Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Устойчивость ржи к бурой ржавчине. генетика и селекция. (Обзор литературы) 6
1.1. Селекция ржи на иммунитет 6
1.1.1. Рожь как агрономическая культура 6
1.1.2. Бурая ржавчина ржи и ее вредоносность 18
1.1.3. Стратегия селекции ржи на иммунитет 21
1.1.4. Использование ржи как источника устойчивости в
селекции пшеницы 27
1.2. Генетика устойчивости ржи к бурой ржавчине 30
1.3. Локализация и картирование генов ржи 35
1.3.1 Молекулярные и белковые маркеры хромосом 35
1.3.2. Картирование генов ржи с использованием разнообразных маркеров 41
1.4. Заключение 48
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Растительный материал , 53
2.1.1. Характеристика автофертильных линий и источников устойчивости, полученных от О.В. Солодухиной 53
2.1.2. Схема получения межлинейных гибридов и гибридов от скрещивания устойчивых растений и автофертильных линий 55
2.2. Методы оценки на устойчивость к бурой ржавчине 59
2.3. Методы изоферментного анализа 60
2.3.1. Изозимные маркеры, используемые в работе 60
2.3.2. Методы разделения изоферментов 62
2.3.2.1. Методы электрофореза 62
2.3.2.2. Методы изоэлектрического фокусирования 63
2.3.3. Методы выявления изоферментов 64
2.3.4. Принятые сокращения 66
2.4. Морфологические маркеры, используемые в работе 67
2.5. Методы генетического анализа 67
2.6. Статистическая обработка данных 68
Глава 3. Генетика устойчивости ржи к буройржавчине 71
3.1. Выявление генофонда устойчивости ржи к бурой ржавчине 71
3.1.1. Оценка коллекции автофертильных линий ржи на устойчивость к клонам бурой ржавчины. Отбор устойчивых линий 71
3.1.2. Субколлекция автофертильных линий ржи 77
3.1.3. Повышение устойчивости ржи к бурой ржавчине. Отбор устойчивых растений из популяции Волхова, как пример возможности для селекции 80
3.2. Анализ гибридов Fi на устойчивость к клонам Puccinia dispersa 83
3.3. Изоферментный анализ гибридов Fi 88
3.4. Анализ расщеплений гибридов F2 по устойчивости к клонам Puccinia dispersa 90
Глава 4. Локализация генов устойчивости на хромосомах ржи 134
4.1. Анализ расщеплений гибридов F2 по аллельным вариантам изозимов и морфологическим маркерам 134
4.2. Анализ совместного наследования изоферментных локусов, морфологических маркеров и генов, контролирующих устойчивость к клонам возбудителя бурой ржавчины 144
4.3. Построение карт участков 1R и 5R хромосом ржи 164
Заключение 171
Выводы 176
Практические рекомендации 177
Список литературы
- Рожь как агрономическая культура
- Генетика устойчивости ржи к бурой ржавчине
- Характеристика автофертильных линий и источников устойчивости, полученных от О.В. Солодухиной
- Выявление генофонда устойчивости ржи к бурой ржавчине
Введение к работе
Рожь (Secale cereale L.) является одной из важнейших продовольственных зерновых культур, особенно в Нечерноземной зоне России.
В последнее время прослеживается стойкая тенденция увеличения посевных площадей ржи и рост валового продукта. Однако, различные заболевания, в том числе и вызываемые грибными патогенами, такими как бурая ржавчина (возбудитель - Puccinia dispersa Eriks et E.Henn.), приводят к значительным потерям урожая. В свете этого, изучение иммунитета ржи является одной из основных задач входящих в стратегию селекции устойчивых сортов.
В то же время, изучению такого важного аспекта иммунитета ржи как генетика устойчивости к грибным заболеваниям, в частности к бурой ржавчине, посвящено незначительное количество работ. Это особенно заметно в сравнении с объемом отечественных и зарубежных исследований в области частной генетики этой культуры и генетики устойчивости других зерновых культур к болезням. До настоящего времени исследования генетики устойчивости ржи были сосредоточены на поисках и анализе высокоэффективных генов диких видов и переносу их в культурную рожь или в пшеницу. В то же время выяснено, что рожь сама обладает значительным потенциалом генов устойчивости, выявлено несколько эффективных генов устойчивости к бурой ржавчине и определено, что выявленная устойчивость обычно наследуется олигогенно и доминантно.
Это дает возможность использовать естественный потенциал генов устойчивости ржи в селекции на иммунитет.
Изучение как генетики ржи в целом, так и, генетики устойчивости к грибным заболеваниям в частности, сдерживается перекрестным характером опыления ржи и существующей у этого вида строгой системой гаметофитной самонесовместимости. Это осложняет проведение гибридологического анализа, который, в том числе и по признаку устойчивости к болезням достаточ-
5 но легко ведется у других видов культурных злаков, как, например, у пшеницы или ячменя.
Обнаружение мутаций автофертильности позволило преодолеть автостерильность и создать генетически однородные инбредные линии ржи, успешно использующиеся для изучения ее генетики, в том числе, генетики болезнеустойчивости (Смирнов, Соснихина, 1981, 1984; Смирнов, Войлоков, 1990; Priyatkina et al., 1994; Tan, Luig and Watson, 1976). Большая коллекция автофертильных линий имеется в лаборатории генетики растений БиНИИ СПбГУ. Существующие в БиНИИ инбредные линии ржи гомозиготны по большинству генов, что позволяет вести с ними работу также как и с самоопыляемыми культурами.
Кроме того, к настоящему времени найдены морфологические,, биохимические и молекулярные маркеры всех семи хромосом гаплоидного набора ржи, определены группы сцепления, что позволяет вести работу по локализации генов устойчивости.
Это направление исследований имеет большое значение, так как знание о локализации генов устойчивости, их сцеплении с другими, в том числе и с хозяйственно ценными признаками, даст возможность целенаправленно создавать доноры устойчивости и, впоследствии, устойчивые сорта ржи.
В связи с вышесказанным, целью настоящей работы является определение генетической детерминации наследования специфической устойчивости ржи к бурой ржавчине и картирование генов устойчивости на хромосомах ржи.
Рожь как агрономическая культура
Рожь относится к семейству Роасеае, трибе ТгШсеае, роду Secale L. Вид S. cereale L. (рожь посевная) полиморфный, объединяет все формы диплоидной и тетраплоиднои однолетней и многолетней культурной ржи, а, также сорно-полевой ржи с неломким и ломким колосовым стержнем.
По систематике, предложенной В. Д. Кобылянским (1982) в роде Secede L. выделяются четыре вида, объединенных в две секции: I - секция - Oplismenolepis Neveski (плотнозакрыточешуйчатая), включающая дикорастущие однолетние и многолетние виды; II — секция - Secale, включающая вид рожь посевная, разделенный на пять подвидов.
Разделение рода Secale на две секции отражают место видов в природе, их эволюцию и влияние человека на формирование некоторых из них и облегчает использование видов для решения практических задач селекции.
Возникновение рода Secale приурочено к средне - и верхнетретичному периодам кайнозойской эры (Иванов, 1961). Установлено два генетических центра максимального разнообразия форм ржи. Первичный, так называемый Переднеазиатский генетический центр, который является родиной культурной ржи, расположен на территории Малой Азии, Закавказья, Северозападного Ирана (Вавилов, 1967; Жуковский, 1971). Здесь произрастают и все дикие виды ржи. Второй генетический центр (Среднеазиатский) со значительно меньшим разнообразием S. cereale и одним диким видом - S. silvestre включает Северо-восточный Иран, Афганистан и Среднюю Азию. Этот центр считается вторичным, образовавшимся в результате миграции форм ржи из первичного генетического центра. Н.И. Вавилов (1967) установил, что культурная рожь произошла из сорно-полевой, которая как сорняк продвигалась с посевами пшеницы и ячменя в северные и высокогорные районы, где она как более холодостойкое растение постепенно, вытесняя пшеницу и ячмень, стала основной культурой. Такое представление о происхождении культурной ржи является в настоящее время общепризнанным.
Человек стал возделывать рожь значительно позднее пшеницы, ячменя и многих других полевых культур. Она не была известна народам Ассиро -Вавилонского государства (XXIII — VII в. до н. э.), Древнего Китая и Индии. В то же время, зерна ржи, найденные при раскопках в Моравии (по Иванов, 1961) являются доказательством того, что во времена свайных построек, т. е. около 2000 лет тому назад, - в конце бронзового периода, рожь уже была известна в Европе как культурное растение.
Археологические находки указывают на значительное распространение культуры ржи в Восточной Европе. Так, населению среднего Приднестровья рожь была известна во II -I в. до н. э. В Древней Мордве во второй половине I тысячелетия н. э. рожь возделывалась в бассейне р. Оки. Найденные при раскопках Старой Ладоги зерна ржи, указывают на то, что в VII веке н. э. рожь стала известна и населению северных районов Киевской Руси.
В настоящее время рожь (Secale cereale L.) в России является второй хлебной культурой после пшеницы.
Ареал возделывания.
Ценность ржи определяется ее высокой зимостойкостью и способностью давать рентабельные урожаи на бедных песчаных почвах (Кобылян-ский, 1982; Част. сел. пол. культур, 1990). Кроме того, по пищевой и физиологической ценности зерно ржи и ржаной хлеб имеет ряд преимуществ по сравнению с зерном пшеницы и хлебом из него, так как рожь превосходит пшеницу по содержанию в белке многих незаменимых аминокислот, а именно, лизина на 39%, аргинина на 44%, валина на 11%, треонина на 17%, уступая по количеству гистидина, тирозина, триптофана. В связи с повышенным содержанием лимитирующей аминокислоты — лизина — биологическая ценность белка ржи выше, чем пшеницы. По сравнению с питательной ценностью белков молока питательная ценность белков ржи составляет 83%, а пшеницы — лишь 41%. Зерно ржи содержит витамины А и С, кроме того рожь превосходит пшеницу по содержанию витаминов Вг и Е (Кобылянский, 1982, Тихонов, Захряпин, 1986).
По площади посева рожь в мировом земледелии занимает восьмое место после пшеницы, риса, ячменя, кукурузы, овса, проса и сорго.
Основными производителями ржи кроме России являются Украина, Белоруссия, Прибалтийские страны, Польша, ФРГ, Скандинавские страны, Канада и США.
На долю России приходится 50% всех посевов и одна треть производства зерна ржи в мире (Гончаренко, 1995). Рожь, в основном озимую (99,8%), возделывают во многих агроклиматических зонах Российской Федерации (Поволжский, Волго-Вятский, Центральный и Уральский экономические районы). Яровую рожь выращивают на небольших площадях в Восточной Сибири.
В последние годы прослеживается четкая тенденция увеличения посевных площадей, и увеличения урожая зерна ржи. Так, с 1999 года по 2002 год площадь посевных площадей увеличилась с 3394 тыс. га. до 3814 тыс. га. и соответственно, валовый сбор зерна ржи вырос с 4782 тыс. тонн в 1999 году до 7127 тыс. тонн в 2002 году (Тютерев, 2003).
Морфология.
Рожь, как и все зерновые культуры, имеет мочковатую корневую систему, стебель - полая соломина, состоящая из трех - семи междоузлий, отделенных друг от друга узлами. Высота растений, возделываемых сортов ржи 80-180 см. Окраска стебля вегетирующего растения ржи зеленая с сизым оттенком от воскового налёта. В зрелом состоянии стебли желтые или имеют разные оттенки антоциановой окраски.
Генетика устойчивости ржи к бурой ржавчине
Генетика устойчивости большинства злаковых культур, например, пшеницы к бурой ржавчине {Puccinia reconditaf. sp. tritici Rob.) интенсивно изучалась и изучается, что привело к идентификации и картированию значительного количества генов устойчивости. К 1984 году было найдено и локализовано на хромосомах всех трех геномов пшеницы 46 генов устойчивости к бурой ржавчине. Больше всего генов устойчивости к листовой ржавчине локализовано на хромосомах В и D геномов (В - 16 генов, D- 12 генов) и меньше всего в геноме А - 7 (The cereal rust, 1984). К настоящему времени, картировано девять генов устойчивости пшеницы, а так же найдены молекулярные маркерные гены, сцепленные с генами устойчивости — Lr35 (Seyfarth et al., 1999 по Михайлова, 2003), Lr24 (Dedryver et al., 1996), Lr9 (Schacher-mayr et al., 1994), Lr39 (Raupp et al., 2001), а так же Lr29 и Lr25 (Procunier et al., 1995). Работа в этом направлении активно продолжается (Enjalbert, et al., 1999).
Изучен характер наследования устойчивости — специфическая устойчивость в большинстве случаев наследуется моногенно и доминантно. Кроме, того, показано, что гены устойчивости могут взаимодействовать. Комбинация двух эффективных генов может обусловливать более высокую устойчивость, чем один из них (аддитивное взаимодействие); неэффективные гены могут проявлять модифицирующее действие в комбинации с эффективным геном; неэффективные гены могут иметь малое остаточное действие и в комбинации могут обеспечить усиленную устойчивость (остаточный эффект генов) (Михайлова, 2003). Пример аддитивного взаимодействия генов на пшенице показан в работе J.A. Kolmer с сотрудниками (1992). Ген устойчивости к листовой ржавчине Lrl3 представлен у многих североамериканских образцов твердой красной яровой пшеницы, которые показывают длительную ус 31 тойчивость к листовой ржавчине. Пятнадцать попарных комбинаций Lrl3 и генов проростковой устойчивости к листовой ржавчине были получены в результате перекрестного опыления с изогенной линией Тэтчер. Как в пророст-ковых тестах, так и на взрослых растениях, гомозиготы парных комбинаций генов специфической устойчивости с Lr 13 увеличили устойчивость к ржавчинным изолятам по сравнению с каждым родителем.
Однако изучению генетики устойчивости культурной ржи к болезням, в частности к бурой ржавчине, посвящено очень малое количество работ. Количество генов устойчивости и толерантности, уровень их вариа-бильности, и их картирование на ржаных хромосомах, остается практически открытым вопросом (Benito, 1996).
Несмотря на то, что впервые именно на ржи и бурой ржавчине была показана дифференциация клонов ржавчинных грибов по вирулентности (Mains, Leighty, 1923), эти работы в течение долгого времени не получали развития.
Существующие немногочисленные исследования сосредоточены на поисках и анализе высокоэффективных генов диких видов и переносу их в культурную рожь или ото ржи в пшеницу (Кобылянский, 1979; Де-дяев и др., 1981; Кобылянский, 1982; Singh, Shepherd, 1990). Отчасти это связано с тем, что, если у пшеницы достаточно легко, хотя и в небольшом количестве выявляются полностью устойчивые к болезни образцы, то устойчивые образцы вида S. cereale в коллекции ВИР отсутствовали, хотя некоторые дикие виды ржи выявили высокую устойчивость (Кобылянский, 1977; Кобылянский, 1989). Поскольку образцы ржи состоят из генетически различающихся растений (Смирнов, Соснихина, 1981), общая картина взаимодействия такого образца с популяцией паразита не могла выявить уровень устойчивости вида.
Важнейшим этапом в изучении болезнеустойчивости ржи, создавшим основу для расширенного изучения генетики устойчивости, в том числе и к бурой ржавчине, являются работы, проведенные под руководством проф. В. Д. Кобылянского.
Первые материалы по созданию доноров расоспецифической устойчивости ржи к бурой ржавчине были получены во Всесоюзном НИИ Растениеводства. В 1967 году в популяциях дикой многолетней ржи выделены расте Ч ния, характеризующиеся сверхчувствительной реакцией к бурой ржавчине и мучнистой росе (Шакирзянов, 1991).
К настоящему времени определено, что устойчивость ржи к бурой ржавчине наследуется олигогенно и детерминирована как минимум шестью доминантными аллелями генов устойчивости к популяции бурой ржавчины (Lr4, Lr5, Lr6, Lr7, Lr8, LrlO) (Солодухина, 1993, 1994, 2002, 2003). Было определено, какие гены детерминируют устойчивость к бурой ржавчине образцов ржи, используемых как источники устойчивости (табл. 1.2.1). Интересно, что экспрессивность и эффективность генов Lr8 и LrlO зависит от их ал-лельного состояния. Большинство идентифицированных олигогенов ржи представляют собой блоки сцепленных генов, ответственных за устойчивость к отдельным клонам гриба. Из всех проанализированных генов устойчивости только ген Lr5, интрогрессированный в культурную рожь Secale cereale от дикой многолетней ржи S. montanum, оказался сцеплен с факторами, вызывающими нарушение системы размножения гибридных растений от отдаленных скрещиваний. Это приводит к снижению озерненности колоса устойчивых растений (Солодухина, 2002). При анализе образца Иммунная 1, устойчивость которого к популяции бурой ржавчины детерминирует один доминантный ген устойчивости, прямые и обратные анализирующие скрещивания с восприимчивым сортом Ильмень показали, что передача генов устойчивости при гибридизации не зависит от цитоплазмы (Солодухина, 1986). Кроме того, было доказано, что идентифицируемые в ранней фазе онтогенеза главные гены устойчивости к бурой ржавчине ржи экспрессируются и в более поздних фазах развития растений (Солодухина 2003).
Характеристика автофертильных линий и источников устойчивости, полученных от О.В. Солодухиной
В работе использовались автофертильные инбредные линии ржи (304 линии) из коллекции лаборатории генетики растений Биологического НИИ Санкт-Петербургского Государственного Университета (БиНИИ СПбГУ). Все линии насчитывают несколько поколений инбридинга и происходят от сортов и популяций ржи: Красноколосая, Черноколосная фиолетовозерная, Карлик с красными ушками, Белозерная без воскового налета, Белозерная черноколосая, Карлик без лигулы, Вятка, Сталь. Семена линий были получены в лаборатории генетики растений при групповой и индивидуальной изоляции колосьев. В таблице 2.1. представлена характеристика линий, взятых в дальнейшем в генетический анализ (характеристика линий получена от А.В. Войлокова).
По результатам предварительной оценки коллекции был отобран материал для гибридизации, то есть, линии, различающиеся по реакции на заражение и предположительно имеющие разные гены устойчивости к разным клонам бурой ржавчины (табл. 3.1. глава 3).
Межлинейные гибриды Fi были получены на опытном поле БиНИИ СпбГУ в Петергофе. Отобранные для скрещивания линии в феврале высаживали в теплице в деревянные ящики по 7 растений каждой линии и выращивали в них до начала кущения. Затем, в марте ящики с линиями выставляли на открытый воздух для яровизации. После яровизации, в конце мая, линии высаживали в поле. При скрещивании, предварительно кастрированные материнские растения опыляли пыльцой отцовского растения, после чего на них одевали бумажные или целлофановые изоляторы. Одновременно с помощью изоляторов инцухтировали, как родительские растения, так и другие растения данных родительских линий для дальнейшего определения их генотипа.
В результате проведенных скрещиваний были получены 18 межлинейных гибридов Fi (Табл.2.3.).
По такой же схеме были получены и гибриды F2. Гибриды Fi высаживали в теплице для оценки на устойчивость к клонам бурой ржавчины. Затем, начиная с конца марта, ящики с гибридами выставляли на улицу для яровизации. После яровизации гибриды высаживались в поле и инцухтировали с помощью изоляторов для получения F2. Изолятор ставился на каждое растение гибридной семьи Fi. В 20-х числах августа гибриды собирали и обмолачивали.
В работе кроме межлинейных гибридов, использовались гибриды Fi, полученные О.В Солодухиной методом многократных беккроссов гетерозиготного, устойчивого растения на восприимчивый сорт Ильмень (рис.2.1.).
Для оценки на устойчивость инбредные линии ржи из коллекции Би-НИИ СпбГУ выращивались в лабораторных условиях в деревянных ящиках по 7 растений от каждой линии. Гибриды Fi F2 выращивались в теплице Би-НИИ СПбГУ в деревянных ящиках по 12 растений каждого гибрида Fi и все растения анализируемого гибрида F2.
Популяции возбудителя бурой ржавчины, полученные из разных регионов России, а так же Германии, размножали на отрезках листьев ржи, сорта Волхова по лабораторной методике с применением бензимидазола. Из популяций были выделены монопустульные изоляты. Оценку устойчивости линий и гибридов к возбудителю ржавчины (Puccinia disperse?) проводили по лабораторной методике культивирования возбудителя на бензимидазоле (Михайлова, Квитко, 1970).
Оценку на устойчивость проводили в фазу от проростков до начала кущения. Для анализа на устойчивость к бурой ржавчине автофертильных линий брали молодые листья от каждого растения. Для анализа на устойчивость к бурой ржавчине гибридов Fi и F2 анализировали листья растений, начиная с фазы проростков до начала кущения. Отрезки листьев раскладывали в кюветы на фильтровальную бумагу, смоченную 0,004% раствором бензи мидазола. Фитогормон бензимидазол поддерживает клетки в ювенильном состоянии, предохраняет хлоропласты от распада и дает возможность отрезкам листьев длительное время оставаться зелеными (Дьяков, 1998).
При анализе автофертильных линий и гибридов Fi отрезки листьев заражали при помощи микробиологической иглы несколькими клонами бурой ржавчины (4 - 5) предварительно размноженными на отрезках ржи сорта Волхова. После нанесения спор, смешанных с тальком, листья опрыскивались водой. Заражение гибридов F2 проводили опрыскиванием отрезков листьев суспензией урединиоспор каждого клона в отдельности.
Учет поражения проводился на 7 - 9 день после заражения. К устойчивым относили растения с ярко выраженными некротическими пятнами с типами реакций 0,;, 1, 2., к восприимчивым - с типами реакций 3, 4 по пяти-бальной шкале Е.В. Mains и H.S. Jackson (1926).
В работе были использованы маркеры, контролирующие отдельные изозимы, бетаглюкозидазы (b-GLU), эстеразы (EST), пероксидазы (PRX), супероксиддисмутазы (SOD), эндопептидазы (ЕР), диафоразы (DIA), фос фоглюкоизомеразы (PGI)» малатлегидрогеназы (MDH), аспартатаминотрансферазы (ААТ).
В качестве контроля для определения аллельных вариантов изозимов использовались инбредные линии ржи — 5, 6 и 8, оцененные ранее (Фыонг, 1993; Войлоков и др., 1994). Характеристика линий по аллельным вариантам изозимных локусов, расщепление по которым учитывалось в работе, приведена в таблице 2.5.
Выявление генофонда устойчивости ржи к бурой ржавчине
Оценка коллекции автофертильных линий ржи на устойчивость к клонам бурой ржавчины. Отбор устойчивых линий. Для выбора родительских линий была осуществлена оценка практически всей имеющейся в БиНИИ коллекции автофертильных инбредных линий ржи (304), любезно предоставленной А. В. Войлоковым, к 27 моно-пустульным культурам (клонам) бурой ржавчины, выделенным из петергофской популяции. В связи с низкой всхожестью семян автофертильных линий, не удалось оценить все имеющиеся в распоряжении линии ко всем 27 выделенным клонам гриба, но большая часть линий (203 линии) оценены на устойчивость к 10-27 клонам, а 101 линия - к 5 - 10 клонам, что показано на рисунке 3.1.
Анализ полученных данных показал, что 59,19 % линий обладает устойчивостью к большинству использованных клонов P. dispersa (от 40 до 100%), что видно из рисунка 3.2.
Такая высокая устойчивость линий говорит о высоком потенциале устойчивости культурной ржи и характеризует сами линии как устойчивые.
Устойчивость отдельных растений ржи к 20-30 и 40% клонов была выявлена ранее рядом исследователей (Кузина, 1976; Дмитриев и др., 1982; Дмитриев, Куликова, 1984.). Устойчивость растений ржи к клонам бурой ржавчины может быть намного выше - к 50 - 70 процентов клонов (Солоду-хина, 1993).
Так как линии, бравшиеся в анализ, получены в результате многократного инбридинга, то предполагается, что они гомозиготны по многим генам (Смирнов, Соснихина, 1984). Это оправдывается в случае многих признаков, в частности, морфологических, но оказалось, что по признаку устойчивости - восприимчивости, некоторые линии показывают гетерогенную реакцию в ответ на заражение. То есть, при заражении клоном бурой ржавчины проанализированные растения данной линии делятся на устойчивые и восприимчивые растения. Например, проанализированные растения линии 44/94 при оценке на устойчивость к клону №12 делились в соотношении 3 устойчивых (тип реакции "О") : 3 восприимчивым ("3").
В связи с этим, возникает закономерный вопрос: чем это можно объяснить - реальной генетической гетерогенностью линий, тем, что они не однородны по данному признаку, либо же, что также весьма вероятно, ошибкой эксперимента, когда по каким-либо причинам ржавчина не проявлялась на части листьев растений данной линии и это было учтено как соотношение устойчивых растений ("О" тип реакции) к восприимчивым. Не возникало сомнений в случае, когда устойчивые растения показывали тип реакции - ";", "1", "2", то есть достоверно заражение имело место, как например, у линии 375/95 при заражении клоном № 69 проанализированные растения соотносились как 4 устойчивых ("1") к 3 восприимчивым ("3").
Кроме того, при оценке некоторых линий, семена которых получались не вследствие групповой изоляции колосьев, а набором индивидуальных инцухтов отдельных растений, наблюдались различия по реакции на один и тот же клон потомств от инцухтирования разных растений одной и той же линии, что может свидетельствовать о возможной гетерогенности и у других линий. Так, например, инцухтированные растения №7 и №4 линии Т34/96 различались по устойчивости к некоторым клонам бурой ржавчины: I.T34/96 р7 - к клонам 21, 31 и 63 была устойчива (тип реакции ";"), a I.T34/96 р4 к этим клонам была восприимчива (тип реакции -"3"). Так же и у линии Т36/92 - I.T36/92 р12 восприимчива к клону 74, а 1.Т36/92р9 — устойчива (тип реакции —";"). Надо отметить, что инцухты растений каждой линии можно считать группой близкородственных линий, что учитывалось при анализе.
Несмотря на то, что линии прошли много поколений инбридинга явление гетерогенности по признаку, который не анализировался ранее, весьма вероятно.
Так как выяснить реальность гетерогенности можно только путем дальнейшей проверки, то можно предположительно учитывать гетерогенные линии, как восприимчивые к данному клону. Если принять то, что h=+ как необходимое допущение, то можно осуществлять дальнейший анализ полученных данных, а именно определение возможного количества генов устойчивости у анализируемых линий. При этом, исходили из концепции X. Г. Флора "ген на ген" (1971). Согласно данной гипотезе, каждому гену, детерминирующему устойчивость у хозяина, соответствует ген, который контролирует патогенность у паразита и в случае сочетания доминантной аллели гена вирулентности с доминантной аллелью гена устойчивости, наблюдается реакция несовместимости (устойчивость растения). В случаях, когда у одного или обоих партнеров соответствующие гены находятся в гомозиготном рецессивном состоянии, наблюдается совместимость (восприимчивость растения).
Таким образом, предположим, что линии А, Б, В, Г, Д и т.д. заражали клонами ржавчины (1,2,3,4 и т.д.); к клону №1 устойчивы линии А, Б, В, Г, Д. Назовем этот ген - ген устойчивости Rl. Рассмотрим реакцию линий на следующий клон №2. Если реакция линий А, Б, В, Г, Д на него полностью совпадает с реакцией на клон №1, то можно предположить, что эти клоны несут один и тот же ген вирулентности г, а линии - ген устойчивости R1. Если же реакции на заражение у линий не совпадают, то, следовательно, предположим, что это ген R2 - ген устойчивости к клону №2 и т.д., перебирая все возможные комбинации.
Следуя такому принципу можно сказать, что на момент предварительного анализа число генов устойчивости соответствовало числу клонов ржавчины, то есть к каждому клону, предположительно, существует свой ген устойчивости.
