаимодействия Ог с акцепторами электронов фотосистемы I, причем наиболее активно в условиях пониженного содержания окисленного NADP, когда Ог становится преимущественным акцептором электронов от фотосистемы I (реакция Мелера) (Asada, 1994; см. также рис. 4). ОгГ может вступать как в окислительные, так и в восстановительные реакции. Он окисляет серу, тиолы, аскорбиновую кислоту, NADPH, токоферол, катехоламины; восстанавливает цитохром С и ионы металлов с переменной валентностью (железо, медь) (Farr, Kogoma, 1991; Imlay, 2003). Протонированная форма Ог - пергидроксильный радикал (НОО«) - является сильным окислителем, однако его биологическое значение при физиологических значениях рН невелико из-за низкой концентрации (Gebicki, Bielski, 1981).
Специфичность адаптивных ответов клеток Synechocystis па солевой и гиперосмотический стресс
Повышение концентрации соли в среде роста приводит к повышению содержания ионов в цитоплазме и индукции в клетке солевого стресса. Повышение осмотического давления оказывает на клетку двойное действие: уменьшается се общий объем, что вызывает деформацию клеточной мембраны, и снижается количество воды в клетке, что приводит к повышению концентрации веществ, растворенных в цитоплазме (Kempf, Bremer, 1998; Wood, 1999). Было выявлено, что инкубация в 0,5 М растворе NaCl (солевой стресс) приводит к уменьшению объема клетки до 70%, тогда как инкубация в 0,5 М растворе сорбитола (осмотический стресс) - до 30% от начального. Кроме того, при инкубации в 0,5 М NaCl клетки способны восстанавливать первоначальный объем через некоторое время после стресса, в то время как при воздействии сорбитола такого не происходит. Следовательно, повышение содержания ионов Na+ в цитоплазме, вследствие проникновения их через мембрану клетки, является основной характеристикой солевого стресса, а осмотическое давление является второстепенным эффектом данного стресса. Напротив, основная характеристика гиперосмотического стресса - это большое осмотическое давление, возникающее вследствие непроницаемости цитоплазматической мембраны для сорбитола, а повышение концентрации ионов из-за снижения объема клетки - второстепенный эффект. Таким образом, стрессы, вызванные NaCl и сорбитолом, могут по-разному воздействовать на физиологическое состояние клетки и специфически распознаваться цианобактериями (Kanesaki et al., 2002).
Выяснение механизмов адаптации к солевому стрессу актуально не только для фундаментальных, но и прикладных исследований, так как значительная часть орошаемых земель имеет высокую концентрацию солей в почве и не может эффективно использоваться для выращивания пищевых растений, обладающих, как правило, низкой неустойчивостью. Сравнительно хорошо изученным в этом отношении модельным организмом является цианобактерия Synechocystis с ее средним уровнем солеустойчивости (Hagemann et al., 1999).
Бактериальные штаммы и плазмиды
Молекулярные механизмы восприятия и передачи светового сигнала при фототаксисе сложны и мало изучены. В контроль фототаксиса у Synechocystis вовлечены сЛе-подобные гены локусов Taxi и Tax3/TaxAY3, гомологичные генам двухкомпонептпых систем регуляции хемотаксиса, а также многие другие гены, существенные для биогенеза и функционирования Tfp. Это гены, кодирующие белки, подобные пилину типа IV, шапероны, АВС-транснортеры и белки со сверх-спиральными доменами (Bhaya et ai, 20016). В обеспечения подвижности клеток участвуют ссрип-треопнновые протеннкшшы эукарнотическоготнпаЗркА, SpkB и SpkE (Slrl443) (Bhaya el ai, 20016; Kamci el til., 2001, 2003; Kim el ai, 2004). Установлено, что локусы Tax3/TaxAY3 контролируют синтез Tfp-пилей и подвижность клеток, а локус Taxi ответствен за позитивный фототаксис, поскольку инактивация гена taxDl или З -части гена laxAYl (кодирует CheY-подобпыи домен белка TaxAYl) обуславливает отрицательный фототаксис клеток при умеренном освещении. Белок, кодируемый геном taxDl (или pisJl), является предполагаемым сенсором светового сигнала положительного фототаксиса; этот белок, сходный с хеморецепторами, содержит два участка, гомологичных хромофор-связывающему домену фитохрома PhyE растений (Yosliihara et at., 2000; Bhaya el ai, 2001a). Активированный красным светом фоторецептор TaxDl может взаимодействовать с гистидинпротеинкиназой TaxAYl, которая автофосфорилирустся с последующим переносом фосфата на регуляторпый CheY-домен. Вероятно, каскад фосфорилирования завершается на белке-регуляторе РІІТ2, определяющем положительную ориентацию движения клеток относительно источника света (Bhaya el ai, 2000; Bhaya el ai, 2001«). Вместе с тем белок TaxAYl негативно контролирует ген pilAl и функционирование пнлей, возможно, при участии регулятора РІ1Т1, поскольку ипсерция в начало гена taxAYl, как и инактивация гена pilTl, обуславливает повышение транскрипции гсиа pilAl, гипертрофию пнлей и потерю клетками подвижности (Bhaya et я/., 2001а).
